一株长枝木霉MD30及其研制的生物有机肥

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株长枝木霉MD30及其研制的生物有机肥。

背景技术

植物根际促生菌(Plant Growth-promoting Rhizobacteria,PGPR)是指存在于植物根际表面及根系周围土壤微环境中，能通过直接或间接的方式显著促进植物生长的微生物(Ahmad et al,2008)。木霉作为PGPR的一种，能有效地促进植物生长，同时有着成本低廉、使用安全、持续效果好、增产稳定、对环境和食品安全等特点。探索木霉对作物产量和生长性状的影响，可为木霉制剂在绿色无公害蔬菜生产上的合理利用提供科学依据，对节约化肥资源、发展有机农业具有重要意义。但市面上常见的木霉菌株普遍对温度比较敏感，不能在高于37℃的温度条件下生长。因此，本发明拟从我国热区土壤中筛选能适应较高土壤温度且能有效促进作物生长的木霉菌株，及其制备的生物有机肥，以期提升木霉在热区的施用效果。

CN107828670A、CN103451112A等多篇专利文献报道了长治木霉的对植物病原菌的生防功效，但尚未见现有技术中公开长治木霉的促生功能。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株适应较高土温且有效促进作物生长的长枝木霉MD30。

本发明的另一目的是提供该真菌的应用。

本发明的又一目的是提供该真菌制备的生物肥料及其应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株用于促进作物生长的促生菌株MD30，分离自海南芒果土壤中，分类命名为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年4月12日，保藏编号为CGMCC No.17467。

菌株MD30在PDA平板上生长较快，绒毛状白色菌丝，大量产生绿色孢子，有白色杂志，形成同心轮纹，产生黄色可扩散性色素。菌株ITS rDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株MD30位于Trichoderma longibrachiatum分支上，结合生理生化试验将MD30鉴定为长枝木霉。

本发明所述长枝木霉MD30在促进植物生长中的应用。

本发明所述长枝木霉MD30在制备促进植物生长的生物肥料中的应用。

由本发明所述长枝木霉MD30制备的生物肥料。

所述的生物肥料优选主要通以下方法制备：将保藏号为CGMCC No.17467的长枝木霉MD30接种到PDA液体培养基中，进行液体发酵，发酵温度为28℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵时间为96h，光照条件下发酵更优，使发酵液中含菌量≥1×10⁶个/mL。每干重100g秸秆和200ml水混合，加入到6.6ml液体氨基酸复合物(ZL201410042218.3)拌匀。115℃灭菌1h。灭菌冷却后，接入20％木霉发酵液，拌匀，均匀铺开在周转箱中，在28℃培养4-5天后，制作成木霉菌种，放于4℃冰箱保存。按加入5％～15％的木霉菌种于有机肥中，制作成为木霉生物有机肥料。所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮20min，经过滤后滤液中加20g普通葡萄糖，定容至1L，pH值自然，115℃灭菌30min。

本发明所述的生物肥料在促进植物生长中的应用。

有益效果：

本发明主要利用分离筛选出根际有效定植的长枝木霉的施用，显著提高作物苗期的生长速度，促进作物对土壤中养分的吸收利用，从而促进作物生长。本发明促生菌MD30在多季盆栽试验中表现出的稳定促生能力。本发明生物肥料应用后促生效果明显，适合蔬菜作物产区大面积使用。

附图说明

图1基于菌株MD30的ITS rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树

图2木霉在不同温度下的生长状况对比图

图3第一季黄瓜盆栽效果图

图4第二季黄瓜盆栽效果图

生物材料保藏信息

菌株MD30，分类命名为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年4月12日，保藏编号为CGMCC No.17467。

具体实施方式

实施例1、功能菌株的分离及鉴定

将5g土样置于盛有45ml无菌水的三角瓶中，28℃振荡30min(170r/min)制成土壤悬液。吸取0.1mL土壤悬液置于木霉选择性平板并涂布，放置于28℃培养箱中培养48h，观察平板上菌落生长情况，挑选差异菌落纯化，将纯化后的菌株接种到PDA培养基上并置于4℃冰箱保存待用。

