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青枯菌铜抗性基因copA的功能

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摘要

【目的】植物细菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界性重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。青枯菌Po82菌株大质粒上携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copA的同源物,论文旨在探明青枯菌Po82菌株copA在铜抗性、致病性等方面的生物学功能。【方法】以青枯菌Po82菌株为研究对象,利用MEGA6.0软件包,基于邻接法构建copA的系统发育树,探究铜抗性基因copA在青枯菌和其他植物病原细菌中的系统进化关系。通过反向遗传学的研究手段,采用基因同源重组双交换和电击转化法,构建copA基因缺失菌株及相应互补菌株。通过最小抑制浓度(minimal inhibition concentration,MIC)测定、RT-qPCR、Biolog代谢芯片以及致病力等基础生物学测定研究手段,解析copA与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病性和运动性等表型生物学特征之间的关系。【结果】同源性比对分析结果显示,copA广泛存在于青枯菌群体中,青枯菌copA在亲缘关系上与耐金属贪铜菌最为紧密,与稻黄单胞菌、丁香假单胞菌和大肠杆菌的亲缘关系较远。RT-qPCR结果显示copA的表达受到铜离子的诱导,copA的表达量随着CuSO4浓度的增加而增加。CuSO4浓度为1.0mmol·L^(-1)时,基因表达量最高。铜MIC测定结果显示copA基因缺失菌株对铜离子的敏感性增加,copA基因缺失菌株的MIC值为0.8 mmol·L^(-1),较野生型菌株的1.2 mmol·L^(-1)下降了33.3%,互补菌株恢复了铜抗性能力,表明copA在青枯菌的铜胁迫应答过程中发挥着重要作用。与野生型菌株相比,copA基因缺失菌株在普通NA培养基及含0.6mmol·L^(-1) CuSO4的NA培养基中的对数生长期的生长速率降低,表明copA与青枯菌的生长速率相关。copA基因缺失菌株于发病前期病情指数较野生型菌株下降,接种第10天,copA基因缺失菌株的病情指数较Po82野生型菌株下降了11.7%。copA的缺失导致青枯菌对α-D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低,使青枯病发病病程延长。与野生型菌株Po82相比,copA基因缺失菌株中III型分泌系统的转录激活因子编码基因hrpG和hrpB,III型效应子RipX编码基因ripX的表达量显著下调。【结论】铜抗性基因copA在青枯菌铜胁迫应答、致病性等方面发挥一定的作用,研究结果可为进一步解析青枯菌的铜抗性分子机制以及铜抗性菌株的防治提供理论依据。

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