建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法

发明领域

本发明属于生物技术病毒检测技术领域，具体的说，本发明具体涉及一种环介导等温扩增(LAMP)技术检测李属坏死环斑病毒(PNRSV)的技术领域。 

背景技术

目前对病毒核酸的分子检测多采用基于PCR反应的各类技术，如常规PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，不仅需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等昂贵的仪器设备，且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。 

环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，具有特异性强、操作简单、不需要复杂的仪器，肉眼可直接观察检测结果，其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点非常适合于基层及现场使用；该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增；最近几年已开始应用于生物致病病原的检测。此前，已有应用在肺炎链球菌、西尼罗病毒、SARS病毒、番茄黄叶病毒、山药嵌纹病毒、肺炎支原体等病原微生物的检测以及登革病毒的分型等方面的报道，日前，尚未见利用LAMP技术检测李属坏死环斑病毒的报道。 

李属坏死环斑病毒(PNRSV)是《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中二类危险性检疫对象，也是世界上许多国家进口的检疫对象。PNRSV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)，粒体形态为等轴对称多面体，直径约为22-23nm，有三种大小的粒子。PNRSV是 正单链的RNA病毒，核酸大小为8.056kb，为三分体线形。PNRSV通过种子及苗木等无性繁殖材料进行远距离传播，还可以经花粉、虫媒、嫁接、机械接种等迅速传播蔓延。PNRSV可侵染扁桃、樱桃、桃、李、杏等多种果树和西(甜)瓜、棉花、向日葵、菜豆、啤酒花等21个科、47个属189种植物，具有寄主范围广泛、侵染传播力强、危害严重、检疫和防控难度大等特点。果树一经感染便终生带毒、逐年加重、持久危害，引起叶片坏死环斑和穿孔，果实畸形，品质下降，腐烂加快，树体急剧衰退，提早枯死，一般可造成30％～70％的产量损失，严重的可导致树皮坏死、癌肿直至整株绝产、枯死，为果树生产中的一种毁灭性病害。目前该病害的发生已遍及欧洲、亚洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多个温带国家和地区。在中国PNRSV目前还仅限于个别地区发生。 

发明内容

目前针对现有技术中未见专门针对环介导等温扩增(LAMP)技术检测李属坏死环斑病毒的技术现状，本发明旨在提供一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。 

本发明通过以下技术方案实现的：本发明根据PNRSV分离物CP基因的保守序列，设计了PNRSV RT-LAMP特异性引物，确定反应条件和试剂浓度并进行优化，建立了PNRSV的RT-LAMP快速检测体系，此方法对PNRSV的检测特异性强，2h即可获得检测结果，具有快速、高效、简易的特点。 

本发明提供了一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： 

(1)提供一套用于检测李属坏死环斑病毒的LAMP反应特异性引物序列，具体的寡聚核苷酸序列为： 

F3：AATCATACCCACGCTGGTG 

B3：AATTCGGGGAGGCACATTC 

FIP：TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCG 

BIP：TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT 

(2)提供李属坏死环斑病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增。 

(3)最后根据反应混合物的浊度对检测结果进行判断。 

本发明具体提供了一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： 

(1)设计用于检测李属坏死环斑病毒的的LAMP引物：根据现有技术报道及GenBank中公布的PNRSV分离物的CP基因保守序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4设计1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，引物序列如下(5′-3′)： 

F3：AATCATACCCACGCTGGTG 

B3：AATTCGGGGAGGCACATTC 

FIP：TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCG 

BIP：TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT 

(2)植物总RNA的提取：取0.1g新鲜植物叶片或幼嫩枝条在液氮中研磨至粉末，采用RNAplant plus Reagen试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70℃保存备用。 

(3)逆转录：以提取的植物总RNA为模板，反转录合成cDNA序列。20μL的反转录体系为RNA模板2μL，10mmol/L的dNTP 1μL，50μmol/L的OligodT 1μL，DEPC-ddH₂O 10μL，65℃下处理5min，冰上放置5min，加 入5×first-strand Buffer 4μL，200U/μL的M-MLV反转录酶1μL，40U/μL的RNA酶抑制剂1μL；反应条件：在30℃放置10min，42℃保温1h，再于95℃反应5min。 

(4)配制LAMP反应体系：反应体系为27uL，各组分的用量为：10×Buffer缓冲液2.5uL，采用步骤(3)的反转录产物cDNA 5.0uL，2.5mmol/L的dNTP6.0uL，10μmol/L的引物F3、B3各0.5uL，10μmol/L的引物FIP、BIP各4.0uL，100μmol/L的Betain 5.0uL，100mmol/L的MgSO₄1.5uL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0uL，同时设置阴性对照。 

