公开/公告号CN102869989A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-01-09
原文格式PDF
申请/专利权人 阿雷斯贸易股份有限公司;
申请/专利号CN201080052757.5
申请日2010-11-17
分类号G01N33/53;C07K4/00;
代理机构上海专利商标事务所有限公司;
代理人余颖
地址 瑞士欧博讷
入库时间 2024-02-19 16:59:17
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-01-04
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N33/53 授权公告日:20150429 终止日期:20151117 申请日:20101117
专利权的终止
2015-04-29
授权
授权
2013-02-20
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/53 申请日:20101117
实质审查的生效
2013-01-09
公开
公开
相关申请
本申请要求2009年11月17日递交的美国临时申请No. 61/281,470和2010年9月27日递交的美国临时申请No.61/386,909的优先 权益。
背景技术
现有技术中已有检测简单多肽的方法。然而,由于受检多肽的异 质性,检测一组多肽混合物而非具有明确氨基酸序列的一种多肽的有效血浆 浓度方法很复杂。例如,含随机序列聚合物(RSP)的组合物包括随机掺入多 肽链的氨基酸的复杂混合物。RSP组合物由氨基酸的特性和比例而不是特定 序列决定。鉴于多肽的多样性,需要对多种制造方法制备的这些RSP组合 物的均一性和组成进行评估的改进方法。确定RSP组合物在体内的状态具 有重要的免疫学意义,因为取决于给药途径和/或给药频率及血清蛋白与RSP 组合物的结合,这种肽混合物可能激发初级炎症反应(TH1型)或初级调控 反应(TH2型),导致其在受试对象中的药代动力学和药效学改变。更加严 谨的设计和坚持给予RSP组合物可能提高治疗效果或者减少潜在的不良炎 症应答反应。
因此,为了治疗目的,需要定量分析RSP组合物的方法,例如 有助于评估这种肽混合物在体内的状况和确定合适的剂量及给药方式。
发明概述
本申请提供检测和评价RSP组合物的改进的方法。本发明提供 检测和定量分析RSP组合物的方法。本发明提供基于肽亚组与特定捕获多 肽相互作用的测定,和富集RSP组合物中多肽亚组亚组的方法。本发明进 一步提供对需要接受治疗的患者给予RSP组合物的方法,其中可根据上述 检测和定量方法来确定或评估给药方案和剂量。
本申请还提供检测RSP组合物的方法,包括以下步骤:(a)将 所述RSP组合物附着于固相支持物上;(b)使(a)所述固相支持物与含蛋 白质生物液体接触;(c)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所 述的蛋白质;(d)获得基本纯的(c)所述结合蛋白产物;(e)将(c)所述蛋 白质附着于定量检测所述RSP组合物用的工具上;和(f)测定所述RSP组合 物与(e)所述蛋白每一种的结合。
本说明书也提供一种改进RSP组合物设计的方法,包括以下步 骤:(a)将所述RSP组合物附着于固相支持物上;(b)使(a)所述固相支 持物与含蛋白的生物液体接触;(c)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持 物的(b)所述的蛋白质;(d)获得基本纯的(c)所述的结合蛋白产物;(e) 使(c)所述蛋白质附着于定量检测RSP组合物用的工具上;(f)测定所述RSP 组合物与(e)所述蛋白质结合的每一种肽;(g)调整所述RSP组合物的设 计以增加或减少与(e)所述一种或多种蛋白质的结合;(h)重复步骤(f); (i)任选地重复步骤(f-h),其中调整所述RSP组合物的设计可导致一种 或多种效果:提高生物利用度、减少毒性和提高效能。
此外,本申请提供一种检测RSP组合物中肽种类的方法,包括 以下步骤:(a)将所述RSP组合物附着于固相支持物上;(b)使(a)所述 固相支持物与含蛋白的生物液体接触;(c)鉴定特异性结合于(a)所述固 相支持物的(b)所述的蛋白质;(d)获得基本纯的(c)所述结合蛋白制品; (e)使(c)所述蛋白质附着于固相支持物上;(f)使(e)所述固相支持物 与所述RSP组合物接触;(g)测定所述RSP组合物中每种肽与(f)所述固 相支持物的结合。
另外,本申请提供一种改进RSP组合物中肽种类设计的方法, 包括以下步骤:(a)使所述RSP组合物附着于固相支持物上;(b)使(a) 所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触;(c)鉴定特异性结合于(a)所 述固相支持物的(b)所述蛋白质;(d)获得基本纯的(c)所述结合蛋白制 品;(e)使(c)所述蛋白质附着于固相支持物上;(f)使(e)所述固相支持 物与所述RSP组合物接触;(g)测定所述RSP组合物中与(f)所述固相支 持物结合的每一种肽;(h)调整所述RSP组合物的设计以增加或减少与(f) 所述一种或多种蛋白质的结合;(i)重复步骤(g);(j)任选地重复步骤(g-j), 其中调整所述RSP组合物肽种类的设计可导致一种或多种效果:提高生物 利用度、减少毒性,和提高效能。
通过应用本申请所述方法,研究者不仅可以更可靠地检测RSP 组合物中的低含量组分,而且可以特异性地检测RSP组合物中与生物活性 如毒性或效力有关或对其有贡献的肽种类。
本发明的基础是,发现RSP组合物中的一种肽或多种肽可与某 些具有蛋白质性质的物质特异性结合。相反,一旦鉴定到本说明书称为“捕 获多肽”的蛋白质,即可利用一种或多种这类捕获多肽定量分析RSP组合物 中所含的肽,并分离RSP组合物中功能更优良的肽亚组,或者根据结合特 异性给RSP组合物中的各组分分类。为了实施本发明,鉴定到能与(RSP 组合物所含)肽结合的捕获多肽后,即可将其制备成可用于实施本发明的形 式,即对其进行分离和纯化,纯度达到足以结合(RSP组合物所含)肽而不 受到存在的其他组分干扰。
本发明的一个方面提供了一种评价或测定RSP组合物不同制造 的制剂、用不同方法制造的、或不同的制造后加工的产品的差异的方法。本 发明的具体方法是,比较不同的RSP组合物制品与捕获多肽的结合来确定 各制品之间的相似性和/或差异。
本发明的另一方面提供一种定量分析RSP组合物或含RSP组合 物的样品中所含肽的方法。本发明的一些实施方式是检测给予RSP组合物 后其在体内的生物可利用含量或浓度(如血浆浓度)的方法。
本发明的方法是检测受试对象组织中存在的RSP组合物,所述 受试对象先前曾接触过RSP组合物或用其治疗过,在这种接触后立即、或 在接触后至少大约10、20、30、或45分钟,或者1、2、4、6、12、24、36 或48小时,或3、4、5、6、7或10天,或2、3、4、6、8或12周进行一 次或多次所述方法的检测。本发明的一种具体方法是检测哺乳动物血清或血 浆中存在的RSP组合物的各组分,所述哺乳动物在进行所述方法前曾在上 述期间内用所述DSP组合物治疗过。在某些具体实施方案中,所述哺乳动 物是人。
在某些实施方案中,本发明方法包括通过使RSP与一种或多种 预先确定的捕获多肽结合然后用例如免疫检测方法检测RSP组合物的存在, 和任选地检测其含量。因此。本发明的一个方面包括选择或鉴定能与RSP 组合物优先结合的血清蛋白。在某些实施方案中,鉴定一种或多种血清蛋白 的方法包括:使RSP组合物与包括血清的生物样品接触;如果样品中存在 RSP组合物中的肽,则检测其与血清中一种或多种组分的结合;分离得到结 合组分,鉴定一种或多种结合组分。在一些实施方式中,分离这种结合组分 的方法是,使样品接触设计的能与RSP组合物所含肽结合的亲和柱、随后 洗脱结合组分,然后鉴定结合组分。
任何能与RSP组合物所含肽结合的血清结合蛋白可用于上述方 法。合适的检测方法包括直接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹 法、免疫流式细胞检测法、放射免疫检测法(RIA),或者任何其他能定量 检测特异性抗原的免疫学检测方法。
本发明的一个方面是一种检测生物样品中RSP组合物存在与否 的方法,包括:使生物样品与至少一种捕获多肽接触;检测捕获多肽与RSP 组合物有无结合,其中存在这种结合表明在生物样品中存在RSP组合物中 的肽组分。可进一步延伸用这种方法检测样品中RSP组合物的含量或浓度。
本发明的另一个方面是测量RSP组合物在哺乳动物中的生物利 用度方法,包括:给予哺乳动物一定剂量的RSP组合物;取得对象的生物 样品;使该生物样品与至少一种捕获多肽接触;进而检测该生物样品中RSP 组合物的生物利用度或者生物可利用的程度。
