草莓的根尖脱毒与快繁技术

技术领域

本发明属于植物育种领域，具体而言，本发明涉及草莓根尖的脱毒和组培方法以及可用于检测该方法产生的草莓是否侵染病毒的多重RT-PCR同步快速检测方法。

背景技术

我国是世界上草莓野生资源最丰富的国家，很早就开始利用野生草莓，并一直沿袭至今。我国的大果草莓栽培始于1915年，但过去未受到重视，发展缓慢。20世纪80年代以来草莓生产有了迅速的发展，目前草莓生产面积约7万hm²，面积居世界第一位，其中主要产地分布在安徽、辽宁、河北、山东、江苏、上海、浙江、四川、新疆、北京等地区。

由于草莓是草本植物，长期靠匍匐茎繁殖，易形成病毒病、炭疽病、疫病等的严重危害。经初步调查草莓病毒和类病毒的种类繁多，主要有黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus, SMYEV），草莓镶脉病毒（strawberry vein banding virus,SVBV），草莓皱缩病毒（Strawberry crinkle virus,SCV或 SCrV）和草莓斑驳病毒（Strawberry mottle virus,SMoV）的危害。

更为严重的是，许多病毒侵染草莓后的症状（尤其是早期症状）不明显，使得在种植期防治难以得以实施。例如，草莓轻型黄边病毒单独侵染栽培种草莓无明显症状，仅使病株轻微矮化，使草莓长势变弱，产量和果实质量严重下降，减产可高达75%；草莓斑驳病毒单独侵染栽培种草莓时往往不表现明显症状，但病株长势衰退，果实品质下降，可减产20%～30%，与其它病毒复合侵染时才会产生斑驳症状；草莓镶脉病毒单独侵染栽培种草莓时，无明显症状，但引起植株生长衰弱，匍匐茎抽生量减少，产量和品质下降，与斑驳病毒、轻型黄边病毒复合侵染后引起病株叶片皱缩、扭曲，植株极度矮化。只有草莓皱缩病毒的侵染症状较为明显，感病植株表现为：叶片畸形，叶上产生褪绿斑，沿叶脉出现小的、不规则的褪绿斑及坏死斑，叶脉褪绿、透明；幼叶生长不对称，扭曲皱缩，小叶黄化，叶柄缩短，叶小，植株矮化；病毒株草莓匍匐茎抽生量减少，繁殖力下降，果实变小，强毒株单独侵染即可造成减产35%～40%，与其他病毒复合侵染，危害更为严重，草莓产量会大幅度下降，甚至绝产。

为此，人们已经进行了研究，通过草莓的茎尖/匍匐茎/花药脱毒组织培养与快繁技术生产原原种无病毒草莓苗。例如，中国专利申请200510030445公开了一种草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其中基本采用了常规的培养基，并且需要显微镜进行手工剥取茎尖；中国专利200510062199公开了一种草莓脱病毒法，其中采用了常规的培养基，并且需要剥取茎尖，另外需要在高温下进行培养，大大降低了草莓苗的成活率；中国专利200710022803公开了一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法；中国专利200510062199公开了脱除草莓SMYEV的方法，其中基本采用了常规的培养基，并且需要剥取茎尖，仅仅针对SMYEV进行脱毒，其他病毒的脱毒效果不详。其他的公开文献还包括中国专利（申请）200910304829、201010133426、201010197820、201010252871、201010253333、20101058534、201110096851、201110139539、201110327423、201110375059等。

然而，草莓茎尖脱毒，需要用手术工具连续剥离十余层包裹于茎（尖）外的茎片，操作难度大、工作效率低，更为严重的是，虽然大多数情况下能够脱毒，但是即使有经验的技术人员也难以彻底剥离与消毒（经我们用多重RT-PCR同步快速检测方法检测，通常有60%的（混合）污染率，造成育苗品质的不稳定；而且，采用上述方法还存有外植体分化速度和脱毒试管苗繁殖速度较慢，长势弱及移植大田生产偏低等问题。

为此，本发明人经过长期而艰苦的研究，凭借一些运气，开创性地采用以草莓的根尖为外植体进行脱毒和组培，省却了使用显微镜的步骤，而且大大降低了污染率，并为此研究出了具体的草莓脱毒与组培方法，其步骤以及条件与现有技术的差异很大。另外，为了检验草莓脱毒的效果，尤其是脱多种病毒的效果，本发明人还研究获得了多重RT-PCR同步快速检测方法，可以对草莓组织直接实施高灵敏度的病毒检测，无需分离、纯化，而且其中的各引物及其配比经过优化，基本消除了检测中的相互干扰。

