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首页> 美国卫生研究院文献>Neuro-Oncology >GENE-10. A SIMPLE AND EFFICIENT METHOD FOR GENERATING MULTI-ALLELIC INSERTION-DELETION MUTATIONS AND PRECISE DELETIONS IN PRIMARY HUMAN CELL CULTURES
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GENE-10. A SIMPLE AND EFFICIENT METHOD FOR GENERATING MULTI-ALLELIC INSERTION-DELETION MUTATIONS AND PRECISE DELETIONS IN PRIMARY HUMAN CELL CULTURES

机译：基因-10。一种简单有效的方法用于产生多等位基因插入缺失突变和在原发性人细胞培养物中的精确缺失

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摘要

CRISPR-Cas9-based technologies have revolutionized experimental manipulation of the human genome by enabling generation of site-specific genetic alterations, such as insertion-deletion (indel) mutations. None-the-less, limitations of the delivery and efficacy of these technologies restrict their application in primary human cells. Here, we present a simple and effective method for fast and penetrant induction of multi-allelic indels and near-precise deletions (ranging from ~50bp to >50kbp) in primary human neural stem/progenitor cell (NPC) and brain tumor-derived stem-like cell cultures using the CRISPR-Cas9 system. We report that mono-, bi-, or multi-allelic (depending on ploidy) indel efficiencies of >90% can be routinely achieved within 3 days, without the need for pre-engineering cells to express Cas9 or isolating clones. As a result, this method enables the quick generation of a series of knockouts at different genomic loci, which we illustrate by successively targeting TP53, CDKN2A, PTEN, and NF1 in human NPC populations, where ³95% loss of protein expression is observed. RNA-seq analysis of these NPC knockout pools confirmed gene expression changes including p53 transcriptional and Rb-axis targets, as well as NF1-dependent repression of major histocompatibility complex class II gene expression. Given its simplicity, this method is readily adaptable to other primary mammalian cell types.
机译：基于CASP-CAS9的技术通过能够通过能够产生现场特异性遗传改变而改变了人类基因组的实验性操纵，例如插入缺失（Indel）突变。无少，这些技术的交付和疗效的限制限制了它们在原发性人体细胞中的应用。在这里，我们介绍了一种简单且有效的方法，用于在一次人神经茎/祖细胞（NPC）和脑肿瘤衍生的茎中的多等位基因诱导和近乎精确缺失（从〜50bp到> 50kbp）的快速和渗透诱导 - 使用CRISPR-CAS9系统的细胞培养物。我们报告称，单通道，双或多等位基因（取决于倍性倍增物）indel效率> 90％的诱导效率可以在3天内进行常规实现，而无需预先进行Cas9或隔离克隆的工程细胞。结果，该方法能够快速生成不同基因组基因座的一系列敲除，我们通过在人NPC群体中连续地靶向TP53，CDKN2A，PTEN和NF1来说明，其中观察到³95％的蛋白质表达损失。这些NPC敲除池的RNA-SEQ分析确认了基因表达的变化，包括P53转录和RB轴靶标，以及对主要组织相容性复合体II基因表达的NF1依赖性抑制。鉴于其简单性，该方法容易适应其他原发性哺乳动物细胞类型。

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