一种检测普洱茶或普洱茶提取物中茶多糖的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种普洱茶或普洱茶提取物中茶多糖的检测方法，属于食品分析领域。 

背景技术：

普洱茶原产地主要在云南的思茅地区和西双版纳。随着经济的发展，人们保健意识的增强，普洱茶因其滋味醇厚回甘，陈香独特的优良品质和其对人体的特殊保健功效起全社会的关注和重视，产品深受消费者的青睐。 

现代研究表明茶叶降脂、减肥、降糖等保健功能是多种成分综合作用的结果，其中起主要作用的有两大类物质，一类是多酚类化合物(简称茶多酚)，另一类是脂多糖类化合物(简称茶多糖)。 

试验研究标明，普洱茶中茶多糖的保健作用可能更显著。吴文华等研究普洱茶多糖降血脂功能量效关系结果表明，与高脂对照组比较，低剂量茶多糖组(3组)小鼠血清甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平及AI值没有显著差异。而中、高剂量组(4、5组)小鼠血清TG、TC、LDL-C水平分别下降了40.60％、25.36％、24.38％；40.02％、26.68％、33.59％。同时，HDL-C水平分别提高了73.44％、82.81％。但中、高2个剂量组之间没有明显差异。表明茶多糖抑制高脂饮食小鼠血脂升高可能存在量效关系。吴文华等(2007年)研究了普洱茶中茶多糖和茶多酚降血脂功能比较。结果显示：与高脂对照组相比，茶多糖组(3组)小鼠血清TG、TC、LDL-C水平分别下降了40.60％、25.36％、24.38％，同时HDL-C水平上升了73.44％。而茶多酚组(4组)小鼠血脂以上各项指标均没有统计学差异。表明普洱茶中茶多糖抑制高脂饮食小鼠血脂升高的作用大于茶多酚。 

茶多糖还有显著的降低血糖保健功能。倪德江等研究表明不同茶类多糖对实验型糖尿病小鼠均有极显著的降低血糖作用。在低、中剂量下，乌龙茶、红茶、黑茶、白茶中茶多糖降低血糖的作用明显优于绿茶茶多糖。日本学者清水岑夫也揭示了茶叶中降血糖的有效成分是水溶性的组分复合多糖，即茶多糖。 

由于普洱茶中茶多糖具有良好的保健功效，因此准确测定茶多糖含量对选择 原料和评价提取、纯化工艺非常重要，但却一直困扰着茶多糖的测定。目前，国内外快速测定多糖含量主要是用蒽酮-硫酸法或苯酚-硫酸法。由于普洱茶中含有大量茶红素、茶褐素、茶黄素等色素物质，对茶多糖检测中的显色反应会造成很大干扰，造成检测结果偏高，无法准确得到茶多糖含量。因此，为准确测定普洱茶或普洱茶提取物中茶多糖的含量，尽量减少其他物质的干扰，本发明提供了一种快速检测普洱茶或普洱茶提取物中茶多糖含量的检测方法，该方法可准确测定茶多糖的含量克服了现有技术的缺陷。 

发明内容：

本发明提供一种检测普洱茶或普洱茶提取物中茶多糖的检测方法。 

本发明的检测方法采用紫外分光光度法。 

本发明所述检测方法，采用葡萄糖标准溶液作为对照，配制成不同浓度的标准溶液，用紫外分光光度仪器测定并绘制标准曲线。 

本发明所述检测方法，包括将普洱茶或普洱茶提取物进行处理得到检测液，用紫外分光光度仪器进行检测，得到吸光度数据。 

本发明所述检测方法，包括对所得吸光度数据用标准曲线进行核定计算，得到茶多糖含量。 

因此，本发明的检测方法，包括以下步骤： 

步骤1，配制葡萄糖标准溶液作为对照； 

步骤2，将普洱茶或普洱茶提取物样品经醇沉、酸水解和聚酰胺柱分离，配制成检测液；从而分离茶多糖和色素，使多糖含量的测定结果更准确。 

步骤3，用紫外分光光度法测定标准对照品溶液和检测液的吸光度，绘制标准曲线； 

步骤4，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

其中，步骤1中的葡萄糖标准溶液为D-无水葡萄糖；步骤1中的配制葡萄糖标准溶液包括以下步骤：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定(精确至0.001g)，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。 

步骤2中的将普洱茶样品配制成检测液包括以下步骤： 

取普洱茶2g，置250ml烧瓶中，分别加入10-30ml(优选20ml)沸水浸提2-4次(优选3次)，每次5-20min(优选10min)，合并滤液。加乙醇调整至乙醇 含量60-90％(优选80％)；过滤，用热浓度为60-90％(优选80％)乙醇洗涤滤渣2-4次(优选3次)，20-40ml/次(优选30ml/次)，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加20-80ml(优选50ml)水，加热回流0.5-1.5h(优选1h)，趁热过滤，用60-100℃热水洗涤，合并滤液，定容至100ml。精密吸取5ml提取溶液，加入盐酸溶液，混合液中盐酸的浓度为0.2-1.0mol/L(优选0.5mol/L)，在30-70℃(优选40℃)下水解15-60min(优选30min)，冷却后调pH至中性；将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱(15cm×2cm)中，用60-100℃(优选70-90℃)热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