发明内容

本发明目的在于提供新的草莓脱毒与组培的方法以及可以与之配套的多重RT-PCR同步快速检测草莓病毒的方法。本发明的草莓脱毒与组培的方法相对于现有技术的操作繁琐、效率低、消毒难彻底、组培苗污染率高等问题，更加地操作简便、效率高、消毒易彻底、组培苗污染率低、繁殖速度快、苗质好。

具体而言，在第一方面，本发明提供了草莓脱毒与组培的方法，其包括

1）对草莓进行预处理，获得消毒的根尖；

2）在根尖诱导培养基上将根尖诱导培养成再生植株幼芽；

3）在增殖培养基上将幼芽增殖培养成小苗；

4）在继代生长培养基上使得小苗长成继代小苗； 

5）在生根培养基上使得继代小苗长成试管苗；和

6）任选检测试管苗是否侵染病毒。

优选在本发明第一方面的方法中,

根尖诱导培养基的配方为：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/L+BA（6-卞氨基嘌呤）0.3-0.5mg/L+2,4-D （2，4－二氯笨氧乙酸） 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

增殖培养基的配方为：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄50 mg/L +BA 0.2-0.5 mg/L+ NAA（萘乙酸） 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

继代生长培养基的配方为：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/0.5L+BA 0.1-0.3mg/L +水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；和/或，

生根培养基的配方为：MS基本培养基+NH₄NO₃400mg/L+ KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄ 50 mg/L + NAA0.1-0.5mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L。

更优选在本发明第一方面的方法中，各步骤为

1）将草莓放入灭菌细沙内于37土3℃下进行热处理，直至抽生根系；取1-2cm长的主根根尖，消毒并水洗次后，直接将前端0.1-0.2mm根尖切下作为外植体；

2）将外植体接种在根尖诱导培养基上，在25土3℃，光强1000土200lux、光照16土2小时∕天下培养，四周后光强增强到2000土500 lux，六周后增强到4000土500 lux，培养直至从根尖诱导出再生植株幼芽；

3）将再生植株幼芽接种在增殖培养基上，在25土3℃，光强2500土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长成8-10cm长的小苗；

4）将小苗剪成1-3cm长的小段，接种在继代生长培养基上，在25土3℃，光强2500土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长成8-10cm长的继代小苗；和/或

5）将继代小苗接种到生根培养基上，在25土3℃，光强2500土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长出根系。

也优选在本发明第一方面的方法中，检测试管苗是否侵染病毒是通过采用如下混合引物对的RT-PCR进行检测的：

SMoV上游引物P1: 5‘-TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3’ 

SMoV下游引物P2: 5‘-TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3’

SMYEV上游引物P3: 5‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’

SMYEV下游引物P4: 5‘-CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3’

SVBV上游引物P5: 5‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’

SVBV下游引物P6: 5‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’

SCrV上游引物P7: 5‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’

SCrV下游引物P8: 5‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。

进一步优选其中，混合引物对中P1：P2：P3：P4：P5：P6：P7：P8的含量比为0.3~0.5：0.3~0.5：0.4~0.6：0.4~0.6：0.8~1：0.8~1：0.9~1.1：0.9~1.1，优选为0.4：0.4：0.5：0.5：0.9：0.9：1：1。

在第二方面，本发明提供了草莓根尖在草莓脱毒与组培中的应用。其中优选草莓脱毒与组培是本发明第一方面的方法。

在第三方面，本发明提供了多重RT-PCR同步快速检测草莓病毒的方法，其中采用如下混合引物对：

SMoV上游引物P1: 5‘-TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3’ 

SMoV下游引物P2: 5‘-TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3’

SMYEV上游引物P3: 5‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’

SMYEV下游引物P4: 5‘-CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3’

SVBV上游引物P5: 5‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’

SVBV下游引物P6: 5‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’

SCrV上游引物P7: 5‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’

SCrV下游引物P8: 5‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。

除了检测所需的引物，RT-PCR所用的试剂以及方法流程是本领域技术人员所熟知的，而且有许多已经商品化了。而引物的增多容易引起相互干扰，为此本发明人进行了优化。优选其中，混合引物对中P1：P2：P3：P4：P5：P6：P7：P8的含量比为0.3~0.5：0.3~0.5：0.4~0.6：0.4~0.6：0.8~1：0.8~1：0.9~1.1：0.9~1.1，优选为0.4：0.4：0.5：0.5：0.9：0.9：1：1。