本发明的另一个方面是提供给予哺乳动物对象RSP组合物的方 法,给药量取决于用上述检测方法或者本说明书描述的其他方法检测的该剂 量的生物可利用部分。在某些实施方式中,本发明方法还包括对照样品,和 进行药效学试验,通过比较样品与对照两者的检测结果,测定生理标志(例 如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、免疫调节剂,或者这些功能蛋白的效应 物或调节剂)的变化,并确定能引起所需药效学参数变化的有效剂量。在某 些实施方案中,观察对象报告的行为改变、自觉症状改变,例如疼痛或疾病 症状的减轻或其他间接效应。在一些具体实施例中,所述哺乳动物是小鼠或 大鼠等啮齿动物,其他的实施例中,所述对象是人。
本发明这个方面的某些实施方案,提供确定给予需要的受试对象 RSP组合物合适剂量的方法包括:(a)给予受试对象一个剂量RSP组合物; (b)取得受试对象的生物样品;(c)使此生物样品与至少一种捕获多肽接 触;(d)检测该生物样品中RSP组合物各组分的水平;(e)任选地用不同 剂量重复步骤(a)至(d);(g)将所测得的水平与预先确定的生物样品中 的RSP组合物合适水平作比较;其中所述合适剂量是导致生物样品中RSP 组合物达到预定合适水平的剂量。
本发明的某些实施方案提供预测RSP组合物所含的有生物利用 价值组分的方法。这种方法包括:使含RSP组合物的样品与RSP组合物给 予和递送后预期可到达部位原位的预定捕获多肽接触,测定RSP组合物与 该捕获多肽的结合。被大量RSP组合物结合,可表明较大比例的肽是与治 疗和/或生理相关的肽,结合较紧密(对每种肽测定其解离常数)可能表示 延长那些肽体内半衰期的保护作用。
本发明的又一个方面提供根据从实验对象获得的数据预测拟给 予治疗对象(如人)的RSP组合物的治疗有效量的方法。在某些实施方案 中,该方法包括:给予非人哺乳动物实验对象RSP组合物,测定该剂量的 生物可利用部分(例如用本说明书所述的定量测定方法),测定功能读出, 根据从哺乳动物实验对象获得的数据和治疗对象与实验对象之间的相关比 率,预测拟给予治疗对象的RSP组合物的治疗有效量。为了本发明的目的, “功能读出”可以是受试对象的表型或功能、受试对象细胞的表型或功能、或 受试对象产生的一种或几种液体的组成。功能读出还可包括或者包括测量一 种或几种生物合成或代谢产生的组分,如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、 趋化因子、生长因子、免疫调节剂,或所述功能读出的效应器或调节剂。在 某些实施方式中,检测步骤可以各种有规律或无规律的时间间隔后重复进 行,来测定给予RSP组合物后其生物利用度、代谢和/或清除的时间进程。 在某些实施方案中,可用此方法测定一组RSP组合物的血浆半衰期。在又 一个实施方案中,可用此方法测定RSP组合物中一种肽类的半衰期。在具 体实施方案中,实验对象是啮齿动物,例如小鼠或大鼠。
本发明另一个方面提供通过给予RSP组合物治疗患者的有效方 法,包括:通过合成肽(例如简单地接着合并每轮延伸产生的多个肽,或同 时利用合并的氨基酸单体)制备RSP组合物,制备所述RSP组合物的药学 上可接受的制剂,给予治疗对象所述RSP组合物,取得治疗对象的组织样 品,测定所述组织样品中RSP组合物的含量和/或浓度,测定功能读出,将 RSP组合物含量与功能读出相关联,及调整给予治疗对象的RSP组合物剂 量以改善功能读出。
本发明的另一个方面是治疗或预防治疗对象产生不希望有的免 疫应答反应的方法,包括给予治疗对象合适剂量的RSP组合物,确定合适 剂量可通过:(i)给予治疗对象一个剂量的RSP组合物;(ii)取得治疗对象 的生物样品;(iii)使该生物样品与至少一种捕获多肽接触;(iv)检测生物 样品中该捕获多肽的水平;(v)任选地用不同剂量重复步骤(i)至(iv); (vi)将测得的水平与预定的生物样品中RSP组合物的合适水平作比较;其 中合适剂量是导致生物样品中RSP组合物达到预定合适水平的剂量。
在前述某些方面和实施方案中,捕获多肽是标记的多肽。在某些 实施方案中,捕获多肽附着于固相支持物。在某些实施方案中,检测和/或 分离包含捕获多肽的复合体和RSP组合物的一个或多个肽组分。在具体实 施方案中,用对所述复合体而不是对捕获多肽或RSP组合物的肽组分具有 特异性的抗体来检测和/或分离这种复合体。
本发明另一个方面提供一种分离所选择的组成RSP组合物的肽 亚组的方法。在特别的例子中,该亚组由氨基酸序列不同的一种或多种肽组 成。在其他例子中,可根据结合特异性利用捕获多肽对RSP组合物所含组 分分类。
在某些实施方案中,分离含RSP组合物样品中肽的方法包括:(a) 使该样品与至少一种捕获多肽接触;(b)分离混合物中结合于捕获多肽的肽。 在这样的实施方案中,捕获多肽附着于固相支持物上。在一些实施方式中, 捕获多肽是表位示踪或标记的多肽。在一些实施方式中,该方法还包括分离 与捕获多肽结合的肽,以分离得到这些肽。在具体实施方式中,该方法还包 括测定该分离肽的特性,例如合并的分离肽中的氨基酸组成和/或分离肽的 氨基酸序列。
在某些实施方案中,鉴定在受试对象中RSP组合物的生物可利 用肽的方法包括:(a)给予受试对象RSP组合物;(b)在执行步骤(a)后 取得受试对象的生物样品;(c)鉴定该样品中结合于至少一种捕获多肽的肽。
在某些实施方案中,鉴定能结合捕获多肽的肽亚组的方法包括: 按拟定方案制备RSP组合物,使所述RSP组合物与预先确定的捕获多肽(如 适合作为体内靶标或运载体的多肽)接触,测定RSP组合物中的结合肽, 鉴定能区别结合肽和未结合肽的特征,制备能反映一种或多种差别特征的改 进的RSP组合物。
本发明的另一个方面是改进含RSP组分的组合物制备工艺的方 法。在某些实施方案中,根据鉴定结合捕获多肽的肽亚组的上述方法设计 RSP组合物。在某些实施方案中,设计的RSP组合物其氨基酸组成和/或氨 基酸序列接近于结合捕获多肽的肽亚组的氨基酸组成和/或氨基酸序列。在 某些实施方案中,RSP组合物与参比RSP组合物相比效力增强,其中参比 RSP组合物与接触捕获多肽的最初RSP组合物的效力相同或基本相同。在 其他实施方式中,RSP组合物的毒性比参比RSP组合物低。
在可替代的实施方案中,一种方法包括按拟定方案制备RSP组 合物,配制含RSP的组合物,通过检测功能读出的水平或程度确定所述组 合物中生物可利用的RSP组分的含量,将功能读出与标准值作比较,和调 整拟定方案或组合物的配方以获得满意的生物利用度。
本发明还有一个方面是通过将RSP组合物(例如参比RSP组合 物或用本说明书所述方法产生的改进的RSP组合物)或RSP组合物的一个 组分与受关注的治疗剂缔合而使该药物靶向特定组织,其中所述RSP组合 物或其组分与具有组织特异性靶向性能的捕获多肽结合,可将这种缔合药剂 给予患者使所述药物靶向能与相应捕获多肽结合的组织。
本发明这一方面的一些实施方式提供了将治疗剂转运到治疗对 象特定组织的方法,该方法包括:(a)使RSP组合物与组织特异性肽接触 并分离混合物中结合于该组织特异性肽的肽,得到标记肽;(b)将标记肽与 治疗剂偶联,(c)给予治疗对象该偶联物。本发明的其它实施方式包括通过 上述方法的步骤(a)和(b)制备这种靶向治疗剂的方法,及用此方法制备 的靶向治疗剂。
本发明的又一个方面是上述方法之一中有用的组合物。本发明这 一方面的一个实施方式是一种组合物,可用其检测生物样品中包含YEAK 或YEAK肽的RSP组合物,这种组合物包含至少一种捕获多肽。在一些实 施方式中,所述捕获多肽选自:正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正 常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、 正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中的一种组分,哺 乳动物HDL蛋白质组的一种组分,哺乳动物LDL蛋白质组的一种组分,补 体组分C3,载脂蛋白A-I前原蛋白,载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D), 补体组分C4A,胰蛋白酶抑制剂,间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白 (IHRP)、α-1-B-糖蛋白,α-1-抗胰蛋白酶酶,载脂蛋白A-IV,血浆铜蓝蛋 白,未命名的蛋白产物(BLAST检索表明它是IgM重链),载脂蛋白E,补 体因子B,前白蛋白,载脂蛋白C-III,α2-HS糖蛋白,载脂蛋白J前体,IgM 的C链,免疫球蛋白λ轻链,凝血因子II(凝血酶),Igκ轻链V-III(KAU 冷凝集素),载脂蛋白J前体,Ig AI Bur,富含组氨酸的糖蛋白前体,α-2-HS 糖蛋白,凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白 产物(NCBI基因座/登记号No.CAA28659),及IgJ-链。
