基于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测兰花环斑病毒方法的建立

孙爱青; 王丽花; 杨秀梅; 许凤; 张艺萍; 苏艳

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基于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测兰花环斑病毒方法的建立

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【背景】兰花环斑病毒(cymbidium ringspot virus,CymRSV)是一类重要的检疫性病毒,在世界范围内危害严重。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析CymRSV携带情况的高效检测方法。【方法】通过比对5个CymRSV CP基因序列,利用高度保守区设计3对引物探针并优化筛选后,获得145 bp的靶标序列及对应的最优引物及探针组合。以该靶标序列为模板构建阳性重组质粒,建立标准曲线,并探究其灵敏度、特异性、稳定性和应用效果。【结果】建立的CymRSV实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测法对阳性质粒标准品的最低检出限可达1 copy,最低稳定检出限达5 copies/μL,是逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏度的103-104倍;标准曲线y=-3.332x+40.371显示,Ct值与拷贝数的对数线性关系良好,扩增效率为99.6%,相关系数R2为0.999;与其他5种常见病毒反应均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数均小于0.6%,重复性和稳定性较好。利用该方法对4类不同种属的20个兰花样品进行检测,阳性对照在Ct为23.31出现扩增曲线,阴性对照及样品未出现扩增曲线。【结论】基于Taq Man探针的CymRSV实时荧光定量PCR检测方法的成功创建,可为开展兰花CymRSV病毒的精准检测与科学防控提供技术支撑。

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来源
《微生物学通报》 |2023年第10期|4510-4521|共12页
作者
孙爱青; 王丽花; 杨秀梅; 许凤; 张艺萍; 苏艳;
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作者单位

云南省农业科学院花卉研究所;

云南省花卉育种重点实验室;

国家观赏园艺工程技术研究中心;

云南昆明650205;

云南大学资源植物研究院农学院;

云南昆明650091;

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正文语种 chi
中图分类 S432.41;
关键词
兰花环斑病毒; TaqMan探针; 实时荧光定量PCR; 兰花;

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