一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及其在农药马拉硫磷降解中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

    羧酸酯酶（Carboxylesterases, E C3.1.1.1）是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三联体结构，Ser，Asp，His构成了羧酸脂酶的催化活性中心（Nardini, M, et al., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9(6):732-737.）。

羧酸脂酶广泛存在于动物、植物、微生物中(Melloney J., et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.)，其中微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等上有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos Tombo, et al., Agricultural and Biological Chemistry. 1987, 51:1833-1838.）。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景（Jaeger K.E., et al., Trends in Biotechnology. 1998, 16(9):396-403.）。

当前农业生产中，70%使用的农药是有机磷农药，而70%的有机磷农药又是高毒农药，这些农药的使用很容易在农产品中残留，进而影响到人的健康。

利用微生物降解农药残留大多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及其在农药马拉硫磷降解中的应用。

本发明的重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法如下：

1）大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌以0.1%的接种量接种于LB培养液中，37 ℃快速振荡12 h，然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50 μg/mL Kan和0.5%（w/v）α-乳糖）诱导培养液中，振荡培养16 h，12000 rpm离心5 min，收集菌体；用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于冰水混合物下超声波破碎菌体，以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清液用Nickel-NTA  Agarose来纯化目的蛋白；

2）纯化：

将2 mL的Nickel-NTA  Agarose装到空柱子中，用以下缓冲液，pH均为7.0：

NTA-0：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-20：20mM Tris-HCl，20mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-40：20mM Tris-HCl，40mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-60：20mM Tris-HCl，60mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-80：20mM Tris-HCl，80mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-100：20mM Tris-HCl，100mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-200：20mM Tris-HCl，200mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-300：20mM Tris-HCl，300mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-500：20mM Tris-HCl，500mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

纯化步骤为：

（1）20 mL的水平衡；

（2）20 mL的NTA-0平衡；

（3）加样品2 mL；

（4）收集穿透峰；

（5）分别用2 mL的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-300、NTA-500依次洗脱，并分别收集洗脱液；

（6）将洗脱液分别以β-乙酸萘酯为底物进行酶活测定（进而确定纯化条件，为大批量的目的蛋白的纯化做准备）；

（7）纯化后的酶液通过酶活测定和蛋白质电泳鉴定后，-20℃保存备用；

羧酸酯酶D-1CarE5氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2。构建羧酸酯酶D-1CarE5工程菌所用的载体为pET28a(+)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。羧酸酯酶D-1CarE5可得自嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）。

SDS-PAGE结果（图1）表明，重组羧酸酯酶D-1CarE5在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

本发明的重组羧酸酯酶D-1CarE5以β-乙酸萘酯为底物测定其酶学性质：最适温度为60 ℃，最适pH为7.0，在温度37 ℃和pH7.0条件下保温50 min酶活力基本保持稳定，金属离子Pb²⁺和Mg²⁺有激活作用，Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺和Ag⁺等有较强的抑制作用，酶促动力学参数测定Km和Vmax值分别为2.64 mM和1.7 U/mg。

羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，其对含有羧酸酯键的有机磷化合物，如马拉硫磷，羧酸酯酶靠活性中心丝氨酸的可逆酰化作用来完成降解。这个酰化作用释放出一个醇部分和一个对应的共价酰化酶。这个酰化的中间体由于水的亲核作用释放出对应的羧酸部分和有活性的酶，它可以重新来催化新一轮的降解反应。

本发明的重组羧酸酯酶D-1CarE5对农药马拉硫磷的降解如下：在含有浓度为5.5 mg/L农药马拉硫磷、pH7.0 、1/15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中添加1 U（以β-乙酸萘酯为底物测酶活性）的羧酸酯酶D-1CarE5，总反应体系3 ml，温度37 ℃条件下震荡反应，对终浓度为5.5 mg/L农药马拉硫磷进行降解。

降解效果显示，25 min内就有50%的马拉硫磷被降解，100 min内有89%的马拉硫磷被降解，说明羧酸酯酶D-1CarE5在农药残留或农药污染的治理方面具有较好的效果。 