将选出的木霉菌株接种于PDA培养基上，分别放置于28℃，37℃和40℃培养箱中，培养5d后观察，筛选出能在40℃正常生长的高温木霉。

通过筛选最终获得一株木霉命名为MD30，菌株MD30在PDA平板上生长较快，绒毛状白色菌丝，大量产生绿色孢子，有白色杂志，形成同心轮纹，产生黄色可扩散性色素。菌株ITSrDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株MD30位于Trichoderma longibrachiatum分支上，将MD30归类为Trichoderma longibrachiatum，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17467。

实施例2、不同温度下的生长测定

将菌株MD30(CGMCC No.17467)在不同温度下接种至PDA培养基上，观察其生长状况。设定温度为37℃、40℃和42℃，对照为保藏编号为CGMCC NO.12166的贵州木霉NJAU4742菌株，公开于CN108675895A中。

结果发现在38℃高温条件下，菌株MD30仍能生长,4742菌株则无法正常生长；在40℃高温条件下，菌株MD30仍能生长,4742菌株则无法生长；在42℃高温条件下，菌株MD30和4742菌株均无法生长。

表1、40℃木霉菌丝生长速度

实施例2、功能菌生物肥料的产生

将菌株MD30(CGMCC No.17467)接种至PDA培养液中液体发酵，发酵生产的条件为：发酵温度为28℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵时间为96h，使发酵液中含菌量≥1×10⁶个/mL。每干重100g秸秆和200ml水混合，加入6.6ml液体氨基酸复合物拌匀。115℃灭菌1h。灭菌冷却后，接入20％木霉发酵液，拌匀，均匀铺开在周转箱中，在28℃培养4-5天后，制作成木霉菌种，放于4℃冰箱保存。按加入5％～15％的木霉菌种于有机肥中，制作成为木霉生物有机肥料。

其中所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮20min，经过滤后滤液中加20g普通葡萄糖，定容至1L，pH值自然，115℃灭菌30min。

实施例3、盆栽促生效果试验

3.1促生生物肥在黄瓜(第一季、第二季)上的应用效果

促生盆栽试验在国家有机类肥料工程技术研究中心(宜兴)温网室内进行，供试土壤为不含病原菌的健康沙土，供试黄瓜品种为不含病原菌的露丰黄瓜。将黄瓜种子浸泡在常温水中1h，放置在湿润的纱布上于30℃培养箱中催芽12～24h，待75％以上种子萌发后，选取露白的种子移至育苗盘育苗，待长出2片真叶后挑选长势一致幼苗移栽盆中。试验设置两个处理：1)CK，不施用任何肥料；2)处理OF，施用普通有机肥；3)处理MD30，施用MD30木霉生物有机肥。每个处理6盆，每盆装1.5kg土，OF加入2％的普通有机肥，MD30加入2％的MD30木霉生物有机肥，常规管理，30d左右后测量植株的生理指标。

第一季黄瓜促生效果如图2、生物量情况如表1所示，盆栽培养30d后，施用MD30木霉生物有机肥处理(MD30)、施用有机肥(OF)处理和不施肥(CK)处理在黄瓜植株的株高、地上部鲜重和地上部干重方面均有显著性差异。与CK相比，施用MD30木霉生物有机肥的处理在株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重方面，分别增加了15％、7％、3％、22％和39％。与OF相比，施用MD30木霉生物有机肥的处理在株高、茎粗、地上部鲜重和地上部干重方面，分别增加了4％、4％、14％和20％。

第二季黄瓜促生效果如图3、生物量情况如表2所示，盆栽培养30d后，施用MD30木霉生物有机肥处理(MD30)、施用有机肥(OF)处理和不施肥(CK)处理在黄瓜植株的株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重方面均有显著性差异。与CK相比，施用MD30木霉生物有机肥的处理在株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重方面，分别增加了53％、32％、9％、52％和33％。与OF相比，施用MD30木霉生物有机肥的处理在株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重方面，分别增加了18％、13％、1％、13％和7％。

综上两季盆栽结果表明，与不施肥(CK)处理和有机肥(OF)处理的黄瓜在株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重之间差异明显，说明MD30菌株的促生效果明显。综上两季盆栽结果表明，施用MD30木霉生物有机肥(MD30)处理黄瓜植株长势优于不施肥(CK)处理和普通有机肥(OF)处理，且在株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重方面达到显著性差异，表明MD30菌株具有明显的促生效果。

表2、第一季黄瓜促生盆栽试验生物量情况

表3、第二季黄瓜盆栽促生试验生物量情况