在上述任何一个实施方式和任何一个方面中,所述RSP组合物 包括YEAK肽或YFAK肽。YEAK肽或YFAK肽是本领域已知的,下面对 其进行描述,它们是RSP组合物所包含的肽,可称为YFAK RSP组合物或 YEAK RSP组合物。另外,不依赖于选择YFAK或选择YEAK肽,在具体 实施方式中,捕获多肽可以是血清结合蛋白。在更具体的实施方式中,捕获 多肽选自:α-1-抗胰蛋白酶,载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、 载脂蛋白D和前白蛋白,或选自本段落前一段所枚举的捕获多肽,或选自 本说明书公开的血清多肽。
在上述任何一个实施方式中,RSP组合物所含肽可在生理上相 关的其它组分存在下与捕获多肽(例如血清蛋白)进行结合。在具体实施方 式中,其它组分是脂质,如胆固醇或甘油三酯。在具体实施方式中,其它组 分是除捕获多肽外基本上没有蛋白成分的HDL或LDL复合物。
附图的简单描述
图1是测定RSP组合物与血清结合蛋白(已结合于支持物上) 结合所用的试验的示意图。在血清蛋白被鉴定后,将其结合于固相支持物。 将RSP组合物(单独或包含于血清中)加到支持物上。加入抗RSP组合物 (或抗RSP组合物与血清蛋白的偶联物)的第一抗体,再用第二抗体和检 测试剂检测第一抗体与其靶标的结合。
图2显示当抗体结合于它们的靶标后,结合了抗YFAK和抗 YEAK抗体的HRP组合物的A450比色吸光度。靶标包括含有与正常人血清 中所含(或所加)血清蛋白结合的YFAK和YEAK肽的RSP组合物。在RSP 组合物浓度较高时,用抗YFAK和抗YEAK抗体检测的偶合物高于较低浓 度RSP组合物。在病人中,12.5ng/mL对应于大约2mg剂量。
图3显示能结合PI-2301或考帕松(Copaxone)的血清蛋白列表。 血清蛋白的来源是正常小鼠血清或正常人血清(已标明)。PI-2301可以是乙 酰化或非乙酰化的。用抗YFAK和抗YEAK抗体识别PI-2301或考帕松的结 合复合体,并用第二抗体和检测试剂加以检测。洗脱该复合体中的血清蛋白 并鉴定。根据检测试剂的A450吸光度给蛋白评分。与背景吸光度相比,70 分对应的p值<0.001,认为具有统计学显著意义。
图4显示小鼠静脉内给予4mg/kg或皮下给予21mg/kg剂量的 YEAK后血清中的YEAK,用比色法和偶联有HRP的抗-YEAK抗体检测 YEAK与其结合于正常人血清所含血清蛋白的靶标YEAK肽结合后的A450 吸光度。该图显示,给予GA(乙酸格拉默)片段后约15分钟,GA达到了血 清最高浓度1800ng/mL。皮下给予Copaxone的估计生物利用度为静脉给予 Copaxone的12%。给药后2小时仍可测到GA组分。
图5显示给予小鼠YEAK后血清或血浆中对YEAK应答产生的 可溶性因子紧急释放的示范例,此例中为CCL22,也称为MDC。如该图所 示,皮下给予小鼠的YEAK剂量与观察到的最大CCL22血浆浓度之间存在 线性相关。
图6显示用LC-MS观察从固定于CNBr-Seph柱的YEAK片段 洗脱所得血清蛋白的肽图像。用Mascot搜索引擎鉴定肽序列。简言之,将 胰蛋白酶消化产生的YEAK片段偶联于溴化氰Sepharose(CNBr-Seph)4b, 与人或小鼠血清一起室温培育2小时。用0.1M甘氨酸-盐酸,pH 2.8液洗脱 结合于YEAK片段的血清蛋白,在50%甲醇/50mM碳酸氢铵中用胰蛋白酶 消化,干燥后用液相色谱法(LC)分离,除去溶剂,电离后喷雾到质谱仪(MS) 中,直视观察并用Mascot搜索引擎鉴定。
图7显示用图1所示的本发明方法进行ELISA试验,其中,将 YEAK加入到男性和女性正常人血清后合并男性和女性正常人血清。该试 验显示检测血清YEAK浓度的线性范围在1-100ng/ml之间。用小鼠血清或 用无关对照,如抗匙孔戚血兰蛋白(anti-Keyole Limpet Hemocyanin,KLH)多克 隆血清,不能重复该试验。
图8显示第P53218和119142批次Copaxone(YEAK)分子量 的SE-HPLC图形,二批的图形相似。
图9显示用图1所示本发明方法检测图8中两批Copaxone的 结果。
图10显示,对图8和图9所用的两批Copaxone作的生物试验, 其中单核细胞系RAW264.7细胞接触YEAK后以浓度依赖方式释放CCL22。
图11显示,用MALDI-TOF检测,长度明确不同的YEAK共聚 体的实际平均分子量与理论平均分子量之间有严格的线性关系。将计算的理 论值乘以共聚体的氨基酸长度,即20、40、60和80乘以一个氨基酸加一 个水分子的理论平均分子量。用Y、E、A和K各自的质量减去在氨基酸偶 联过程中丢失的一个水分子的质量,计算出一个氨基酸的理论质量,这4个 氨基酸的比例为1.0∶1.5∶4.5∶3.6。
图12显示固相合成制备的长度不同YEAK共聚体的氨基酸分 析,按100个氨基酸标准化后的输出比例,以及对图8、9和10所示的两批 Copaxone进行的相同分析。
用含20、40、60和80个氨基酸的YEAK共聚体产生标准曲线。 为了比较,也用Copaxone产生标准曲线。图12显示YEAK共聚体的大小 与基于竞争性ELISA的PK试验检测结果之间的关系。20-聚YEAK共聚体 的抑制作用很小,但用80-聚YEAK共聚体产生的标准曲线与用Copaxone 获得的曲线重叠。
图13显示ELISA试验结果,其中家兔多克隆血清的Ig组分与 Copaxone相互作用强烈,表明随着固相合成的YEAK共聚体长度增加,其 识别能力也提高。
图14显示用先前PCT公开文本WO2009/075854(其内容纳入本 说明书作参考的)所描述的PK方法与固相合成的YEAK共聚体所作的 ELISA试验结果,证明YEAK共聚体的大小与用上述试验方法测得的结果 之间相关。
图15显示,单核细胞系RAW264.7细胞与图12、13和14所示 固相合成的大小不同的共聚体一起培育后,随着共聚体长度的增加,CCL22 的产量也增加。
图16显示,图8、9、10和12所用的两批Copaxone与图12、 13、14和15所用的固相合成的长度不同的YEAK共聚体,能在体内诱导用 2.5mg/kg Copaxone每周一次×3周免疫的小鼠的脾细胞增殖。最后一次皮下 给予后,收集脾脏,制备细胞悬液,将脾细胞与不同浓度的不同共聚体一起 培养4天。用本领域熟知的方法通过测定氘化胸腺嘧啶的掺入检测脾细胞增 殖。
发明详述
含随机序列聚合物的组合物
为描述本发明目的的含随机序列聚合物(RSP)的组合物,可以是 一种以不同比例包含两个或多个随机顺序氨基酸残基的氨基酸聚合物(典型 地为通过肽键相连)的任意混合物,当给予哺乳动物时可用于激发或减弱某 些免疫反应或其他反应。因为序列混和的随机多样性,该混合物中存在大量 肽序列。肽序列的这种多样性可赋予比多样性差的组合物更高的效能。
RSP组合物的定义包括一组聚合物的氨基酸序列和这些氨基酸 的摩尔比。例如,以YFAK命名的RSP组合物含有酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、 丙氨酸(A)和赖氨酸(K),但不表示该聚合物的氨基酸顺序就是Y-F-A-K,这 些氨基酸残基是随机掺入序列中的,因此,该RSP组合物包含具有各种顺 序Y、F、A、K的肽,并且没有或基本上没有其它氨基酸。相对摩尔比的 表示有两种方式:输入摩尔比和输出摩尔比。“输入摩尔比”指合成RSP所用 氨基酸的摩尔比。例如,如果所述RSP的Y∶F∶A∶K输入摩尔比为1∶1∶10∶6, 那么用固体相合成法合成时,对于每轮循环延伸,将受保护的Y、F、A和 K氨基酸以摩尔比1∶1∶10∶6混和的混合物通过反应延伸肽链。另一方面,“输 出摩尔比”指产物RSP肽中所见氨基酸的摩尔比。通过分析RSP组合物的氨 基酸含量测定输出摩尔比。输入与输出摩尔比不同是由于氨基酸掺入效率的 差异所致。
