大豆光合作用相关基因GmGRF5-1及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆光合作用相关基因、其编码的蛋白及其在植物开花时间及光合作用调控中的应用。

背景技术

大豆是我国五大农作物之一，但近十年来大豆的净进口量已显著超过国内大豆的生产量，且年进口量呈快速增长趋势，我国的大豆生产安全面临严峻的挑战。另一方面，从全球看，世界人口的增长导致到了2050年大豆产量必须翻倍才能满足总体需求，但是按照现阶段产量增加的幅度，到那时仅能达到一半的需求(Tilman D等，2011；Ray等，2013)。通过扩大种植面积提高产量既不现实也不可能，因为生态安全和土地沙漠化等因素迫使退耕还林已是大势所趋。因此提高大豆单产是必经之路，对我国大豆的安全生产具有重要的战略意义。

作物高产途径不外乎培育高产品种、施加有机肥和增产剂以及改善栽培耕作方式等。培育高产品种的手段有传统的杂交育种和现代的分子育种(包括转基因育种)。转基因育种是在对目标基因的功能及作用机制有较明确认识的前提下进行的，因而周期较短、增产效率较高。在大豆中也有很多通过转基因提高大豆产量和抗性的报道。如过表达Ncl基因(Na+、K+和Cl-转运蛋白)的大豆具有较高的耐盐性，在高盐地区的产量比野生型提高3.6～5.5倍(Do等，2016)；LOS5/ABA3(脱落酸醛脱氢氧化酶活性相关基因)转基因大豆在干旱条件下气孔开放大小及蒸腾速率降低，抗旱性明显增强，在干旱条件下的产量比野生型约提高21％(Li等，2013)；在美国和阿根廷等国家的实验表明，在大豆中过表达向日葵Hahb-4(乙烯信号转导途径基因)，能延缓大豆衰老，在干旱等逆境下产量提高7-15％(Waltz等，2013)；孟山都公司报道，在大豆中过表达拟南芥的BBX32开花基因，产量增加5-7％(Preuss等，2012)；过表达蓝细菌FBP/SBPase(Bifunctional fructose-1，6/sedoheptulose-1，7-bisphosphatase)基因的大豆，在高CO2浓度、高温等逆境(即：未来潜在的环境条件)下保持稳产(Kohler等，2016)；下调大豆BS1(Big Seed 1)同源基因的表达，显著增加大豆种子大小，干重增加45％以上(Ge等，2016)。APETALA2-like基因GmTOE4a的过表达转基因大豆具有株高及节间缩短、茎杆粗壮等高产潜质的农艺性状(Zhao等，2016)。

生长调节因子(GROWTH-REGULATING FACTOR，GRF)对植物的生长发育具有重要的调控作用。目前对GRF的功能研究主要集中在拟南芥、水稻和玉米等植物中，大豆中关于该家族基因的功能研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供大豆光合作用相关基因GmGRF5-1、其编码的蛋白及其在植物开花时间、光合作用及单株产量调控中的应用。

本发明提供的大豆GmGRF5-1蛋白，其氨基酸序列含有：1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质的氨基酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的大豆GmGRF5-1蛋白还包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有大豆GmGRF5-1蛋白同等活性的由大豆GmGRF5-1蛋白衍生得到的蛋白质。

本发明的另一目的是提供编码上述的大豆GmGRF5-1蛋白的GmGRF5-1基因。

GmGRF5-1(全称为GROWTH-REGULATING FACTOR)基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有95％及以上同源性的核苷酸序列。本发明的大豆GmGRF5-1基因是从大豆天隆1号中通过RT-PCR克隆到的。

本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的另一个目的是提供携带GmGRF5-1基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞或宿主菌。

本发明的所述的植物表达载体为pSoy1。

本发明将GmGRF5-1基因构建到表达载体pSoy1上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将pSoy1携带的GmGRF5-1基因转入大豆天隆1号中，获得过表达GmGRF5-1的转基因大豆。结果表明，GmGRF5-1具有提高植物光合作用、提高植物产量及延迟植物开花的功能。

本发明还提供含有GmGRF5-1核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明的另一个目的是提供GmGRF5-1基因及其编码蛋白GmGRF5-1在植物开花时间及光合作用调控中的应用。

本发明提供了大豆GmGRF5-1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在延迟植物开花时间中的应用。

本发明提供了大豆GmGRF5-1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在调节植物光合作用和/或提高植物产量中的应用。