本发明来源于嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）的羧酸酯酶D-1CarE5在大肠杆菌中进行异源表达，经过α-乳糖诱导一步培养就可以获得大量可溶性蛋白，通过Nickel-NTA  Agarose一步纯化即可获得较纯蛋白，并具有优良的酶学性质。对农药马拉硫磷降解研究发现加入1 U羧酸酯酶D-1CarE5在25 min内就有50%的马拉硫磷被降解，这与已报道昆虫来源的羧酸酯酶（Wensheng Lan, Jian Chong, Hong Jiang, et al. Biotechnol Lett, 2005, 27: 1141-1146）对农药马拉硫磷的降解效率高。说明该酶在农药残留或农药污染治理方面具有潜在应用前景。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶D-1CarE5的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2，3，4，5：依次为NTA-500，NTA-300，NTA-200，NTA-100纯化洗脱的重组羧酸酯酶D-1CarE5。

图2：重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适温度。

图3：重组羧酸酯酶D-1CarE5的热稳定性。

图4：重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适pH。

图5：重组羧酸酯酶D-1CarE5的pH稳定性。

图6：不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D-1CarE5活性的影响。

图7：重组羧酸酯酶D-1CarE5 1/[S]与1/V的关系。

图8：农药马拉硫磷的标准曲线。

图9：重组羧酸酯酶D-1CarE5对农药马拉硫磷的降解曲线。

具体实施方式

实验材料和试剂

1、羧酸酯酶D-1CarE5可得自嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504），羧酸酯酶D-1CarE5氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2。构建羧酸酯酶D-1CarE5工程菌所用的载体为pET28a(+)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，购于Novagen公司。

2、生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；坚固蓝B和马拉硫磷标准品均购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。

3、培养基：

LB培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化钠1%，pH自然（约为7.0）。诱导培养基在此基础上加0.5%（w/v）α-乳糖。

重组羧酸酯酶D-1CarE5工程菌的构建：

羧酸酯酶D-1CarE5可得自嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504），羧酸酯酶D-1CarE5氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2。构建羧酸酯酶D-1CarE5工程菌所用的载体为pET28a(+)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。具体方法如下：

提取嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA：CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养12 h的新鲜菌液离心取菌体，加入800 μL溶液Ⅰ（ 20 mM Tris, pH8.0, 2 mM Na₂-EDTA, 终浓度20 mg/mL溶菌酶），37 ℃保温30 min，加100 μL 10% SDS上下颠倒混匀，再加10 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，37 ℃保温30 min，加150 μL 5 M NaCl和150 μL 10% CTAB溶液上下颠倒混匀，65 ℃保温20 min，分装成600 μL每管，再加入600 μL酚/氯仿/异丙醇（体积比25：24：1）进行抽提，在4 ℃下12000 rpm离心10 min，取上清300 μL于300 μL氯仿/异丙醇（体积比24：1）中再次抽提除去杂蛋白，4 ℃下12000 rpm离心10 min，再取上清并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5.2 3 M NaAc，-70℃沉淀1h，4 ℃下13500 rpm离心20 min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20 ℃备用。

根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因D-1CarE5并设计表达引物CarF和CarR：

上游引物CarF: 5’ CGCGGATCCATGCAAAGCATGCTGCGG 3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）

下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGGAAAATGTACTGTTTTTGCTTAAAG 3’ （划线部分为XhoⅠ酶切位点）

上游引物T7: 5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

下游引物T7ter: 5’TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’为PCR检测阳性克隆子引物。

     以嗜热脂环酸芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 sec；52 ℃退火30 sec；72 ℃延伸1 min30 sec；30个循环后72 ℃保温5 min。 PCR纯化产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-28a(+)连接构建质粒pET-D-1CarE5，4 ℃过夜。取10 μl连接产物pET-D-1CarE5转化到100 μl Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含Kan的LB固体平板上，37 ℃温箱培养13 h，从转化板上挑取几株单菌落，使用引物（T7，T7ter）进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌。

重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备：

取大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50 μg/mL Kan）培养液中，37 ℃快速振荡12 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50 μg/mL Kan和0.5%（w/v）α-乳糖）诱导培养液中，振荡培养16 h。12000 rpm离心5 min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清用于纯化目的蛋白。具体，将破壁后收集的上清液采用Nickel-NTA  Agarose来纯化目的蛋白。纯化前，根据装柱说明书将2 mL的Nickel-NTA Agarose装到空柱子中，并准备以下缓冲液（pH均为7.0）：

NTA-0：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-20：20mM Tris-HCl，20mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-40：20mM Tris-HCl，40mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-60：20mM Tris-HCl，60mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-80：20mM Tris-HCl，80mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-100：20mM Tris-HCl，100mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-200：20mM Tris-HCl，200mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-300：20mM Tris-HCl，300mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