合适的RSP包括在PCT国际公开出版物WO 00/05250、WO 00/0524、WO 02/59143、WO 0027417、WO 96/32119,美国专利申请US 2008/0021192、2004/003888、2002/005546、2003/0004099、2003/0064915 和2002/0037848,美国专利6,514,938、5,800,808和5,858,964中描述的和 PCT申请PCT/US05/06822中描述的那些。这些文献描述了合成RSP的方法, 含RSP的组合物,RSP的治疗制剂,给予受试对象RSP组合物的方法,可 用RSP治疗的疾病,及可与RSP同时给予受试对象的治疗有效药物。本发 明所用的另外的RSP和合成它们的方法可参见文献,如Shukaliak Quandt,J. 等.(2004)Mol.Immunol.40(14-15):1075-87;Montaudo,MS(2004)J.Am.Soc. Mass Spectrom.15(3):374-84;Takeda,N.等.(2004)J.Control Release 95(2): 343-55;Pollino,JM等.(2004)J.Am.Chem.Soc.126(2):563-7;Fridkis-Hareli, M等.(2002)J.Clin Invest.109(12):1635-43;Williams,DM等.(2000)J.Biol. Chem.275(49):38127-30;Tselios,T.等.(2000)Bioorg.Med.Chem.8(8): 1903-9和Cady,CT等.(2000)J.Immunol.165(4):1790-8。所有这些专利、专 利申请和出版物的完整内容均纳入本说明书作为参考,特别是其中所描述的 RSP的结构、制备和功能。
某些RSP可包含适量带正电的氨基酸如赖氨酸或精氨酸,和带 负电的氨基酸(含量宜较少)如谷氨酸或天冬氨酸,任选地与电中性的氨基 酸如丙氨酸或甘氨酸(起填充作用)联合,任选地还可进一步包含适合赋予 共聚体免疫原性的氨基酸,例如芳族氨基酸如酪氨酸或色氨酸。这类组合物 可包含WO 00/005250中所述的任何一种氨基酸,其全部内容纳入本说明书 作为参考,特别关注所披露的讨论RSP结构、制备和功能的那些部分。在 本发明的某些实施方式中,RSP组合物是一种聚合物的混合物,这些聚合物 包含随机或部分随机组成的氨基酸序列和含有以下四组氨基酸:(a)带正电氨 基酸,即赖氨酸和精氨酸;(b)带负电氨基酸,即谷氨酸和天冬氨酸;(c)小的 中性氨基酸,即丙氨酸、苏氮酸、丝氨酸和甘氨酸;(d)大的氨基酸,即亮氨 酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。这类RSP的具体实 施方式有:YEAK(包括下文描述的Cop-1)、VEAK和FEAK。在其它实施 方式中,RSP是由三个氨基酸组成的三聚体,选自上述四组中三组的各个 氨基酸。具体的实施方式有:YAK,YEK,KEA和YEA,下文中有进一步描 述。
在本发明的其它实施方式中,RSP组合物是由随机或部分随机氨 基酸序列组成的聚合物的混和物,含有(a)谷氨酸,(b)天冬氨酸和选自以下 各组的氨基酸:(c)小中性氨基酸,即丙氨酸、苏氮酸、丝氨酸和甘氨酸; 和(d)疏水性氨基酸,即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。这类RSP的具体实施 方式为DALE、DAIE、DAVE、DGLE、DGIE和DGVE。本发明有用的RSP 的其它实施方式是不含疏水性氨基酸的RSP。具体实施方式是DASE、DATE、 DGSE和DGTE。
其他合适的RSP是具有随机或部分随机的氨基酸序列并含有选 自以下四组之一氨基酸的聚合物的混和物:(a)带负电氨基酸,即天冬氨酸和 谷氨酸;(b)小脂族氨基酸,即丙氨酸和甘氨酸;(c)疏水性氨基酸,即亮 氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸;和(d)含小疏水侧链的氨基酸(如丝 氨酸、半胱氨酸、苏氨酸),此外,所述共聚体可包含脯氨酸残基。在一种 实施方式中,所述共聚体由氨基酸谷氨酰胺(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸 (L)、丝氨酸(S)和丙氨酸(A)产生,本说明书称之为″ELSA″共聚体。
在某些其他实施方式中,RSP是随机或部分随机氨基酸序列的混 和物,含有以下四组的氨基酸:(a)带负电氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸); (b)疏水性脂族氨基酸,即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸;大疏水 性氨基酸,即酪氨酸、苯丙氨酸;和(d)有小中性侧链的氨基酸,即丝氨酸、 苏氮酸、丙氨酸、甘氨酸;此外,所述共聚体可含脯氨酸残基。一种示例性 共聚体由氨基酸残基谷氨酰胺(E)和/或天冬天氨酸(D)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y) 和缬氨酸(V)形成,本说明书称之为″DLYV″共聚体。
RSP的其他具体实施方式是VYAK、VWAK和YFAK,下文有进 一步描述。在还有的其他实施方式中,适合用于本发明的RSP包含氨基酸 残基K、E、A、S、V和任选的P。更优选,K∶E∶A∶S∶V的比例是0.3∶0.7∶9∶ 0.5∶0.5∶0.3。RSP优选长约10-100个氨基酸残基,更优选长约20-80个个氨 基酸残基,甚至更优选长约40-60个氨基酸残基,最优选长约50个氨基酸 残基。典型的RSP制备物是各种长度肽的混合物,主要是所需长度的肽, 但可含有某些较短或较长的肽。
一种适合于本说明书描述的组合物和方法的特异性RSP是 YEAK,它包含L-丙氨酸(A)、L-谷氨酸(E)、L-赖氨酸(K)和L-酪氨酸(Y)的 组合,带净正电荷。一具体实施方式是共聚体1(Cop-1),也称为glatiramer acetate。几个国家已批准用Cop-1来治疗多发性硬皮症(MS),其商品名为 COPAXONETM(Teva药物有限公司的商标,Petah Tikva,以色列)。由于 Cop-1是随机多肽的混合物,可能它包含的肽的所有亚组或只有一个亚组是 “活性肽”。受关注的Cop-1RSP分子量约2,000--13,000道尔顿(Da)。Cop-1 的平均分子量约4,700--13,000Da,但也可包含较小和较大的肽。最受关注的 Cop-1的平均分子量约5,000--9,000Da。因此,Cop-1RSP可以是由长约15-100 个氨基酸残基(优选长约40-80个氨基酸残基)组成的肽。在一种具体实施 方式中,Cop-1RSP的长度在35--75个氨基酸残基之间。更优选的Cop-1RSP 长度在35--65个氨基酸残基之间。在一种具体实施方式中,Cop-1长约50 个氨基酸。在另一种具体实施方式中,Cop-1长约52个氨基酸。在某些实 施方式中,用本领域熟知的液相或固相化学合成的Cop-1的平均输出摩尔比 Y∶E∶A∶K分别约为1.0∶2.0∶6.0∶5.0。与传统的肽合成相反,但与其他RSP的 制备相似,进行Cop-1的合成是通过加入明确比例的受适当保护的Y、E、 A和K的混合物,而不是每轮只加入一种氨基酸。输出比例的差异范围在不 同氨基酸之间约为10%。优选形式Cop-1的分子量范围和制备方法可参见美 国专利No.5,800,808,其全部内容纳入本说明书,特别是其中描述的RSP 的结构、制备和功能。
在含约52个氨基酸残基的Cop-1RSP的某些实施方式中,31-52 位氨基酸中丙氨酸组分的比例高于11-30位氨基酸中的比例,和11-30位氨 基酸中丙氨酸组分的比例高于1-10位氨基酸中的比例。在一种具体实施方 式中,Cop-1RSP序列中的1-10位残基中的输出摩尔比为约1.0∶2.0∶5.5∶ 5.0,而11-30位残基的输出摩尔比约为1.0∶2.0∶6.0∶5.0;31-52位残基的输 出摩尔比约为1.0∶2.0∶6.5∶5.0,以上标示的所有比例是按Y、E、A、K顺序 的摩尔比。
就本发明的目的而言,短语“Cop-1或Cop-1-相关肽或多肽”意味 着包括与髓磷脂碱性蛋白(MBP)有功能交叉反应、在抗原提呈中能与MBP 竞争MHC II类分子的任何肽或多肽。对于本说明书所述的用途,预期如果 只进行以下一个或几个氨基酸的替换,即天冬氨酸(D)替换谷氨酸(E),甘氨 酸(G)替换丙氨酸(A),精氨酸(R)替换赖氨酸(K),色氨酸(W)替换酪氨酸(Y), 可保留Cop-1的活性。
在其他实施方式中,RSP组合物包含以下组别的三种不同氨基 酸:(a)带负电氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸);(b)疏水性脂族氨基酸, 即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸;(c)大疏水性氨基酸,即酪氨酸、 苯丙氨酸;和(d)小中性侧链氨基酸,即丝氨酸、苏氮酸、丙氨酸、甘氨酸; 此外,所述共聚体可包含脯氨酸残基。这些共聚体在本说明书中指“三聚体”。 平均分子量在约2,000-40,000Da之间,优选在约3,000--35,000Da之间。 在一种更具体实施方式中,平均分子量约5,000--25,000Da。以下表格中显 示了示例的三聚体。这些三元共聚体的氨基酸平均摩尔分数可以不同,显示 为一般范围。