本发明提供了大豆GmGRF5-1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良或杂交育种中的应用。利用GmGRF5-1蛋白能够延迟植物开花的功能能够解决杂交育种中的花期不遇的问题。

本发明提供了大豆GmGRF5-1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

所述转基因植物为相对于野生型植物开花时间延迟、叶绿素含量增加、叶黄素含量增加、光合作用速率提高和/或产量提高的转基因植物。所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b。

本发明还提供了一种制备开花时间延迟、叶绿素含量增加、叶黄素含量增加、光合作用速率提高和/或产量提高的转基因植物的方法，是在植物基因组中引入或过表达本发明所述的大豆GmGRF5-1基因。

本发明的有益效果在于：

(1)提供了大豆GmGRF5-1基因及其编码蛋白GmGRF5-1；

(2)通过在植物中过表达GmGRF5-1基因延迟植物开花，促进光合作用(光合作用速率增加，叶绿素和叶黄素含量增加)，提高植物产量。

因此，GmGRF5-1基因及其编码的蛋白可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，促进植物光合作用，提高产量。

附图说明

图1为本发明大豆光合作用相关基因GmGRF5-1编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥GRF5基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。

图2为本发明实施例2的克隆中间载体pGWCm的结构示意图。

图3为本发明实施例3的植物表达载体pSoy1的结构示意图。

图4为本发明大豆光合作用相关基因GmGRF5-1编码的蛋白在烟草中的亚细胞定位。从左到右图示依次为GmGRF5-1-GFP在细胞核中的定位；细胞核marker基因AHL22-RFP的定位；叶绿体；明场；前四个图像的叠加图。

图5显示大豆光合作用相关基因GmGRF5-1转化大豆，导致延迟开花，左图为野生型(已结荚)和GmGRF5-1转基因大豆(开花期)植株照片，右图为植株开花时间统计结果。

图6显示大豆光合作用相关基因GmGRF5-1转化大豆，导致大豆叶色加深(A)，叶绿素含量增加(B)及叶绿体基质片层发达(C)。

图7显示大豆光合作用相关基因GmGRF5-1转化大豆，导致大豆光合速率加快(A)，单株产量提高(B)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1大豆光合作用相关基因GmGRF5-1的克隆

分别利用正向引物5’-ATGATGAGTGCAAGTGCAAGAA-3’和反向引物5’-TCATTCATCGGTTTGGATTCTG-3’从大豆天隆1号(Glyc ine max L.Tianlong 1)中克隆并测序获得GmGRF5-1基因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

PCR反应程序为:95℃5min预变性，94℃30s，55℃35s，72℃1min30s，25个循环，72℃10min延伸。

大豆光合作用相关基因GmGRF5-1的蛋白序列与拟南芥GRF5蛋白的氨基酸序列之间的相似性为42％。氨基酸序列比较见图1。

实施例2大豆光合作用相关基因GmGRF5-1的克隆载体

从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图2所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。

实施例3大豆光合作用相关基因GmGRF5-1的植物表达载体

将从实施例2中得到的大豆开花基因GmGRF5-1的克隆载体与如图3所示的植物表达载体pSoy1等比例混合后通过LR反应(质粒各50ng，LR酶1μl，补H₂O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmGRF5-1构建在pSoy1上，用于在植物中过表达大豆光合作用相关基因GmGRF5-1，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。

实施例4大豆光合作用相关基因GmGRF5-1编码蛋白在转基因植物中的定位

挑取-80℃保存的含有目标载体GmGRF5-1-GFP的农杆菌于3mL含有相应抗性的液体LB培养基，28℃、200rpm震荡培养过夜；

(1)用移液器吸取200μL菌液接种到50mL含有相应抗性的液体LB培养基，28℃、200rpm震荡培养过夜，此时菌液OD600值约为1；

(2)将菌液分装于灭菌的50mL离心管，室温4000rpm离心10min，弃上清；

(3)用注射buffer(10mM MES；150μM AS；100mM MgCl2)重悬菌体使最终菌液的OD600值约为1；

(4)用1mL的注射器吸取部分菌液，在烟草的背面进行注射。注射完成后用黑色塑料袋将烟草罩上，第二天揭去塑料袋移至光下再培养两天后，用激光共聚焦显微镜ZeissLSM700观察YFP荧光信号。结果显示GmGRF5-1定位于细胞核，见图4。