NTA-500：20mM Tris-HCl，500mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；

纯化步骤为：

（1）20 mL的水平衡；

（2）20 mL的NTA-0平衡；

（3）加样品2 mL；

（4）收集穿透峰；

（5）分别用2 mL的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-300、NTA-500依次洗脱，并分别收集洗脱液；

（6）将洗脱液分别以β-乙酸萘酯为底物进行酶活测定，进而确定纯化条件，为大批量的目的蛋白的纯化做准备；

（7）纯化后的酶液通过酶活测定和蛋白质电泳鉴定后，-20℃保存备用。

SDS-PAGE结果（图1）表明，重组羧酸酯酶D-1CarE5在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE5的性质测定

1、重组羧酸酯酶D-1CarE5的活性分析

纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE5的活性测定方法采用β-萘酚法：取三支10 ml试管，分别编号1、2、3，1号和2号试管为实验组，3号为对照组。分别向1号和2号试管中加入2.5 ml 1/15mol/L pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，向3号试管中加入3 ml 1/15mol/L pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。向三支试管中加入30 μl底物β-乙酸萘酯醇溶液，置于37 ℃水浴锅中预热5 min，然后向1号和2号试管中加入0.5 ml适当稀释的酶液，反应5 min后，立即在每支试管中加入0.5 ml显色剂（1%坚固蓝B盐水溶液和5% SDS使用前2：5混合）溶液终止反应，充分摇匀后，静置5 min-10 min后，在分光光度计550 nm下测定其吸光度值。1个酶活单位（U/mL）定义为一定条件下，每分钟分解底物β-乙酸萘酯生成1 μmoL β-萘酚所需要的酶量。

2、重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适温度和热稳定性的测定：

    酶的最适温度的测定：将羧酸酯酶D-1CarE5在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下，分别在12 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃和80 ℃下进行酶促反应。温度稳定性的测定：将羧酸酯酶D-1CarE5在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下，在37 ℃、60 ℃和70 ℃三个温度下分别保温10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以β-乙酸萘酯为底物，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D-1CarE5的酶学性质。结果表明：D-1CarE5的最适温度60 ℃（图2）。酶温度稳定性研究：在37 ℃保温50 min内残余酶活在80%以上；在60 ℃下保温50 min残余酶活不到40%；在70 ℃下的耐受10min残余酶活33%（图3）。

3、重组羧酸酯酶D-1CarE5的最适pH和 pH稳定性的测定：

酶的最适pH的测定：将羧酸酯酶D-1CarE5在最适温度60 ℃，分别在1/15 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液不同pH4.8、5.4、6.0、6.5、7.0、7.3、7.5和8.0条件下酶促反应。pH稳定性的测定：将羧酸酯酶D-1CarE5在最适温度40℃，在pH5.4、pH7.0和pH7.5下分别耐受10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以β-乙酸萘酯为底物，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D-1CarE5的酶学性质。结果表明：D-1CarE5的最适pH7.0（图4）；酶稳定性研究在pH7.0耐受50 min残余酶活在80%以上（图5），说明该酶在中性环境中比较稳定。

    4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D-1CarE5活性的影响：

在酶促反应体系中加入终浓度1 mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以β-乙酸萘酯为底物，在60 ℃、pH7.0条件下，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D-1CarE5的酶活力。结果（图6）表明，终浓度1 mM的金属离子Pb²⁺和Mg²⁺对酶有激活作用，Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺和Ag⁺等有较强的抑制作用。

5、重组羧酸酯酶D-1CarE5的动力学参数的测定：

在60 ℃、pH7.0条件下，以0.6 M β-乙酸萘酯为底物，依次在酶促反应的 1-30 min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1-0.95 mM β-乙酸萘酯为底物（[S]），在60 ℃、pH7.0和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度（ν），如图7，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在60 ℃、pH7.0条件下，重组羧酸酯酶D-1CarE5对β-乙酸萘酯的Km和Vmax分别为2.64 mM和1.7U/mg。

纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE5对农药马拉硫磷的降解应用：

取纯化重组羧酸酯酶D-1CarE5 1mL（以β-乙酸萘酯为底物测得酶活单位为1U）加入到含有浓度为5.5 mg/L农药马拉硫磷的1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为3 mL，37 ℃震荡反应，对照组不加酶液，以1 mL pH7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液代替酶液。每20 min取出0.5 mL反应液与等体积正己烷混合震荡，12000 rpm离心2 min，取上层抽提液加入0.2 g无水硫酸钠除水，12000 rpm离心30 sec，取抽提液于气相色谱上定量分析。

