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靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

         
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目的构建靶向β-连环蛋白（β-catenin）基因的shRNA的真核表达质粒，并筛选出沉默β-catenin基因效果最明显的shRNA表达质粒。方法设计3对针对β-catenin基因不同位点的shRNA片段，构建携带此shRNA片段的真核表达质粒（shRNA1—3）并行测序分析，电穿孔转染神经干细胞（neural stem cells NSCs），测定转染率，并分别采用RT—PCR及Western印迹检测β-catenin mRNA和蛋白表达情况，免疫组化方法检测shRNA对神经干细胞分化的影响。结果构建靶向β-catenin基因的shRNA真核表达重组质粒shRNA1，2，3。经筛选，NSCs转染shRNA3后，B—catenin RNA水平和蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组（0．08±0．00 vs 0．75±0．01，0．74±0．02；0．12±0．10，vs 0．56±0．02，0．65±0．01，P均〈0．01；与空白组和阴性对照组相比，shRNA3组NSCs分化为GFAP阳性细胞的百分率明显增加，分化为NSE阳性细胞的百分率明显减少（P〈0．05）。结论β—catenin RNA3对神经干细胞的β—catenin表达具有明显抑制作用，可影响细胞的分化。为研究wnt／β-catenin信号途径在NSCs生长分化中的作用奠定基础。

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