表A适合于本发明使用的三元共聚体
在具体实施方式中,该三元共聚体的氨基酸摩尔比与优选的 Cop-1相似,如谷氨酸约0.14,丙氨酸约0.43,酪氨酸约0.10和赖氨酸约 0.34。
其他合适的RSP包含L-丙氨酸(A)、L-苯丙氨酸(F)、L-赖氨酸(K) 和L-酪氨酸(Y),本说明书称为YFAK。任何这类RSP的长度在约25-300 个氨基酸残基之间。优选用于治疗组合物的YFAK RSP含35-75个氨基酸残 基。更优选的RSP长度在35-65个氨基酸残基之间。一种优选的RSP长度 约50个或52个氨基酸。
一种特别的YFAK组合物(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和 L-赖氨酸)其输出摩尔比分别约为1.0∶1.2∶XA∶6.0,其中XA大于11.0小于 30.0,更具体大于20.0小于30.0;输出比的这种差异在不同氨基酸之间包括 约为10%的范围。优选用于治疗的YFAK随机共聚体的输出摩尔比见下面 的表B。
表B:YFAK RSP的组成氨基酸组成比例
一种特定的YFAK组合物的具体平均输出摩尔比Y,F,A,K分别 约为1.0∶1.3∶24.0∶6.0,可用本领域已知的固体相合成法制备。
另一种优选用于治疗的YFAK组合物的平均输出摩尔比YFAK 约为1.0∶1.2∶XA∶6.0,其中XA大于20.0,丙氨酸的比例随共聚体的长度 而增加。在一个具体的组合物中,该RSP的长度约52个氨基酸残基,在31-52 位氨基酸中丙氨酸的比例大于在11-30位氨基酸中的比例;在11-30位氨基 酸中丙氨酸的比例大于在1-10位氨基酸中的比例。
RSP可按照其优先结合靶蛋白的能力及生理功能进行分类,从 其氨基酸组成和比例直接推导。可采用现有的任何方法来确定RSP组合物 能否结合候选或已知的靶蛋白。例如,将报告分子(如放射性核素或生物素) 标记的多肽与粗制或纯化的靶蛋白混和,去除未结合的多肽后如果该报告分 子附着于靶蛋白,则检测其结合。
RSP可包含任何比例的氨基酸残基,可具有各种不同的生理作 用,但某些RSP有被认可的免疫学活性。设计某些RSP,它们能优先与特 异性T细胞表位相互作用,其中的一些与病理性紊乱直接相关。本发明采用 的一类RSP对分泌可溶性介质如细胞因子的T细胞具有特异性。优选的这 类RSP是含有2-8种氨基酸的肽,能优先与特异性T细胞表位相互作用, 其中的一些被认为与病理性紊乱直接相关,这些病理性紊乱被可溶性介质如 细胞因子的异常产生所加重。
另一类RSP的潜在功能,是能与通过MHC分子(优选通过 MHC II类分子)提呈的数千种、优选数十万种、更优选数百万种T细胞表 位相互作用。人的MHC II类等位基因包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP 分子。有许多编码这些HLA分子每种类型的等位基因。MHC II分子主要表 达在B淋巴细胞和抗原提呈细胞如巨噬细胞的表面。MHC II类蛋白由大小 几乎相等的α和β亚基组成,二者均为跨膜蛋白。α和β亚基的氨基末端部 分形成肽结合槽。这种肽结合槽是向T细胞提呈抗原的位点。MHC II类蛋 白的某些等位基因变体与自身免疫疾病和其他免疫功能紊乱疾病相关。
一种具体的这类疾病是多发性硬化症(MS)。MS-相关的 HLA-DR2(DRB1*1501)分子以高亲和力结合于髓磷脂碱性蛋白(MBP), 引起T细胞攻击髓磷脂鞘膜。上述Cop-1能以高亲和力和肽-特异性方式结 合于纯化的HLA-DR2(DRB1*1501),HLA-DR1(DRB1*0101)和HLA-DR4 (DRB 1*0401)。其他RSP(如YFAK)对MHC II类蛋白的抗原结合沟槽也 有与Cop-1相似或更高的亲和力。因此,这些RSP能抑制或取代髓磷脂自 身抗原与MHC II类蛋白的结合。
类似地,本说明书所述方法采用的RSP组合物可用于治疗关节 疾病,如类风湿关节炎(RA)或骨关节炎(OA)。能结合Cop-1的HLA-DR1 (DRB1*0101)或HLA-DR4(DRB1*0401)与类风湿关节炎(RA)相关。Cop-1、 YFAK和本发明所用的其他RSP对这类HLA的抗原结合沟槽亲和力比类风 湿关节炎的病理靶蛋白--II型胶原蛋白261-273肽更高。因此,这些RSP能 抑制或取代II型胶原蛋白261-273肽与MHC II类蛋白抗原结合沟槽的结合。
在本发明方法的某些实施方式中采用的其他RSP,是能结合 HLA-DQA 1分子,甚至更优选能结合等位基因DQA 1*0501-DQB 1*0201, DQA1*0301,DQB 1*0401和DQA1*03-DQB1*0302所编码的一种或多种 HLA分子的RSP。
在具体实施方式中,RSP结合某种HLA-DQ分子(携带这种分 子的人易感自身免疫相关疾病,如I型糖尿病和乳糜腹泻病)的解离常数(3/4) 比结合HLA-DR分子和/或其他DQ同工型分子至少低10倍。这类HLA-DQ 分子是称作DQB 1*0201、DQB 1*0302、DQB 1*0304、DQB 1*0401、DQB 1*0501、DQB1*0502及DQA1*0301、DQA1*0302、DQA1*0303和DQA1 *0501的特异性HLA-DQB1和DQA1等位基因分子的联合蛋白质产物。这些 等位基因(“顺式”等位基因)编码相同的单倍型,如DQB 1*0201-DQA1 *0501-DRB1*0301和DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*0401。所产生的包 含“顺式”等位基因多肽产物的HLA分子,称为“顺式二聚体”。或者,这些 等位基因可在不同的单倍型(“反式”等位基因)上编码。含有“反式”等位基 因多肽产物的HLA分子称为“反式二聚体”。“反式”等位基因的一个例子是 DQB 1*0201-DQA1*0501-DRB1*0301上的DQB 1*0201与DQB 1*0301 -DQA1*0301-DRB 1*0404上的DQA1*0301的联合(蛋白)。
在具体实施方式中,本发明所用的RSP组合物能结合一种或多 种DQ同工型分子,其平均Kd为1μM或更低,更优选平均Kd低于100nM, 10nM或甚至低于1nM。另一种鉴定优选共聚体的方法基于竞争结合试验 (如Sidney等,2002,J.Immunol.169:5098描述的试验)中一种共聚体取代 另一种共聚体的测定,用IC50值表示。本发明的优选RSP的IC50值低于1μM, 更优选低于500nM,甚至低于100nM。对HLA-DQ具有特异性的某些RSP 是ELSA和VLYV。
在某些其他具体实施方式中,本发明的方法涉及的RSP具有基 于疾病相关表位APL的某些特性。
在某些实施方式中,将本发明有用的RSP配制用作药物,其分 散度低于25,000,更优选低于10000、5000、1000、500、100、50或甚至 低于10。
药代动力学方法
在某些实施方式中,可测定RSP组合物的吸收和分布。也可测 定RSP组合物发生变化的速率和这种变化的持续时间,以及RSP组合物组 成的化学变化。
某些RSP组合物在血清和其他生物液体中的持续时间比其他混 合物长得多。例如,发现一种YFAK制品PI-2301的血清浓度高10倍于最 初以相同的“体重-体积”浓度给药的Cop-1(US App.Pub.2009-0275496)。在 某些情况下,给予的多肽在体内被隔离或结合于原位的某些体内成分,其结 果在体内环境中半衰期延长,伴随或不伴随生物利用度提高。在某些实施方 式中,所述环境是血浆或淋巴液。在另一种实施方式中,所述环境是脊髓或 脑液。在其他实施方式中,所述环境是RSP组合物递送肽所在部位的任何 组织或器官。
对与RSP组合物中的氨基酸共聚体结合的生理多肽和蛋白质的鉴定
本发明的一个方面是鉴定能结合RSP组合物的捕获多肽。术语 “捕获多肽”在本说明书中用来表示见于正常组织和器官的任何多肽、蛋白 质、蛋白片段、脂蛋白或具有蛋白质性质的其他分子。它可以是单一的多肽 或含多条多肽和/或亚基的蛋白,或含与其他材料如脂质结合(共价或非共 价结合)的蛋白质,该捕获多肽还可具有结合RSP组合物所需或所必需的 明确结构。捕获多肽常常不是短暂存在的,即无论何时都可发现其以基础且 稳定的量存在,不论是否有被诱导而短暂提高的量。捕获多肽优选蛋白质, 更优选地,捕获多肽是生物液体中的蛋白质,如血清蛋白质。