色谱分析所用仪器为Agilent GC7890-MS5975型气相色谱（美国），检测器为FID，柱子为Agilent DB-17（30 m×0.32 mm×0.25 μm），操作条件：进样量1 μl，不分流，进样口温度250 ℃，He压力16.363 psi，柱流量1 mL/min，离子源230 ℃，MS四级杆150 ℃；柱箱程序升温：205 ℃（保持2.5 min），以10 ℃/min的速度上升至220 ℃，保持2 min，总时间6 min。

分别配制不同浓度梯度的农药马拉硫磷标准品，根据以上色谱分析方法分析，积分计算不同浓度下的峰面积，每个浓度重复3次，计算峰面积平均值，以农药马拉硫磷浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标做马拉硫磷标准曲线（图8）。并测定和计算其检测限为0.1 mg/L，方法回收率为84%-92%。

羧酸酯酶D-1CarE5对农药马拉硫磷的降解结果（图9）表明，在上述条件下，25 min内就有50%的马拉硫磷被降解，100 min内有89%的马拉硫磷被降解。

SEQ ID NO.1：

Met Gln Ser Met Leu Arg Val Val Lys Val Glu Asn Gly Phe Val Arg Gly Leu Pro Ala        

1              5               10               15               20

Ala Asp Pro Arg Ile Thr Ser Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Pro Val Gly Glu Asn

              25              30              35               40

Arg Trp Arg Ala Pro Gln Pro Ala Lys Asp Trp Asp Gly Val Phe Asp Ala Tyr Thr Phe

          45               50                55              60

Ala Pro Ile Ser Met Gln Ser Pro Ile His His Asn Glu Ser Asn Ile Tyr Gly Arg Glu Trp

         65               70               75              80

His Val Asp Pro Asp Thr Pro Met Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Thr Pro

       85               90                95              100

Ala His Ser Pro Asp Glu Lys Leu Pro Val Phe Val Trp Tyr Phe Gly Gly Gly Leu Gln

      105               110             115              120

Val Gly Tyr Thr Ser Glu Met Glu Phe Asp Gly Glu Arg Leu Ala Arg Arg Gly Ile Val

      125              130               135              140

Val Val Thr Val Asn Tyr Pro Leu Asn Val Phe Gly Phe Leu Cys His Pro Glu Ile Thr

145              150              155               160

Ala Glu Ala Pro Glu Ala Pro Ala Asn Phe Gly His Leu Asp Gln Gln Phe Ala Thr Gln

165             170               175              180

Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Glu Asn Ile Thr Ile Gly Gly Gln

      185              190              195             200

Ser Ala Gly Gly Gly Ser Val Leu Ser Gln Leu Thr Ser Pro Gln Asn Glu Gly Leu Val

   205              210              215              220

Gln Arg Ala Ile Ile Gln Ser Gly Leu Phe Gly Arg Val Tyr Pro Gly Gly Arg Met Pro

   225             230              235              240

Gly Tyr Gly Arg Thr Leu Ala Glu Ala Glu Ala Asp Gly Met Gln Phe Phe Ala Phe Leu

245              250              255               260

Gly Val Ser Ser Leu Ala Glu Ala Arg Gln Leu Asp Ala Phe Tyr Ile Arg Asp Lys Ala

265              270              275             280

Leu Asp Tyr Lys Gly Phe Trp Gly Thr Val Val Asp Asp Val Phe Cys Met Gly Asp Gly                285               290             295               300

Phe Asp Leu Phe Val Glu Gly Lys His Leu Gln Val Ser Val Leu Phe Gly His Thr Ser

305               310              315              320

Asp Glu Phe Tyr Ser Ala Pro Asn Val Lys Asp Leu Asp Glu Leu Lys Gln Met Ala Val

   325              330               335              340

Glu Arg Phe Gly Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Leu Cys Glu Ala Asp Ala His Asp

