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PCR-核酸试纸条快速鉴定皮氏罗尔斯顿菌

         
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目的基于PCR-核酸试纸条技术,建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA,以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物,经克隆转入大肠杆菌感受态细胞DH5α,鉴定PCR产物;分别在引物的5’端标记FITC与Biotin;组装核酸试纸条,建立PCR-核酸试纸条的方法;优化反应体系中胶体金标记的链霉亲和素与抗体浓度的最佳工作量;并对试纸条进行反应原理验证及灵敏度、特异性、稳定性评价;对某生物科技有限公司制药用水检测出的7株皮氏罗尔斯顿菌进行实验并利用MEGA构建进化树,对污染溯源进行分析。结果煮沸法提取基因组浓度较好,纯度1.8~2.0;PCR产物经克隆转化、测序比对,与GenBank已登记的皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA相似度为100%;利用胶体金放大原理,每100μL胶体金溶液中,加入3.5μL链霉亲和素进行标记,硝酸纤维素膜上检测线为2.0 mg/mL抗FITC抗体,质控线为1.2 mg/mL生物素化BSA,与阳性扩增产物结合产生红色条带;按照优化条件进行试纸条组装,每100μL样品展开液中加入8μL PCR产物,反应5 min后观察结果;核酸试纸条特异性结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致,仅有皮氏罗尔斯顿菌为阳性结果,不动杆菌、气单胞菌、假单胞菌、非脱羧勒克氏菌均为阴性结果;核酸试纸条灵敏度评价,将DNA浓度降至10-5ng/μL时,试纸条检测线仍有条带,较琼脂糖凝胶电泳结果灵敏度高1000倍;核酸试纸条稳定性评价,将试纸条在3、6、9、12月进行检测,稳定性较好。结论建立PCR-核酸试纸条技术检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌,具有简单快速、特异性强、灵敏度高、成本较低等优点,适用于制药企业对制药用水的日常检测。

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