Decondensation of Xenopus sperm chromatin using Saccharomyces cerevisiae whole-cell extracts

Harkness Troy A.A.

摘要

Biochemical studies using highly condensed Xenopus sperm chromatin and protein extracts prepared from multiple systems have lead to the identification of conserved proteins involved in chromosome decondensation. However, mutations to these proteins are unavailable as the systems used are not amenable to genetic studies. We took a genetic approach to isolating chromosome decondensation mutants by incubating Xenopus sperm chromatin with whole-cell extracts prepared from the Hartwell library of random temperature sensitive (ts) yeast cells. We show that decondensation of Xenopus sperm chromatin using wild type yeast extracts was rapid, ATP- and extract-dependent, and resistant to heat, N-ethylmaleimide, protease K, RNase A, and micrococcal nuclease. From 100 mutant extracts screened, we obtained one strain, referred to as rmc4, that was chromosome decondensation defective. The mutant was slow growing and exhibited germination defects. Low concentrations of rmc4 extract would eventually decondense sperm heads, and fractionation of the mutant extract produced a decondensation competent fraction, suggesting the presence of an overactive inhibitor in rmc4 cells. We performed a multicopy suppressor screen that identified PDE2, a gene encoding a protein that inhibits protein kinase A (PKA) activity. As PKA was previously shown in human cells to maintain condensed chromatin, our results suggest that PKA activity is elevated in rmc4 cells, causing a decondensation defect. Thus, our experiments reveal that yeast encodes an evolutionarily conserved chromosome decondensation activity that can be genetically manipulated.Les études biochimiques utilisant la chromatine hautement condensée des spermatozoïdes de Xenopus ainsi que des extraits de protéines préparées de multiples systèmes ont mené à l'identification de protéines conservées participant à la décondensation des chromosomes. Toutefois, des mutations de ces protéines ne sont pas disponibles étant donné que les systèmes utilisés ne sont pas accessibles aux études génétiques. Nous avons utilisé une approche génétique afin d'isoler des mutants pour la décondensation des chromosomes, en incubant la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus avec des extraits de cellules entières préparées à partir de cellules de levure thermosensibles (ts) de la banque de Hartwell. Nous montrons que la décondensation de la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus à partir d'extraits de levure de type sauvage est rapide, dépendante de l'extrait et de l'ATP, et résistante à la chaleur, au N-ethylmaleimide (NEM), à la protéase K, à la RNase A et à la nucléase micrococcale. Parmi les 100 extraits de mutants criblés, nous avons obtenu une souche, nommée rmc4, défective au niveau de la décondensation des chromosomes. Le mutant a eu une croissance lente et a montré des défauts de germination. De faibles concentrations de l'extrait de rmc4 ont finalement décondensé les têtes des spermatozoïdes, et le fractionnement de l'extrait de mutants a produit une fraction compétente de décondensation, ce qui laisse supposer la présence d'un inhibiteur surréactif dans les cellules rmc4. Le criblage de suppresseurs multicopies a identifié PDE2, un gène codant pour une protéine qui inhibe l'activité de la protéine kinase A (PKA). Des travaux ayant déjà montré que la PKA maintient la chromatine condensée dans les cellules humaines, nos résultats donnent à penser que l'activité de la PKA est élevée dans les cellules rmc4, ce qui cause un défaut de décondensation. Ainsi, nos expériences révèlent que la levure encode une activité évolutive de décondensation des chromosomes conservés qui peut être manipulée génétiquement.

机译：使用高度浓缩的非洲爪蟾精子染色质和从多个系统制备的蛋白质提取物进行的生化研究已导致鉴定涉及染色体解聚的保守蛋白质。但是，由于所用系统不适用于遗传研究，因此无法获得这些蛋白质的突变。通过将非洲爪蟾精子染色质与从随机温度敏感（ts）酵母细胞的Hartwell库制备的全细胞提取物一起孵育，我们采取了一种遗传方法来分离染色体解聚突变体。我们显示使用野生型酵母提取物对非洲爪蟾精子染色质的快速缩合，ATP和提取物依赖性，并且对热，N-乙基马来酰亚胺，蛋白酶K，RNase A和微球菌核酸酶具有抗性。从筛选的100个突变体提取物中，我们获得了一种称为rmc4的菌株，该菌株存在染色体解聚缺陷。该突变体生长缓慢并且表现出萌发缺陷。低浓度的rmc4提取物最终将使精子头部凝聚，而突变提取物的分级分离产生了具有解凝聚能力的馏分，表明rmc4细胞中存在过度活跃的抑制剂。我们进行了多拷贝抑制剂筛选，鉴定了PDE2，PDE2是一种编码抑制蛋白激酶A（PKA）活性的蛋白的基因。由于先前在人细胞中显示PKA可以维持浓缩的染色质，因此我们的结果表明rmc4细胞中PKA活性升高，从而导致去缩缺陷。因此，我们的实验揭示了酵母编码了一种可以通过基因操作进行进化上保守的染色体解聚活性的方法。利用生物化学方法从X染色体上的高级染色质浓缩到Xenopus ainsi上的蛋白原的多重性。保护参与者染色体的缩聚。图特菲伊斯语，英语，法语，法语和英语的其他目的是因为不适合任何人使用。可以从染色体上分离出的突变体中分离得到的突变体，在Xenopus的细胞中可以培养出精子，而在Xenopus的细胞中则可以吸收到整个细胞中的部分热量。非洲野生型中的色氨酸精子的快速浓缩法，快速反应型的快速反应，ATP的dépendante等，以及法国的ésistanteàla chaleur等（N-乙基马来酰亚胺）蛋白质K，核糖核酸酶A和核酸微球菌。有100个突变突变体，有明显的突变体，有rmc4命名，有缺陷的去缩合染色体。突变的欧洲新月形面包和萌发的蒙特雷。消除精子浓缩物的最佳条件浓度，以及突变体的精馏物和精馏物的部分精馏物的表面活性剂的绝对含量，抑制了表面活性剂的产生。犯罪抑制者可同时复制鉴定出的PDE2，蛋白和蛋白激酶A（PKA）。蒙特卡洛PKA的维护保养铬浓缩纤维素池的维护，PKA激活与否丹参电池的回收率不超过4卢比。 Ainsi，没有经验丰富的经验编码，可以保护染色体的保守性和活力。

Decondensation of Xenopus sperm chromatin using Saccharomyces cerevisiae whole-cell extracts

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