囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制

史慧君; 袁圆圆; 郭妍婷; 陈俊贞; 杨莉; 冉多良; 付强

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囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制

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[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV 5’-非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA水平和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPAKO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性。[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPAKO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPAKO细胞后5’-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响。[结论]VAPAKO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。

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来源
《微生物学通报》 |2022年第2期|635-644|共10页
作者
史慧君; 袁圆圆; 郭妍婷; 陈俊贞; 杨莉; 冉多良; 付强;
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作者单位

新疆农业大学动物医学学院;

新疆乌鲁木齐830052;

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正文语种 chi
中图分类 S852.653;
关键词
囊泡相关膜蛋白A; 牛病毒性腹泻病毒; 复制水平; 双链RNA; 病毒滴度;

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