(5)通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增：LAMP反应程序：95℃加热5min；冰上急冷3min，再加1.0μL Bst DNA聚合酶，65℃水浴反应1.5h，80℃灭活2min。 

(6)LAMP扩增产物的检测：通过上述步骤扩增结束后肉眼观察反应管浊度的变化；将扩增产物高速离心后观察管底有无焦磷酸镁白色沉淀，如出现白色沉淀即判断检测结果为阳性，即样品中感染有李属坏死环斑病毒，反之则为阴性。 

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果： 

本发明针对目的基因PNRSV的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温65℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30-50％；根据反应管中有无肉眼可见的焦磷酸镁白色沉淀或在产物中加入荧光染料SYBYGreen I，作为判断核酸是否扩增的简单方法；该技术已开始应用于植物检疫、 动物疫病的诊断、动物性别鉴定和转基因食品检测等方面，取得了可喜的成就，显现出广阔的应用前景，具体阐述如下： 

(1)特异性强。所用的特异引物根据PNRSV壳体蛋白基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR。 

(2)检测快捷。从RNA的提取，到检测完毕用时约2h，而RT-PCR需要5h以上，节省检测时间。 

(3)仪器要求简易。不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只要水浴锅或金属浴就能完成检测反应。 

(4)操作简便、结果明显。整个检测过程不涉及复杂仪器或设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰，直接用眼睛观察就得以判断。 

(5)对人和环境安全。避免了常规PCR检测过程使用溴化乙锭等有毒化学药品，对人和环境都较为安全。 

(6)低成本。LAMP检测总成本大大低于现有的PCR检测方法。 

总之，该方法具有比现有技术中报道的普通PCR检测方法更高的特异性、简便易行、快捷等优点。 

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比。 

仪器设备：植物总RNA提取试剂盒，dNTPs购自北京天根生化科技有限公司。反转录试剂盒(BioTeke super RT Kit)购自北京百泰克生物技术有限公司。Bst DNA聚合酶大片段为北京纽英伦NEB生物技术有限公司产品。 

试验材料：以采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测到的含有PNRSV的扁桃叶片为材料，健康扁桃叶片为阴性对照。 

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。 

实施例一：建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法 

建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： 

设计用于检测李属坏死环斑病毒的的LAMP特异性引物 

根据现有技术报道及GenBank中公布的PNRSV分离物的CP基因保守序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4设计1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，引物序列如下(5′-3′)： 

F3：AATCATACCCACGCTGGTG 

B3：AATTCGGGGAGGCACATTC 

FIP：TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCG 

BIP：TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT 

(2)植物总RNA的提取 

取0.1g新鲜感病扁桃叶片或幼嫩枝条在液氮中研磨至粉末，采用RNAplantplus Reagen试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取样品总RNA。抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70℃保存备用。以健康扁桃叶片为阴性对照，且设置已知感染了李属坏死环斑病毒的扁桃叶片为阳性对照。 

(3)逆转录 

已提取的上述植物总RNA为模板，反转录合成cDNA序列。20μL的反转录体系为：RNA模板2μL，10mmol/L的dNTP 1μL，50μmol/L的OligodT 1μL，DEPC-ddH₂O 10μL，65℃下处理5min，冰上放置5min，加入5×first-strandBuffer 4μL，200U/μL的M-MLV反转录酶1μL，40U/μL的RNA酶抑制剂1 μL；反应条件：在30℃放置10min，42℃保温1h，再于95℃反应5min。 

(4)配制LAMP反应体系： 

反应体系为27uL，各组分的用量为：10×Buffer缓冲液2.5uL，按照步骤(3)的反转录产物cDNA5.0uL，2.5mmol/L的dNTP6.0uL，10μmol/L的引物F3、B3各0.5uL，10μmol/L的引物FIP、BIP各4.0uL，100μmol/L的Betain5.0uL，100mmol/L的MgSO₄1.5uL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0uL，同时设置阴性对照。 

(5)通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增： 

LAMP反应程序：95℃加热5min；冰上急冷3min，再加1.0μL Bst DNA聚合酶，65℃水浴反应1.5h，80℃灭活2min。 

(6)LAMP扩增产物的检测：扩增结束后肉眼观察反应管浊度的变化。将扩增产物高速离心后观察管底有无焦磷酸镁白色沉淀。如在被检测样品和阳性对照反应管中均出现白色沉淀，而阴性对照反应管中无白色沉淀，即判断检测结果为阳性，即样品中感染李属坏死环斑病毒；如在被检测样品反应管中出现白色沉淀，而阳性对照管、阴性对照反应管中均未出现白色沉淀，则为假阳性，即样品中未感染李属坏死环斑病毒；如在被检测样品、阳性对照管、阴性对照反应管中均未出现白色沉淀，则为阴性，即样品中未感染李属坏死环斑病毒。 