步骤2中的将普洱茶提取物样品配制成检测液包括以下步骤： 

取普洱茶提取物1g，置250ml烧瓶中，加60-90％(优选80％)乙醇20-80ml(优选50ml)，80-95℃(优选95℃)水浴回流15-60min(优选30min)，趁热滤过，用热60-90％(优选80％)乙醇洗涤2-4次(优选3次)，20-40ml/次(优选30ml/次)，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加20-80ml(优选50ml)水，加热回流0.5-1.5h(优选1h)，趁热过滤，用热水洗涤，合并滤液，定容至100ml。精密吸取5ml提取溶液，加入盐酸溶液，混合液中盐酸的浓度为0.2-1.0mol/L(优选0.5mol/L)，在30-70℃(优选40℃)下水解15-60min(优选30min)，冷却后调pH至中性；将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱(15cm×2cm)中，用60-100℃(优选70-90℃)热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

其中，步骤3中用紫外分光光度法测定包括以下步骤，将葡萄糖标准溶液溶液和检测液分别加入5％的苯酚溶液1.0ml，振摇混匀，加5.0ml硫酸，用微型漩涡混合仪迅速振摇混匀，室温下放置30分钟，以第1管为空白，照中国药典2005年版一部附录VB紫外-可见分光光度法，在487nm波长处测定吸光度。 

其中，步骤3中标准曲线的绘制包括以下步骤： 

分别精密吸取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置10ml具塞试管中，分别加二纯水至1.0ml，各精密加入5％的苯酚溶液(称取2.5g重蒸酚，加水溶解并稀释至50ml，摇匀，即得。)1.0ml，振摇混匀，加5.0ml硫酸，用微型漩涡混合仪迅速振摇混匀，室温下放置30分钟，以第1管为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VB)，在487nm波长处 测定吸光度(在1小时内测定完毕)。以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线。 

本发明所述的普洱茶为任何一种市场上可以购买的普洱茶及其制品，如茶饼，块茶，液体茶饮料，速溶茶等。 

本发明所述的普洱茶提取物为任何一种通过现有技术或新技术对普洱茶进行提取分离得到的普洱茶提取物，如制备速溶茶的原料，制备液体茶饮料的原料，制备含有普洱茶成分的食品，药品，保健品的原料等。有关方法包括： 

方法1，取普洱茶，加水剧烈沸腾煎煮提取1-5次，煎煮时间0.5-5小时，加水总倍数5-50倍，提取液40-300目过滤，滤液自然或换热降温至30-55℃，10-30万分子量膜过滤，得膜过滤液和膜截留液；将膜截留液浓缩至固含量为5-30％的浓缩液，浓缩液一次离心，一次离心液二次离心，将膜过滤液和二次离心液单独或合并浓缩至比重1.01-1.4/55-65℃，浓缩膏干燥。 

方法2，取普洱茶，灌组逆流循环提取，每组由2-5罐组成；每罐沸腾煎煮提取3-8次，每次加水3-10倍，每次提取时间0.5-1.5h；每罐的第一次提取液进入储液罐，每罐的后续提取液依次作为下一罐的提取溶媒；完成提取的罐添加新的原料后进入循环，开始新的提取，提取液40-300目过滤，滤液浓缩至茶叶(重量)∶浓缩液(体积)＝1∶0.5-10，浓缩液一次离心，一次离心液再经过二次离心，二次离心液浓缩至比重1.01-1.4/55-65℃，浓缩膏干燥。 

方法3，取普洱茶，灌组逆流循环提取，每组由2-5罐组成；每罐沸腾煎煮提取3-8次，每次加水3-10倍，每次提取时间0.5-1.5h；每罐的第一次提取液进入储液罐，每罐的后续提取液依次作为下一罐的提取溶媒；完成提取的罐添加新的原料后进入循环，开始新的提取，提取液过滤提取液60-300目过滤，滤液自然或换热降温至30-55℃，10-30万分子量膜过滤，得膜过滤液和膜截留液；将膜截留液浓缩至固含量为5-30％的浓缩液，浓缩液一次离心，一次离心液二次离心，将膜过滤液和二次离心液单独或合并浓缩至比重1.01-1.4/55-65℃，浓缩膏干燥。 