实施例5大豆光合作用相关基因GmGRF5-1延迟大豆开花

参照王侃等人(Paz，M.，Wang，K.Soybean transformation and regenerationusing half-seed explants.US Patent#7，473，822(Issued January 6，2009))的大豆转化方法获得过表达转基因大豆OX-GmGRF5-1共两个转基因株系(#2和#3)，对野生型天隆1号及两个株系分别统计了10-15株植株的开花时间。图5显示大豆光合作用相关基因GmGRF5-1转化大豆会导致大豆延迟开花。如图5所示，其中最左侧代表对照野生型天隆1号，右侧两株代表转基因大豆的两个株系。开花时间统计结果显示，野生型天隆1号从播种到首花平均天数为26天左右，两个转基因大豆株系从播种到首花平均天数为36天，过表达GmGRF5-1导致花期约延迟约10天。转基因大豆与野生型大豆的花期差异显著。

实施例6大豆光合作用相关基因GmGRF5-1引起大豆叶色及叶绿体结构的改变

过表达转基因大豆OX-GmGRF5-1的两个独立的转基因株系均表现出叶色加深的表型，因此对其叶绿素含量进行了测定，并制作了超薄切片对其叶绿体结构进行了观察。叶绿素含量测定方法如下：

以自然光温室盆栽的OX-GmGRF5-1(#2和#3)和天隆1号完全展开的第三个和第七个复叶的中间小叶为样品，#2、#3和天隆1号各采集5株植株，在相应的叶片上用打孔器(d＝6mm)取4个圆孔，获得的20个叶片圆孔组成一份测量样品。样品放在25mL 80％的丙酮中，黑暗条件下室温萃取5天。取1mL上清液用紫外分光光度计测量液体在663和645nm下的吸光度，并根据下面的公式计算出叶绿素的含量：

叶绿素a(Chl a)＝(11.24A662-2.04A645)×V/W

叶绿素b(Chl b)＝(20.13A645-4.19A662)×V/W

叶黄素(Car)＝((1000A470-1.90Chl a-63.14Chl b)/214)×V/W

公式中的V是指丙酮溶液的体积；W是指样品的鲜重。检测结果见表1，表中数据为OX-GmGRF5-1(#2和#3)和天隆1号各10个叶片的平均数据，且两个株系的转基因大豆中各10个叶片的叶绿素、叶黄素数据差异不显著，野生型大豆(天隆1号)10个叶片的上述数据差异不显著。由表1的平均数据来看，过表达转基因大豆OX-GmGRF5-1的两个独立的转基因株系的叶绿素a的含量比野生型有显著提高、叶绿素b和叶黄素略有升高，但不显著。

表1

结合上述检测结果及超薄切片观察，如图6所示，转基因大豆叶色加深(A)，叶绿素a含量增加(B)，及叶绿体的基质片层结构更发达(C)。

实施例7大豆光合作用相关基因GmGRF5-1引起大豆光合速率改变从而提高产量

选取转基因大豆及野生型天隆1号各10株，利用LI-6400XT光合作用测量系统对转基因大豆光合速率进行测定，测定方法参照该系统使用手册，每片叶子重复测量三次，测定结果见表2。表2中数据为OX-GmGRF5-1(#2和#3)和天隆1号(WT)各10株光合速率的平均数据，且两个株系的转基因大豆中各10株之间的数据差异不显著，野生型大豆(天隆1号)10株之间的光合作用速率数据差异不显著。由表1的平均数据来看，转基因大豆OX-GmGRF5-1的两个独立的转基因株系的光合速率均比野生型有显著提高。

表2

上述转基因植株和对照材料在人工气候室收获后本发明也对其单株产量进行了称重，测定结果见表3。表3中数据为OX-GmGRF5-1(#2和#3)和天隆1号(WT)各10株单株产量的平均值。两个株系的转基因大豆中各10株之间的单株产量数据差异不显著，野生型大豆(天隆1号)10株之间的单株产量数据差异不显著。但转基因大豆比野生型单株产量显著提高。

表3

如图7所示，过表达GmGRF5-1会提高植物的净光合速率，进而显著提高植物的单株产量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 大豆光合作用相关基因GmGRF5-1及其编码蛋白与应用

<130> KHP181117786.0

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Ser Ala Ser Ala Arg Asn Arg Ser Pro Phe Thr Gln Thr Gln

