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首页> 外文期刊>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America >Catalytic and structural role of the metal ion in dUTP pyrophosphatase
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Catalytic and structural role of the metal ion in dUTP pyrophosphatase

机译：金属离子在dUTP焦磷酸酶中的催化和结构作用

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The metal ion dependence of the catalytic activity of recombinant Escherichia coli dUTP pyrophosphatase (dUTPase), an essential enzyme preventing incorporation of uracil into DNA, has been investigated by steady-state kinetic, electron paramagnetic resonance, and electron nuclear double resonance methods. Values of K_(cat) and K_(cat)/K_m were 4.5 +- 0.1 s~(-1) and 0.49 +- 0.1 x 10~6 M~(-1)·s~(-1) in the absence of divalent metal ions, 14.7 +- 2.2 s(-1) and 25.1 +-7.4 x 10~6 M~(-1)·s~(-1) in the presence of Mg~(2+) or Mn~(2+), and 24.2 6 +- 3.6 s~(-1) and 2.4 +- 0.7 x 10~6 M~(-1)·s~(-1) when supported by VO~(2+) or bis(acetylacetonato)oxovanadium(IV). Binding of VO~(2+) to the enzyme in the presence of dUDP, a nonhydrolyzable substrate analog, was specific and competitive with Mg~(2+). Electron paramagnetic resonance spectra of the ternary enzyme―VO~(2+)-chelate-dUDP complex revealed a pattern of ~(31)P superhyperfine coupling specifying two structurally equivalent phosphate groups equato-rially coordinated to the VO~(2+) ion. Proton electron nuclear double resonance spectra revealed an equatorial acetylacetonate ligand, indicating that one of the organic ligands had been displaced. By molecular graphics modeling, we show that the diphosphate group of enzyme-bound dUDP is sterically accessible to a hemi-chelate form of VO~(2+). We propose a similar location compatible with all kinetic and spectroscopic results to account for the reactivity of VO~(2+) and the VO~(2+)-chelate in dUTP hydrolysis. In this location the metal ion could promote an ordered conformation of the C-terminal fragment that is obligatory for catalysis but dynamically flexible in the free enzyme.
机译：已通过稳态动力学，电子顺磁共振和电子核双共振方法研究了重组大肠杆菌dUTP焦磷酸酶（dUTPase）的催化活性对金属离子的依赖性，dUTP焦磷酸酶是防止尿嘧啶掺入DNA的必需酶。 K_（cat）和K_（cat）/ K_m的值分别为4.5±0.1 s〜（-1）和0.49±0.1 x 10〜6 M〜（-1）·s〜（-1） Mg〜（2+）或Mn〜（2）存在下的二价金属离子14.7 +-2.2 s（-1）和25.1 + -7.4 x 10〜6 M〜（-1）·s〜（-1） +）和24.2 6 +-3.6 s〜（-1）和2.4 +-0.7 x 10〜6 M〜（-1）·s〜（-1）在VO〜（2+）或双（乙酰丙酮）的支持下氧钒（IV）。在dUDP（一种不可水解的底物类似物）的存在下，VO〜（2+）与酶的结合是特异性的，并且与Mg〜（2+）具有竞争性。三元酶VO〜（2 +）-螯合物-dUDP络合物的电子顺磁共振谱显示〜（31）P超超精细偶联的模式，指定了两个等价配位至VO〜（2+）离子的结构上等效的磷酸基团。质子电子核双共振光谱显示出赤道的乙酰丙酮配体，表明其中一种有机配体已被取代。通过分子图形建模，我们表明酶结合的dUDP的二磷酸基团在空间上可接近VO〜（2+）的半螯合物形式。我们提出了一个与所有动力学和光谱结果兼容的相似位置，以说明dUTP水解中VO〜（2+）和VO〜（2 +）-螯合物的反应性。在该位置，金属离子可促进C末端片段的有序构象，该构象对于催化是必不可少的，但在游离酶中具有动态柔性。

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