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首页> 外文期刊>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America >A promoter-hijack strategy for conditional shutdown of multiply spliced essential cell cycle genes
【24h】

A promoter-hijack strategy for conditional shutdown of multiply spliced essential cell cycle genes

机译：一种启动子劫持策略，用于条件关闭多个剪接的必需细胞周期基因

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We describe a method for the isolation of conditional knockouts of essential multiply spliced genes in which the entire body of the gene downstream of the ATG start codon is left untouched but can be switched off rapidly and completely by adding tetracycline to the culture medium. The approach centers on a "promoter-hijack" strategy in which the gene's promoter is replaced with a minimal promoter responsive to the tetracycline-repressible transactivator (tTA). Elsewhere in the genome, a cloned fragment of the gene's promoter is used to drive expression of a tTA. Thus, the gene is essentially regulated by its own promoter but through the intermediary tTA. Using this strategy, we generated a conditional knockout of chromo-kinesin KIF4A, an important mitotic effector protein whose mRNA is multiply spliced and whose cDNA is highly toxic when overexpressed in cells. We used chicken DT40 cells, but the same strategy should be applicable to ES cells and, eventually, to mice.
机译：我们描述了一种方法，用于分离必需的多重剪接基因的条件敲除方法，在该方法中，ATG起始密码子下游基因的整个主体保持不变，但可以通过向培养基中添加四环素来快速完全关闭。该方法以“启动子劫持”策略为中心，其中将基因的启动子替换为对四环素可抑制反式激活因子（tTA）响应的最小启动子。在基因组的其他地方，该基因启动子的克隆片段用于驱动tTA的表达。因此，该基因基本上由其自身的启动子调控，但受中介tTA调控。使用此策略，我们产生了有条件的染色体驱动蛋白KIF4A基因敲除，KIF4A是一种重要的有丝分裂效应蛋白，其mRNA被多重剪接，并且在细胞中过表达时其cDNA具有高毒性。我们使用了鸡的DT40细胞，但相同的策略应适用于ES细胞，最终适用于小鼠。

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