1 5 1015

Trp Gln Glu Leu Glu His Gln Ala Leu Val Phe Lys Tyr Met Val Thr

202530

Gly Thr Pro Ile Pro Pro Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Arg Ser Leu

354045

Asp Thr Ser Ile Ser Ser Arg Leu Phe Pro His His Pro Ile Gly Trp

505560

Gly Cys Phe Glu Met Gly Phe Gly Arg Lys Val Asp Pro Glu Pro Gly

65707580

Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ser Lys Glu Ala

859095

Tyr Pro Asp Ser Lys Tyr Cys Glu Arg His Met His Arg Gly Arg Asn

100 105 110

Arg Ser Arg Lys Pro Val Glu Val Ser Ser Ala Ile Ser Thr Ala Thr

115 120 125

Asn Thr Ser Gln Thr Ile Pro Ser Ser Tyr Thr Arg Asn Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Asn Pro Asn Met Thr Pro Pro Ser Ser Phe Pro Phe Ser Pro Leu

145 150 155 160

Pro Ser Ser Met Pro Ile Glu Ser Gln Pro Phe Ser Gln Ser Tyr Gln

165 170 175

Asn Ser Ser Leu Asn Pro Phe Phe Tyr Ser Gln Ser Thr Ser Ser Arg

180 185 190

Pro Pro Asp Ala Asp Phe Pro Pro Gln Asp Ala Thr Thr His Gln Leu

195 200 205

Phe Met Asp Ser Gly Ser Tyr Ser His Asp Glu Lys Asn Tyr Arg His

210 215 220

Val His Gly Ile Arg Glu Asp Val Asp Glu Arg Ala Phe Phe Pro Glu

225 230 235 240

Ala Ser Gly Ser Ala Arg Ser Tyr Thr Glu Ser Tyr Gln Gln Leu Ser

245 250 255

Met Ser Ser Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Ser Asn Phe Gln Asn Ile Asn

260 265 270

Asp Ala Thr Thr Asn Pro Arg Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln His

275 280 285

Cys Phe Val Leu Gly Thr Asp Phe Lys Ser Thr Arg Pro Thr Lys Glu

290 295 300

Lys Glu Ala Glu Thr Ala Thr Gly Gln Arg Pro Leu His Arg Phe Phe

305 310 315 320

Gly Glu Trp Pro Pro Lys Asn Thr Thr Asp Ser Trp Leu Asp Leu Ala

325 330 335

Ser Asn Ser Arg Ile Gln Thr Asp Glu

340 345

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatgagtg caagtgcaag aaataggtct cctttcacgc aaactcagtg gcaagagctt 60

gagcatcaag ctcttgtttt taagtacatg gttacaggaa cacccatccc accagatctc 120

atctactcta ttaaaagaag tctagacact tcaatttctt caaggctctt cccacatcat 180

ccaattgggt ggggatgttt tgaaatggga tttggcagaa aagtagaccc agagccaggg 240

aggtgcagaa gaacagatgg caagaaatgg agatgctcaa aggaggcata tccagactcc 300

aagtactgtg aaagacacat gcacagaggc agaaaccgtt caagaaagcc tgtggaagtt 360

tcttcagcaa taagcaccgc cacaaacacc tcccaaacaa tcccatcttc ttatacccga 420

aacctttcct tgaccaaccc caacatgaca ccaccctctt ccttcccttt ctctcctttg 480

ccctcttcta tgcctattga gtcccaaccc ttttcccaat cctaccaaaa ctcttctctc 540

aatcccttct tctactccca atcaacctcc tctagacccc cagatgctga ttttccaccc 600

caagatgcca ccacccacca gctattcatg gactctgggt cttattcgca tgatgaaaag 660

aattataggc atgttcatgg aataagagaa gatgtggatg agagagcttt cttcccagaa 720

gcatcaggat cagctaggag ctacactgaa tcataccagc aactatcaat gagctcctac 780

aagtcctatt caaactccaa ctttcagaac atcaatgatg ccaccaccaa cccaagacag 840

caagagcagc aacaacaaca acactgcttt gttttgggga cagacttcaa atcaacaaga 900

ccaactaaag agaaagaagc tgagacagct acgggtcaga gaccccttca ccgtttcttt 960

ggggagtggc caccaaagaa cacaacagat tcatggctag atcttgcttc caactccaga 1020

atccaaaccg atgaatga 1038

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatgagtg caagtgcaag aa 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcattcatcg gtttggattc tg 22