逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

熊建军; 李雪芹; 龚帧

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逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

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目的构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果。方法PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游。扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点。合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间。重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒。病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况。结果质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒。经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调。结论成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默。

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来源
《南昌大学学报：医学版》 |2009年第2期|22-25|共4页
作者
熊建军; 李雪芹; 龚帧;
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作者单位

九江学院基础医学院药理教研室;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类基因载体;
关键词
逆转录病毒; RNA干扰; P53;

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