首页>
外文期刊>Молекулярная биология
>КОНСТРУИРОВАНИЕ Т-ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПРЯМОГО КЛОНИРОВАНИЯ В ОДНОМ НАПРАВЛЕНИИ И АНАЛИЗА ПРОМОТОРОВ, АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ С ПОМОЩЬЮ ПЦР
【24h】
КОНСТРУИРОВАНИЕ Т-ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПРЯМОГО КЛОНИРОВАНИЯ В ОДНОМ НАПРАВЛЕНИИ И АНАЛИЗА ПРОМОТОРОВ, АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ С ПОМОЩЬЮ ПЦР
При исследовании механизмов регуляции генов часто используют подход, основанный на амплификации и клонировании промоторов. Нами разработан метод получения так называемых Т-векторов для прямого клонирования в одном направлении и анализа промоторов. Т-векторы pEGFP-T и pGL3-T сконструированы на основе не имеющих промотора векторов pEGFP и pGL3 соответственно. Для конструирования Т-вектора в сайт узнавания рестриктазы Ahdl, который находится в гене Атрг вектора pGL3-basic, внесена "молчащая" мутация путем ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов. Затем в исходных векторах клонировали Ahdl-кассету особой структуры. В стратегии изготовления Т-векторов предусмотрены этапы минимизации выхода нерекомбинантных трансформантов и удаления конструкций с продуктами ПЦР, встроенными в обратной ориентации. Эффективность клонирования составляет около 85% при использовании каждого из полученных Т-векторов, что определяли при тестировании продукта, амплифицированного на матрицепоследовательности с известной способностью инициировать транскрипцию. Кроме того, более 90% конструкций содержали вставку в нужной ориентации. Функциональность Т-векторов показана в опытах по временной трансфекции клеток. Таким образом, предложен простой метод изготовления Т-векторов для исследования промоторов.
展开▼