优选在本发明第三方面的中，检测的对象是草莓试管苗，优选是本发明第一方面的方法获得的试管苗。

本发明取得的有益效果在于：

1、操作容易、效率显著提高：因草莓的“茎尖”是由外围十余层茎片包裹中心的茎尖而组成，以往在显微镜下，用手术工具连续剥除十余层茎片是一项难度较大而效率很低的工作；而草莓的“根尖”直接暴露在外，切取其根尖的尖端就显得十分容易，效率可提高几十倍至上百倍；

2、消毒彻底，污染率低：茎尖脱毒由于其外围茎片不易除净，消毒也就难以彻底，导致组培苗污染率往往高达60%左右；而根尖脱毒由于其外围无任何包裹，消毒容易而彻底，故其组培苗污染率可大为下降；

3、提高了组培苗的质量：本发明以根尖为外植体不仅成功培育出了草莓组培苗，并通过试验后明确，根尖组培苗比茎尖组培苗在外植体分化速度、植株再生速度、试管苗繁殖速度及产量上均有提高；

4、经大田种植试验后明确，根尖脱毒组培苗其生根率和移栽成活率高达98%以上；

5、整个方法充分适合了根尖的特点，对各级培养基作了全面的改进与调整，确保了根尖组培的成功；

6、另外开发了多重RT-PCR同步快速检测草莓病毒的技术，与前述脱毒和组培方法联合使用，可以确保草莓组培苗的零带毒，从而为草莓组培苗的优质、安全、高产和大面积推广奠定了基础。

附图说明

图1是本发明的草莓脱毒与组培方法培育出的草莓苗的长势照片，其中A、B和C分别显示了草莓苗在试验田、大田和设施（大棚）中的种植情况。

图2是现有技术培育出的草莓苗的长势照片。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的材料、试剂均为本领域技术人员所熟知的，可以从市场所购买（草莓品种为红侠和章姬；MS基本培养基可购自武汉晟亚生物技术有限公司，型号M524（其中已经添加琼脂），也可以参见植物组培的书籍或实验手册。

实施例1 多重RT-PCR同步快速检测草莓组织的病毒侵染

委托合成核苷酸序列如下的草莓病毒特异性引物对，并混合成SMoV的两种引物含量分别为4μM、SMYEV的两种引物含量分别为5μM、SVBV的两种引物含量分别为9μM、SCrV的两种引物含量分别为10μM的混合引物溶液：

SMoV上游引物P1: 5‘-TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3’ 

SMoV下游引物P2: 5‘-TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3’

SMYEV上游引物P3: 5‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’

SMYEV下游引物P4: 5‘-CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3’

SVBV上游引物P5: 5‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’

SVBV下游引物P6: 5‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’

SCrV上游引物P7: 5‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’

SCrV下游引物P8: 5‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。

取草莓组织1g,放入100mL含0.5%Triton X-100和0.4 %Na₂SO₃的溶液中于37 ℃浸提20min，然后于室温（25℃）浸提1h，过滤，取滤液以12 ,000r/ min离心10min，得样品溶液。

采用RT-PCR反转录试剂盒（可购自海基生物科技有限公司，商品编号D0501），混合上述样品溶液2.5μL、5×RT MasterMix 2μL和Oligo (dT)20 Primer 0.5μL，用去离子水补足至10μL，反应程序为25℃温育10mim，42℃ 反转录45mim，95℃灭活 2mim，得到反转录cDNA溶液。

混合上述反转录cDNA溶液4μL、上述混合引物溶液1μL和2×Taq PCR Mix 12.5μL，用去离子水补足至25μL，进行PCR，条件为94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸 1 min，共30个循环；最后72℃延伸 10 min。

以上引物及配比在检测草莓组织（尤其是草莓试管苗组织）时不会引起相互干扰，而且SMoV病毒呈阳性，将扩增出15kb条带，否则未扩增出，呈阴性；SMYEV病毒呈阳性，将扩增出21kb条带，否则未扩增出，呈阴性；SVBV病毒呈阳性，将扩增出16kb条带，否则未扩增出，呈阴性；病毒呈阳性，将扩增出23kb条带，否则未扩增出，呈阴性。这很容易通过琼脂糖电泳条带来分辨。