本发明此方面的某些实施方式是鉴定能与RSP组合物中所含肽 结合的捕获多肽的方法。该方法包括:使含一定量RSP组合物的样品接触 正常组织样品;和检测RSP组合物的肽与正常组织样品中任何组分的结合。 在某些实施方式中,将RSP组合物包含的肽固定在树脂(通过该肽与活化 树脂的反应而共价结合)或固体材料如聚苯乙烯上。例如,使组织样品与固 定的肽接触并进行培养,洗涤除去非特异结合,鉴定组织样品中与该肽结合 的物质。可用任何合适的方法鉴定结合的物质,例如将该物质施加于特异性 抗体平板上;如果疑为多肽或核苷酸则对其进行微测序;如果疑为多糖,则 用胰蛋白酶消化后用液相色谱法结合串联质谱(LC-MS/MS),用特异性染料 染色;或采用灵敏度足够高的任何分析方法。
作为以上所述鉴定的一个非限制性例子,PI-2301或Cop-1可 用于直接ELISA试验(见材料和方法)以鉴定能结合含YFAK或YEAK肽 的RSP组合物的血清蛋白。下面的表C列出了实验显示正常人血清中能结 合YEAK和/或YFAK肽的血清蛋白质。观察到YEAK和YFAK肽具有不 同的结合特异性;相反,可以说是血清蛋白以不同的结合特异性与YEAK 和YFAK肽结合。表D和E分别列出了与HDL和LDL结合的血清蛋白。 任何血清蛋白可以不同的亲和力和选择性与本说明书所述的RSP组合物结 合。
一旦鉴定到能与RSP组合物包含的肽结合的捕获多肽,可测定 其结合类似肽或完全随机组成的肽的特异性。捕获多肽经鉴定和特性分析后 (或是实际上鉴定过的相同分子,或是不同来源获得的同样分子)进而可用 于定量分析与之结合的RSP组合物。
血清蛋白质
在某些实施方式中,RSP组合物与血清蛋白质的结合构成了它 们生物学活性的重要方面。RSP组合物与血清蛋白质的结合有利于其组织分 布和被抗原提呈细胞(如单核细胞和巨噬细胞)捕获。如上所述,肽与血清 蛋白结合可保护它们避免被降解和/或转化。例如,皮下给予PI-2301 (plovamer,一种YFAK RSP)和Cop-1(乙酸格拉默(glatiramer),一种YEAK RSP)后几小时可在不同动物(包括人)的血清中检测到,而对照RSP短时 间后就从血清中消失[US App.Pub.2009-027496]。
因此,可利用血清蛋白来捕获和/或鉴定RSP中的一种或多种 肽。虽然RSP组合物总体上含有许多不同的肽,但其中只有一种或多种组 分与血清蛋白结合性能相关,而其他组分则并非如此。特别是用液相肽合成 法制备的混合肽的确如此,不同批次的RSP组合物含有的能结合血清蛋白 的肽的百分比可有变化。例如,重要的是监测血清中的乙酸格拉默 (glatiramer)变体,以揭示不同批次RSP组合物中各变体的生物等效性, 及揭示血清蛋白结合组分在数量与质量上的等效性。
可利用血清蛋白来体外选择和/或特征鉴定RSP结合物中的结 合伴侣。也可利用血清蛋白在体内选择、检测和/或特征鉴定结合血清蛋白 的肽,根据其与血清蛋白的结合和/或在体内的持久性而提供区别特异性肽 或肽亚组的方法。结合血清蛋白的肽的具体特性可包括:氨基酸的具体序列、 混合物中各氨基酸的比例、结构、独特基序、带电残基的结构。例如,PI-2301 与HDL或LDL复合体中的脂蛋白结合,可能是因为其带正电的赖氨酸与脂 蛋白外部带负电的残基相互作用,及其丙氨酸与脂蛋白疏水部分的苯丙氨酸 相互作用所致。
表C:实验显示人血清中能与YEAK和YFAK肽结合的血清蛋白示例:
表D:结合HDL的血清蛋白
表E:与LDL结合的血清蛋白
血清蛋白与RSP组合物之间的结合
不希望受理论的束缚,在机制上RSP组合物(如PI-2301和 Cop-1)中的肽与血清蛋白如载脂蛋白(被发现与HDL和LDL相关联)结 合可有利于它们被单核细胞捕获(通过受体,如SR-BI或ABCA1受体)。 这种结合可诱导单核细胞活化和分化成为抗炎细胞。PI-2301与Cop-1结合 的血清蛋白有所不同(见图3)。这种不同的一个原因是,溶液相肽合成产生 Cop-1和乙酸格拉默(glatiramer)基因变体,因此可观察到各批次组合物之 间有显著差异。相反,PI-2301系用固体相合成法制备,如用SEC-HPLC和 MALDI-TOF两种方法检测所显示,PI-2301的分子量分布范围非常狭窄,高 斯正态分布紧凑。因此,混合物中绝大多数PI-2301 52-聚肽可能是有功能的 肽。Cop-1的分子量分布则范围宽得多,使混合物中一些种类的肽(如小肽) 可能是无效的。与上述相一致,在多发性硬化症和克罗恩病的临床前模型上 的效能测试中PI-2301的效能比Cop-1高,达到了更高的血清接触。
在检测与PI-2301或Cop-I结合的血清蛋白时,发现与YFAK和 YEAK肽结合的血清蛋白亚组有所不同(见图3)。
能结合RSP组合物的血清蛋白是含胆固醇的复合体(如HDL或 LDL复合体)的一部分,和/或与其他蛋白和多肽(可作为有功能的捕获多 肽)结合,这些蛋白和多肽在生理条件下可见与血清蛋白结合。因此,本发 明的方法注重RSP组合物与血清蛋白结合时血清中有其他组分。
检测生物样品中的RSP组合物:生物利用度的测定
本发明一方面内容是检测生物样品中RSP组合物的存在的方法, 包括使生物样品与至少一种捕获多肽接触;和检测该捕获多肽是否与RSP 组合物结合,存在这种结合表明生物样品中存在RSP组合物中的肽组分。 还可扩展此种方法来检测样品中RSP组合物的含量或浓度。
在某些实施方式中,检测生物样品中存在的RSP组合物(如包 含YFAK或YEAK肽)的方法是,使生物样品与至少一种捕获多肽(例如包括 选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂 蛋白D和前白蛋白的肽)接触;和检测是否存在捕获多肽与RSP组合物的结 合。在此试验中存在这种结合表明生物样品中存在YFAK或YEAK肽。本 发明也提供方法,通过使生物样品与至少一种捕获多肽(例如包括选自α-1- 抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白D 和前白蛋白的肽)接触,和定量测定该捕获多肽与RSP组合物结合的水平, 来检测生物样品中包含YFAK或YEAK肽的RSP组合物的含量。
本发明的其他实施方式提供检测对象中RSP组合物(如包含 YFAK或YEAK肽)生物利用度的方法,包括给予受试对象一个剂量含RSP 组合物的组合物;取得受试对象的生物样品,使该生物样品与至少一种捕获 多肽(例如包括选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋 白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白的肽)接触。可以预期,RSP组合物中的肽 在体内可与捕获多肽广泛结合。虽然如此,对于进一步的特性鉴定,可利用 针对含有RSP组分肽和捕获多肽的复合体的特异性抗体(而不是针对其中 各组分的单一抗体))来检测RSP组合物的生物利用度。
给药剂量和方法的改进
本发明另一方面的内容是提供给予哺乳动物受试者RSP组合物 的方法,所用量根据用上述方法或本说明书描述的其他方法测定所给剂量的 生物可利用部分而加以确定。在某些实施方式中,该方法还包括:对照样品; 进行药效试验以检测生理标志(如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、免疫调 节剂或这些功能蛋白之一的效应物或调节物),比较对照样品与测试样品之 间的两种结果,确定导致药效参数所需改变的有效剂量。在某些实施方式中, 观察受试者所报告的行为变化,自觉症状改变,例如疼痛或疾病症状的减轻, 或其他间接效应的证据。在某些实施方式中,所述哺乳动物受试者是啮齿动 物,如小鼠或大鼠。在其他实施方式中,所述受试者是人。
更通俗地说,治疗或预防治疗对象不希望有的免疫应答反应的方 法可包括提供RSP组合物(如包含YFAK或YEAK肽);给予受试对象该 RSP组合物;取得受试对象的生物样品;使该生物样品与至少一种捕获多肽 (例如选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、 载脂蛋白D和前白蛋白的肽序列)接触;分离混合物中结合捕获多肽的肽; 测定分离肽的特性;制备具有分离肽特性的一组肽,和将制备的该组肽给予 治疗对象。
在这些方法中,可给予受试对象一次以上的RSP组合物。例如, 可间隔1、2、3、4、6、12、18、24、36、48或72小时给予受试对象RSP 组合物。