   345               350              355              360

Phe Glu Asp Val Leu Lys Lys Ala Thr Leu His Ser Leu Glu Phe Ala Ile Arg Thr Ala

   365               370              375              380

Val Gln Ala Ser Ser Asn Trp Lys Thr Gln Glu Pro Leu Tyr Tyr Tyr Val Phe Asp Ala

   385              390              395              400

Glu Ile Pro Gly Trp Asp Gln Pro Gly Ala Phe His Ser Val Asp Leu Trp Phe Phe Phe                405              410               415               420

Glu Thr Leu Ala Lys Cys Trp Arg Pro Phe Val Gly Lys His Tyr Asp Leu Ala Arg Gln            425               430              435               440

Met Cys Asp Tyr Trp Ala Asn Phe Ile Arg Ser Gly Asp Pro Asn Gly Lys Asp Met Thr

   445               450             455               460

Gly Glu Asp Leu Pro Pro Trp Tyr Pro Cys Thr Pro Asp Ala Pro Tyr Ala Met Val Phe

465              470              475              480

Asp Asp Glu Pro Lys Phe Val Arg Gln Glu Pro Ser Pro Leu Met Gln Phe Phe Val Gln

485               490              495              500

Glu Tyr Phe Lys Gln Lys Gln Tyr Ile Phe

   505               510                   

SEQ ID NO.2：

1      atgcaaagca  tgctgcgggt  cgtgaaggtc  gagaacggtt  tcgttcgggg  gctcccagca   

61     gccgaccctc  gcattacaag  ctttaagggc  attccctttg  cagctccgcc  agtcggcgaa   

121    aatcgctggc  gagctcccca  gcccgcaaag  gactgggacg  gcgtattcga  cgcttataca    

181    ttcgcaccga  tttccatgca  atcacccata  caccacaacg  aaagcaacat  ctatggtcga   

241    gagtggcatg  tcgatccgga  tactcccatg  agtgaggatt  gtctctatct  caacatctgg   

301    acgccggcac  acagccctga  cgaaaagctt  cccgtgtttg  tttggtattt  cggtggcgga   

361    ttgcaggtcg  gttacacatc  tgaaatggag  tttgacggcg  aacgcctcgc  gcgccgagga   

421    atcgtcgtgg  ttaccgtcaa  ctatcccctc  aacgtgtttg  gttttttgtg  tcatccggag   

481    attaccgcag  aagcccccga  agctccggct  aattttggac  atctcgatca  acagtttgcg   

541    acacaatggg  tcaagcgcaa  tatcgctgca  ttcggcggcg  atccggagaa  catcacgatt   

601    ggtggccaat  ccgctggcgg  tggaagtgta  ttaagccaac  tcacatctcc  ccagaacgaa   

661    gggctcgtac  aaagggcaat  tatccaaagt  ggactgtttg  gcagagttta  tcccggcggt   

721    cgtatgccag  gttatgggag  aacactggcg  gaagctgaag  cggacggaat  gcaattcttt   

781    gcgtttcttg  gcgtatcctc  cttggccgaa  gcccgccagc  tcgacgcttt  ttacatccgt   

841    gacaaagcgc  tcgactataa  gggcttctgg  gggactgtcg  tggatgacgt  attctgcatg   

901    ggtgacggat  ttgatctctt  tgtcgagggt  aaacatttac  aggtctccgt  gctttttggt   

961    cacacgtctg  acgaatttta  cagcgcccca  aacgtcaaag  atttagatga  attgaagcaa   

1021   atggccgtcg  aacgttttgg  tgatgatgcc  gcaacatatc  ttgcgctttg  cgaagcggat   

1081   gcacatgatt  tcgaagacgt  tctgaaaaaa  gccacactcc  attccttgga  gtttgccatt   

1141   cgcaccgccg  tgcaagccag  tagcaactgg  aagacgcaag  aaccattgta  ctattacgta   

1201   ttcgatgcag  aaattccggg  gtgggatcag  ccaggggcct  ttcattcggt  tgatctgtgg   

1261   tttttcttcg  agactctggc  taagtgttgg  cggccgtttg  tcggaaaaca  ttacgacttg   

1321   gctcgccaaa  tgtgcgatta  ctgggccaac  ttcatccgtt  ctggagatcc  aaatgggaaa   

1381   gatatgacgg  gtgaagattt  gccaccctgg  tatccctgca  cacccgatgc  gccatacgcc   

1441   atggtattcg  atgacgagcc  caaatttgtc  cgacaagaac  caagtcctct  tatgcagttc   

1501   ttcgtgcaag  agtactttaa  gcaaaaacag  tacattttct  ga