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布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达

         
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为研究布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB的作用,以布鲁氏菌S2308基因组为模板,根据GenBank登录的BspA和BspB基因序列设计引物,利用PCR扩增BspA和BspB基因片段,并将其克隆至pEGFP-N1载体,获得真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB。真核表达载体经酶切和测序分析鉴定后,利用Lipofectamine2000脂质体转染至胚胎滋养层细胞(HPT-8),采用Western blot(WB)检测BspA和BspB蛋白的表达,应用ELISA试剂盒检测细胞因子的分泌水平,利用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性水平。结果显示,BspA基因大小为576 bp,BspB基因大小为564 bp,真核表达质粒经限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ酶切验证正确,酶切产物经测序分析,显示与GenBank公布序列的同源性为100%;WB检测结果显示,pEGFP-BspA和pEGFP-BspB转染组分别在70 ku和68 ku处出现条带,与预期结果相符,表明BspA和BspB蛋白能在HPT-8细胞中表达;细胞因子检测结果显示,BspA和BspB蛋白可诱导HPT-8细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5;细胞毒性检测结果显示,BspA和BspB蛋白对细胞无毒性。综上,成功构建了真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB,证实其能在HPT-8细胞中表达,并能诱导细胞因子分泌。

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