实施例2 草莓脱毒与组培方法1

配制如下培养基：

1) MS基本培养基；

2)根尖诱导培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/L+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

3)增殖培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄50 mg/L +BA 0.5 mg/L+ NAA 0.2mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

4）继代生长培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/0.5L+BA 0.2mg/L +水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

5）生根培养基：MS基本培养基+NH₄NO₃400mg/L+ KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄ 50 mg/L + NAA 0.5mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

根尖脱毒与组培步骤如下：

1）材料预处理：将草莓放入灭菌细沙内于37土2℃下进行热处理6-12周，直至抽生根系；取1-2cm长的主根根尖，依次经70%（V/V）酒精消毒30秒，用0.1%氯化汞加一滴吐温摇动消毒8分钟及用无菌水洗3-5次后，直接将前端0.1-0.2mm根尖切下作为外植体；

2）根尖诱导再生植株培养：将外植体接种在根尖诱导培养基上，在25土2℃，光强1000lux、光照16小时∕天下培养，至四周后光强增强到2000 lux，六周后增强到4000 lux，培养3.5-4.5个月，直至从根尖诱导出再生植株幼芽；

3）幼芽增殖培养：将再生植株幼芽接种在增殖培养基上，在25土2℃，光强2500lux、光照16小时∕d下培养1个月，直至长成8-10cm长的小苗；

4)继代生长培养：将小苗剪成2-2.5cm长的小段，接种在继代生长培养基上，在25土2℃，光强2500lux、光照16小时∕d下培养，直至长成8-10cm长的继代小苗；

5）生根培养：将继代小苗接种到生根培养基上，在25土2℃，光强2500lux、光照16小时∕d下培养，直至约１周后长出根系成为试管苗。由此完成脱毒和组培过程，可以移栽大田或大棚种植。

实施例3 草莓脱毒与组培方法2

配制如下培养基：

2)根尖诱导培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/L+BA 0.8mg/L+2,4-D 0.2mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

3)增殖培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄50 mg/L +BA 0.35 mg/L+ NAA 0.35mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

4）继代生长培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/0.5L+BA 0.35mg/L +水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

5）生根培养基：MS基本培养基+NH₄NO₃400mg/L+ KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄ 50 mg/L + NAA 0.3mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L。

根尖脱毒与组培步骤同实施例2的步骤。

实施例4 草莓脱毒与组培方法3

配制如下培养基：

2)根尖诱导培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/L+BA 1.0mg/L+2,4-D 0.3mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

3)增殖培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄50 mg/L +BA 0.2mg/L+ NAA 0.5mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

4）继代生长培养基：MS基本培养基+ NH₄NO₃400mg/L + KNO₃500mg/L+KH₂PO₄50mg/0.5L+BA 0.5mg/L +水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

5）生根培养基：MS基本培养基+NH₄NO₃400mg/L+ KNO₃500 mg/L + KH₂PO₄ 50 mg/L + NAA 0.1mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L。

根尖脱毒与组培步骤同实施例2的步骤。

实施例5 本发明与现有技术的比较结果

    在浙江省农科院病毒学与生物技术研究所的卫星车间内（浙江省宁波市农科院组织培养中心内）进行脱毒和组培试验，生产草莓试管苗。实验组参照实施例2-5所述的方法进行，共进行96组（每种方法不小于做20组），其中长势的照片如图1所示；对照组参照中国专利申请200510030445和中国专利200510062199所记载的方法以及类似方法进行，共进行96组，其中部分长势照片如图2所示。取各组培与产生的试管苗，每组随机取样96个组织混合后，根据实施例1所述的方法进行检测。检测结果如表1所示，实验组检出的污染（组内任何一个样品检出任何一种病毒就算本组污染）有16个，污染率为16.6%，而对照组污染64个，污染率高达66.7%；实验组平均愈伤组织为32天，短于对照组的38天；实验组再生植株平均为126天，短于对照组的132天；实验组的草莓苗的月平均繁殖速度为5.1倍，高于对照组的4.8倍；实验组的试管苗的移栽成活率98%，也高于对照组的96%；实验组的初始苗每株可平均繁殖生产苗113.1株，而对照组的仅102株。由此可见，本发明的方法所培育的草莓苗比现有技术的在外植体分化速度、植株再生速度、试管苗繁殖速度组培苗和大田产量等方面均有提高。

表1   本发明与现有技术的脱毒和组培的效果对比表