因此,本发明的一些实施方式是给予有需要的对象合适剂量的 RSP组合物(如包含YFAK或YEAK肽),合适剂量的确定是通过给予治疗 对象第一剂RSP组合物;取得治疗对象的生物样品;使该生物样品与至少 一种捕获多肽(例如包括选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、 载脂蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白的肽)接触;检测生物样品中捕获多 肽的水平;任选地用第二种不同剂量重复上述步骤;将测得的水平与预先确 定的生物样品中RSP组合物的合适水平进行比较。在这些情况下,合适的 剂量是可导致生物样品中RSP组合物达到预先确定的合适水平的剂量。生 物样品中RSP组合物的合适水平是能获得所需功能的读出或替代标志改变 的水平。功能读出可以是受试对象的表型或功能,受试对象细胞的表型或功 能,或受试对象产生的液体的组分。在一种具体的实施方式中,在确定的时 间间隔后重复该检测步骤,以确定给药后生物利用度的时间进程。在某些实 施方式中,从该时间进程确定RSP组合物(作为一个组)的半衰期。就YFAK 或YEAK而言,免疫应答反应增强或隐退的功能读出的例子是:作为不希 望有的免疫刺激作用指标的TNFa、IL-6、CXCL1、CXCL2和IL-12p70水 平的提高或可测到,作为需要的正向变化指标的II-Ira、CXCL13和CCL22 水平的提高或可测到。采用本领域已知的和易得的技术和材料,不难测定这 些标志的变化。
本发明的某些实施方式促进了各种类生物之间有效剂量的比 较。进行人与实验动物(如小鼠或大鼠)有效剂量的比较,困难不仅在于身 体大小的差异和总体代谢的差异,而且在于已观察到的动物种类之间药物生 物利用度的差异。本发明的一个方面是,RSP组合物的生物利用度与组分肽 和血清蛋白的结合部分相关,这可使半衰期延长和促进某些组织中的分布。 因此,本发明的一些实施方式是测定RSP组合物在受试对象中的合适剂量 的方法,这些方法包括在实验动物模型上测定RSP组合物的第一种合适剂 量,这第一种合适剂量是能给出良好的读出并与RSP组合物在体内与血清 蛋白结合水平相对应的剂量,通过给予受试对象使其体内与血清蛋白结合的 RSP组合物水平与给予实验动物第一种合适剂量所达到的水平相似或相同 的剂量,从而确定RSP组合物的第二种合适剂量。
在具体实施方式中,采用本发明的方法可提高给予RSP组合物 (例如用于治疗或预防治疗对象不希望有的免疫应答反应而采用的YEAK 或YFAK RSP)的效果。一种方法包括给予治疗对象合适剂量的RSP组合物 (如包括YEAK或YFAK RSP组合物),可如下确定这种合适剂量:给予一 种剂量的RSP组合物;取得受试对象的生物样品;使该生物样品与至少一 种捕获多肽(例如选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂 蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白)接触;检测生物样品中捕获多肽的水平; 任选地重复上述所有步骤;及比较测得的水平与预先确定的生物样品中RSP 组合物的合适水平。如上所述根据优良的读出确定合适的剂量。
可采用任何合适的标记物来标记肽,如采用附着的荧光分子、 放射性标记、形成化学偶联物、生物素化、附加表位标签,或任何有利于检 测的分子。上述作为多肽检测剂的血清蛋白可固定在固相支持物上。当血清 蛋白结合于RSP组合物中的一种或多种肽后,可分离得到含有结合于RSP 组合物的捕获多肽的结合复合体。
分离该结合复合体的方法可包括:免疫沉淀、ELISA、免疫检 测或标记捕获多肽的检测。用针对捕获多肽的抗体、针对RSP组合物的抗 体(如抗-YFAK或抗-YEAK多克隆抗体),或用已制备的能识别该结合复合 体的抗体,来进行捕获多肽与RSP结合的检测。
可经皮下、肌肉内、静脉内、鼻内,或通过喷管或粘膜给予RSP 组合物。
在某些实施方式中,用于检测生物样品中含YEAK或YFAK肽 的RSP组合物的组合物,可包含至少一种捕获多肽,该捕获多肽含有选自 α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白 D和前白蛋白的肽。
RSP组合物中特异性肽的选择
本发明的一个方面是在鉴定和/或分离RSP组合物中的肽或肽 亚组的用途。虽然RSP组合物与单种或寡聚特异性肽样品相比的一个优点 是它的异质性,但可以想象组成混合物的肽亚组比其它肽亚组或实际上不需 要的亚组更有效。因此,本发明提供根据肽对某些捕获多肽的亲和力来鉴定 和/或分离含RSP组合物样品中肽的方法,在特别的情况下,所述肽亚组可 包含含有一种或多种不同氨基酸序列的肽。在其他情况下,可利用捕获多肽 根据其结合特异性给RSP组合物中的组分分类。
在某些实施方式中,鉴定结合捕获多肽的肽亚组的方法包括: 按照拟定方案制备RSP组合物,使所述RSP组合物与预先确定的捕获多肽 (如适合作为体内靶标或运载体的多肽)接触,测定RSP组合物中肽的结 合,鉴定能区分结合肽与未结合肽的特征;制备能反映一种或多种特性差异 的改进的RSP组合物。
在某些实施方式中,使含RSP组合物的样品与捕获多肽接触, 分离并鉴定与捕获多肽结合的RSP组合物所含的肽。在某些实施方式中, 所述RSP组合物是YFAK RSP组合物,在一具体实施方式中,所述混合物 是PI-2301。在其他实施方式中,所述RSP组合物是YEAK RSP组合物,在 一具体实施方式中,所述混合物是Copl。在某些实施方式中,使RSP组合 物与至少一种作为捕获多肽的血清蛋白接触。在更具体的实施方式,所述血 清蛋白选自捕获多肽α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂 蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白。
可将捕获多肽固定在固相支持物上,和/或可用本领域已知的方 法进行标记。固定和标记可用于进一步的分离捕获多肽结合的肽,和/或测 定所分离肽的特性。这些特性可包括结合肽的氨基酸序列、结合肽中各氨基 酸的相对比例、氨基酸序列中带电残基的构象和布局、肽的结构、电荷或任 何其他合适的特性。
也可利用RSP组合物与血清蛋白的结合来鉴定RSP组合物中的 生物可利用肽,例如,在受试对象中包括YFAK或YEAK肽的生物可利用 肽。可将该DSP组合物在第一时间给予受试对象,然后在给予后的第二时 间取得患者的组织样品,鉴定组织样品中与至少一种捕获多肽(例如包括选 自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋 白D和前白蛋白的肽)结合的肽。
改进的RSP组合物制备
本发明的另一方面是改进含RSP组合物的组合物制备工艺的方 法。在某些实施方式中,根据鉴定结合捕获多肽的肽亚组的上述方法进行 RSP组合物设计。在一些实施方式中,将RSP组合物设计成其氨基酸组成 和/或氨基酸序列接近结合捕获多肽的肽亚组。
在某些实施方式中,制备毒性减弱的RSP组合物(例如包含 YEAK或YFAK肽)的方法包括:使该RSP组合物与至少一种捕获多肽(例如 包含选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、 载脂蛋白D和前白蛋白的肽)接触;分离混合物中与捕获多肽结合的肽;检 测分离的肽的特性;和制备具有分离肽特性的一组肽。
类似地,制备疗效提高的RSP组合物(例如包含YEAK或YFAK 肽)的方法可包括:使RSP组合物与至少一种捕获多肽(包含选自α-1-抗胰蛋 白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白 蛋白的肽)接触;分离混合物中与捕获多肽结合的肽;检测分离的肽的特性; 和制备具有分离肽特性的一组肽。
在一些实施方式中,利用预定规模的固定的捕获多肽,获得所 需的RSP组合物亚组。可按前面的预期和描述,制备RSP组合物,使其接 触与所需改进有关的固定的捕获多肽。洗涤样品去除未结合的肽,利用适当 的解离条件,如改变pH、盐浓度或加入有机溶剂,洗脱RSP组合物中的结 合肽部分。适当处理合并的结合肽部分,例如通过蒸发或通过合适的层析或 结晶或其他纯化方法进一步纯化,浓缩和去除治疗上不需要的组分。如此制 备的RSP组合物可用作治疗剂。
另外,本发明的这一方面可与上述剂量和给药的改进方法联用。 当制备更好的定制RSP组合物时,预计可相应地调整剂量和给药方式。因 此,在另一可替代的实施方式中,所述方法包括:按照拟定方案制备RSP 组合物;配制包含RSP组合物的组合物;通过检测功能性读出的水平或程 度确定所述组合物中RSP组合物的生物可利用量;对这种读出与标准读出 进行比较;及调整所述拟定方案或组合物配方,以获得所需生物利用度。
治疗剂的组织特异性靶向
RSP组合物与血清蛋白之间的关系的另一种潜在用途是治疗剂 的组织特异性靶向。在一种实施方式中,靶向治疗对象靶组织的治疗剂的制 备方法可包括:提供RSP组合物(例如包含YEAK或YFAK肽);和将治疗 剂与RSP组合物偶联,形成偶联药物。