实施例二：LAMP检测体系的优化 

通过对构建体系的主要影响的三个因素BstDNA聚合酶浓度、cDNA加入量、反应时间长短进行实验、筛选，每个影响因素设置梯度。参见表1。 

表1 Bst DNA聚合酶、cDNA加入量、反应时间梯度 

1.反应时间长短对RT-LAMP扩增结果的影响 

取10个相同的灭菌PCR管，其中5个管设为阴性对照，以等量的DEPC-ddH2O代替cDNA模板，另5个管作为阳性反应管，所有管内均按上述建立的LAMP反应体系，分别添加相应的试剂和模板。密封并混匀后，分别取1个阴性对照管和1个阳性反应管在最适的反应温度条件下，分别扩增30min，45min，60min，75min，90min，105min，最后在80℃反应2min以终止反应。 

通过试验表明，随着反应时间的增加，白色沉淀逐渐增多，当反应时间达到45min时开始出现微弱沉淀，沉淀量在90min反应时间时达到最大，因此，LAMP的适宜反应时间为90min。 

2.cDNA加入量对RT-LAMP扩增结果的影响 

取6个相同的灭菌PCR管，其中1个管设为阴性对照，以等量的DEPC-ddH2O代替cDNA模板；另5个管作为阳性反应管，分别添加2μL，3μL，4μL，5μL，6μL，8μL的cDNA模板，其余试剂均按上述建立的LAMP反应体系分别添加。密封并混匀后，在最适的反应温度及最适反应时间条件下进行扩增，最后在80℃反应2min以终止反应。在本试验条件下，当cDNA加入量达到5μL时出现明显的白色沉淀，cDNA加入量提高到6μL时白色沉淀量并未显著增加。因此，cDNA的适宜加入量为5μL。 

3.Bst DNA聚合酶浓度对RT-LAMP扩增结果的影响 

取6个相同的灭菌PCR管，其中1个管设为阴性对照，以等量的DEPC-ddH2O代替cDNA模板，另5个管作为阳性反应管，分别添加6U/μL，8U/μL，12U/μL，18U/μL，24U/μL，30U/μL的BstDNA聚合酶1μL，并按上述建立的LAMP反应体系，分别添加相应的试剂和模板。密封并混匀后，在最 适的反应温度及最适反应时间条件下进行扩增，最后在80℃反应2min以终止反应。试验结果表明，在BstDNA聚合酶浓度为6U-30U/μL的范围内，30U/μL、24U/μL的反应管内均无沉淀出现，18U/μL时开始出现沉淀，之后随着BstDNA聚合酶浓度减少，沉淀量增加，当浓度为8U/μL时，沉淀量最大。因此，BstDNA聚合酶的适宜浓度为8U/μL。 

综上所述，经优化过后的检测李属坏死病毒的LAMP反应体系为：10×Buffer缓冲液2.5uL，cDNA模板5.0uL，2.5mmol/L的dNTP 6.0uL，10μmol/L的引物F3、B3各0.5uL，10μmol/L的引物FIP、BIP各4.0uL，100μmol/L的Betain 5.0uL，100mmol/L的MgSO₄1.5uL，8U/μL Bst DNA聚合酶1uL。 

实施例三：LAMP检测体系特异性 

按上述实施例一反应体系，同时对健康植株、PNRSV、CMV、PVX、PVY、BBWV进行检测，检验RT-LAMP方法的特异性。以提取的健康植株、感染了PNRSV、CMV、PVX、PVY、BBWV的植物叶片中提取得RNA为检测模板进行RT-LAMP扩增反应，仅在PNRSV反应管中出现了阳性反应，其他反应管均为阴性。结果说明本检测体系特异性强，能够特异性地检测PNRSV，与其它病毒无交叉反应。 

实施例四：PNRSV的RT-LAMP检测结果分析 

以PNRSV阳性样品中提取的RNA为模板，分别用本法和常规RT-PCR进行检测，以健康植物叶片中提取的RNA为阴性对照。经RT-LAMP扩增后出现白色沉淀的PNRSV阳性样品，同时用RT-PCR扩增PNRSV的CP基因，扩增产物进行琼脂糖电泳检测，出现与目标CP基因片段大小相符(460bp)的特异性条带，而阴性对照则无条带出现，与预期结果相符。证明RT-LAMP能够检测出样品中的PNRSV，与RT-PCR的检测结果一致。