因此,本发明一些实施方式是通过分离标记肽将治疗剂递送到 治疗对象特定组织的方法,该方法包括:使RSP组合物(例如包含YEAK或 YFAK肽)与组织特异性肽(例如包括选自α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、 α-1-B-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白的肽)接触;分离 混合物中与该组织特异性肽结合的肽;将该标记肽与治疗剂偶联;和将该偶 联药物给予治疗对象。
本发明的其他实施方式,包括含有偶联于标记肽的治疗剂的偶 联物的制备方法,及所得的偶联物本身。本说明书预期的这种标记肽可以是 例如YEAK或YFAK肽。根据对α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I、α-1-B- 糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白的结合亲和力,从RSP组 合物中可分离得到这样的肽。
治疗剂可以是有机小分子或生物大分子,特定组织可以是脑、 肺或肝组织。此种标记肽可包括YEAK或YFAK肽。标记肽与治疗剂的偶 联可通过共价键、包络物、离子键或氢键。可用于实施本发明的治疗剂的例 子是抗肿瘤药物(包括抗代谢物)、细胞因子和生长因子抑制剂、激酶抑制 剂、血管生成抑制剂、消炎剂、疾病特异性抗体、疫苗和抗生素。
本说明书采用的标准免疫学、生物化学和分子生物学方法是本 领域已知的。例如,标准方法的示范例子可见于John Wiley和Sons出版的“当 代方案”系列丛书及迄今的所有更新版,此丛书包括分子生物学、免疫学、 细胞生物学、蛋白质化学、药理学和其他科学的当代方案。本说明书引用的 所有参考文献、专利和专利申请全部纳入本说明书作为参考。
实施例
实施例1.检测正常人血清中的PI-2301和Cop-1
制备浓度500ng/mL的RSP组合物PI-2301(YFAK)或Cop-1 (YEAK),用含5%正常人血清的PBS稀释为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL 或12.5ng/mL,加入正常人血清中。通过加入兔抗-YFAK或兔抗-YEAK抗 体,检测正常人血清中所含有的RSP组合物与血清蛋白的结合。
于室温下,用PBS/0.1%吐温封闭未包被的ELISA平板2小时。 用含5%正常人血清的PBS作PI-2301或Cop-1样品的系列稀释,加入已封 闭和洗涤的ELISA平板孔中。使正常人血清中的PI-2301或Cop-1与平板 结合,用PBS/0.05%吐温20洗涤除去未结合的PI-2301或Cop-1。根据滴定 度将用A蛋白纯化的兔抗-YFAK或兔抗-YEAK抗体稀释到合适的浓度,加 入平板室温反应1小时。经另一洗涤步骤除去未结合的兔抗PI-2301或兔抗 -Cop-1抗体后,在孔中加入第二抗体:山羊抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶 偶联的抗兔IgG抗体)。洗涤除去任何未结合的第二抗体后,在孔中加入HRP 的底物液,培育15分钟,加入终止液时产生兰色进而变成黄色时,显色的 强度与孔中PI-2301或Cop-1的含量相关。用ELISA平板读数仪检测450nm 光密度,分别产生加入标准PI-2301或Cop-1的每组血清样品的滴定曲线。 血清PI-2301或血清Cop-1浓度检测的极限定义为导致A450nm吸光度高 于背景三倍时的浓度。将用于检测背景的ELISA平板孔按如上所述进行处 理,除了省略RSP组合物中的肽外。
将结果绘成图2。X-轴为RSP组合物的浓度。Y轴显示HRP 偶联第二抗体的A450比色吸光度。在RSP组合物浓度较高时,用抗PI-2301 或抗Cop-1抗体测得偶联物(浓度)高于较低浓度的RSP组合物。在病人 中12.5ng/mL浓度对应于大约2mg剂量。
实施例2.在柱上捕获复合体
制备固定的RSP组合物的方法是,用溴化氰法使RSP组合物 中的肽与溴化氰活化的琼脂糖珠Sepharose(用于固定含伯胺配体(蛋白质、 肽、核酸)的预先活化的大孔层析介质)进行反应。简言之,称取所需量的 冻干CNBr-Sepharose凝胶珠,用冷的ImM HCI(每g冻干Sepharose珠用 大约200mL 1mM HCI)洗涤15分钟10次,然后用偶联缓冲液洗2次。将 配体溶于偶联缓冲液中至所需浓度,以1∶2比例与CNBr-Sepharose凝胶 珠混和(1体积配体与2体积洗过的CNBr-Sepharose凝胶珠),然后在摇动 平台上4℃培育过夜。封闭凝胶上的残留活性位点,洗涤除去过量的配体。 为纯化配体特异性蛋白,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤偶联的凝胶后,以 1∶2比例(1体积试剂与2体积洗过的CNBr-Sepharose凝胶珠)加入所需的 试剂(血清、细胞上清液),在摇动平台上4℃培育过夜。将凝胶/试剂浆液 填充入一次性使用的柱子中,洗涤除去未结合配体,然后用低pH缓冲液洗 脱得到配体特异性蛋白质。将pH调到中性后,读取洗脱流份的280nm吸 光度以鉴定含配体的流份。洗涤该柱子后4℃贮藏供重复使用。
实施例3.结合于PI-2301或Cop-1的蛋白质的鉴定
用实施例1或实施例2的方法获得含PI-2301结合蛋白或Cop-1 结合蛋白的样品。用酶消化这些样品后作液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分 析,目的是鉴定结合PI-2301或Cop-1的蛋白质。简言之,用序列特异性蛋 白酶胰蛋白酶消化一等份的各样品。消化后用LC-MS/MS分析蛋白肽混合 物。根据分析柱中相对于释放相的滞留然后在质谱仪中雾化,分离这些肽。 雾化过程中,肽获得+2或+3电荷,质谱仪监测质量充电比率。如果某肽有 显著的质量充电比率,然后使之与气体碰撞而分裂成片段并记录该片段的模 式。可将这些片段模式与所有已知蛋白的理论片段模式作比较。此实验片段 模式与理论片段模式的比较导致从HDL和LDL复合体中鉴定到几种脂蛋 白。在PI-2301样品和Cop-1样品中均发现有这些脂蛋白。Cop-1样品中还 有一些独特的蛋白,包括补体蛋白如C3和C4A。
图3概括了用对PI-2301或Cop-1的结合鉴定的正常小鼠血清 或正常人血清中的血清蛋白。PI-2301可以是乙酰化或非乙酰化蛋白质。获 得样品蛋白质的方法与实施例1相似,其中将RSP组合物的肽混合,使之 结合血清中的组分。用抗-YFAK或抗-YEAK抗体识别PI-2301或Cop-1的 结合复合体,并用第二抗体和检测试剂进行检测。将血清蛋白质从复合体上 洗脱并加以鉴定。根据检测试剂的A450nm吸光度对蛋白质进行评分。与背 景吸光度相比,70分对应的p值<0.001,被认为具有统计学显著意义。
实施例4.比较不同长度和不同批次RSP组合物的肽组成
合成不同的DSP组合物(例如用固相合成或液相合成法)后, 可检测用相同制备方法制得的各批次和用不同方法制得的各批次,并用生物 测定法比较它们的变化,如用单核细胞系RAW264.7释放CCL22试验、活 体外细胞增殖试验、检测血清蛋白与RSP组合物所含肽的结合,可以确定 在任何特定处理或批次中存在的肽亚组或甚至各别的肽。比较RSP组合物 的制备方法和批次,以确定不同方法和批次之间同一肽亚组和/或肽的类型 是否相一致。
通过将所选的纯化血清蛋白固定在固体支持物上,制备几种鉴 定用树脂。对于分析Cop-1或PI-2301,所用的血清蛋白可以是实施例1中 所鉴定的那些分别结合Cop-1或PI-2301的蛋白中的一种或几种(见图3)。 经鉴定能结合Cop-1或PI-2301的其他合适蛋白质也可使用。每种固相支持 物含至少一种血清蛋白。如果有一种以上的血清蛋白结合于固相支持物,则 各鉴定树脂之间结合于给定固相支持物的各血清蛋白的比率将是一致的。在 允许Cop-1或PI-2301肽的一个亚组结合于血清蛋白的条件下,取各批Cop-1 或PI-2301一等份加入其各自固相支持物中。洗涤除去未结合肽后,洗脱得 到结合的肽。对这样分离得到的Cop-1肽进一步作特性分析:(1)是否存在独 特的Cop-1肽,(2)各肽之间的相互比例,(3)能结合血清结合蛋白的肽占整 个RSP组合物的比例,(4)是否存在结合基序和结合肽序列,(5)氨基酸组 成和各氨基酸的比例,和/或其他肽的特性。互相比较每批分离得到的Cop-1 肽的特性。
机译: “通过基于血清蛋白的随机序列聚合物组合物检测来改善随机序列聚合物组合物的设计,生物利用度和功效的方法”
机译: 通过检测基于血清蛋白的随机序列聚合物组合物改善随机序列聚合物组合物的设计,生物利用度和有效性的方法
机译: 通过基于血清蛋白的随机序列聚合物组合物检测来改善随机序列聚合物组合物的设计,生物利用度和功效的方法