方法4，取普洱茶，灌组逆流循环提取，每组由2-5罐组成；每罐沸腾煎煮提取3-8次，每次加水3-10倍，每次提取时间0.5-1.5h；每罐的第一次提取液进入储液罐，每罐的后续提取液依次作为下一罐的提取溶媒；完成提取的罐添加新的原料后进入循环，开始新的提取，提取液40-300目过滤，滤液浓缩至茶叶 (重量)∶浓缩液(体积)＝1∶2-1∶10，浓缩液4-7℃下静置8-16小时，上清液用纸浆板或滤纸压滤或滤芯过滤，滤液浓缩至比重1.01-1.4/55-65℃，浓缩膏干燥。 

方法5，取普洱茶超微粉碎粉，加水于75-98℃浸提1-4次，加水倍数8-30倍，浸提时间1-3小时；提取和放料过程中连续搅拌，每次的提取浆料用离心机离心，合并离心液，离心液自然或换热降温至30-55℃，10-30万分子量膜过滤，得膜过滤液和膜截留液；将膜截留液浓缩至固含量为5-30％的浓缩液，浓缩液一次离心，一次离心液二次离心，将膜过滤液和二次离心液单独或合并浓缩至比重1.01-1.4/55-65℃，浓缩膏干燥。 

本发明的有益效果如下： 

本发明采用酸水解和聚酰胺柱分离两个步骤改进了普洱茶和普洱茶提取物样品的制备方法，有效地分离了对测定结果产生干扰的茶色素等物质，实现了准确的多糖含量测定。 

采用本法(水解过柱法)测定数据与直接采用苯酚-硫酸法(醇沉后直接显色法：不含样品酸水解和聚酰胺柱分离步骤，其余操作均与本发明操作相同，取样品醇沉后加热回流的定容液进行测定)测定数据比较见表1。数据表明，直接采用苯酚-硫酸法检测由于有茶色素的干扰造成结果偏高；采用本法检测有效去除了茶色素等物质的干扰，结果较准确。 

表1：苯酚-硫酸法检测普洱茶中茶多糖含量 

附图说明：

图1：葡萄糖标准曲线 

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 

实施例1：普洱茶中茶多糖含量测定 

一.仪器与试剂 

1.仪器 

紫外-可见分光光度计；微型漩涡混合仪；万分之一天平；超声仪。 

2.供试品及试剂 

供试品：速溶普洱茶 

试剂：重蒸酚；硫酸。 

对照品：D-无水葡萄糖，中国药品生物制品检定所(供含量测定用)。 

二.试验方法 

1.供试品溶液的制备 

普洱茶叶供试品溶液制备方法：取约2g(精确至0.001g)，置250ml烧瓶中，分别加入20ml沸水浸提3次，每次10min，合并滤液。加无水乙醇调整至乙醇含量80％。过滤，用热80％乙醇洗涤滤渣3次(30Ml/次)，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加50Ml水，加热回流1h，趁热过滤，用热水洗涤，合并滤液，定容至100Ml。精密吸取5Ml提取溶液，加入盐酸溶液(混合液中盐酸的浓度为0.5mol/L)，在40℃下水解30min，冷却后调pH至中性。将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱(15cm×2cm)中，用热水洗脱，收集滤液，定容至100Ml，作为供试品溶液。 

2.对照品溶液的制备 

取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定(精确至0.001g)，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。 

3.标准曲线的绘制 

分别精密吸取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置10ml具塞试管中，分别加二纯水至1.0ml，各精密加入5％的苯酚溶液(称取2.5g重蒸酚，加水溶解并稀释至50ml，摇匀，即得。)1.0ml，振摇混匀，加5.0ml硫酸，用微型漩涡混合仪迅速振摇混匀，室温下放置30分钟，以第1管为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VB)，在487nm波长处测定吸光度(在1小时内测定完毕)。以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为： 

Y＝a·X+b 

式中： 

Y为对照品溶液的吸光度； 

X为D-无水葡萄糖的质量(mg)； 

a，b为常数。 

4.供试品溶液的测定，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

精密吸取1ml供试品溶液，按照标准曲线的绘制项下，自“精密加入5％的苯酚溶液1.0ml”起，同法操作，在487nm处分别测定吸光度。 

数据处理 

按下式计算含量： 

$>C=\frac{(A-b)\times V}{a\times W\times 1000}\times f\times 100\%$>

式中： 

C为样品中的茶多糖百分含量； 

A为样品的吸光度； 

W为称样量(g)； 

V为定容体积(Ml)； 

f为稀释倍数； 

a，b为常数。

三.试验结果 

1.线性范围考察 

精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液(浓度为0.2032mg/ml)0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置10ml具塞试管中，分别加二纯水至1.0ml，各精密加入5％的苯酚溶液(称取2.5g重蒸酚，加水溶解并稀释至50ml，摇匀，即得。)1.0ml，振摇混匀，加5.0ml硫酸，用微型漩涡混合仪迅速振摇混匀，室温下放置30分钟，以第1管为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VB)，在487nm波长处测定吸光度(在1小时内测定完毕)。以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为： 

Y＝8.0339X-0.0332 

式中： 

Y为对照品溶液的吸光度； 

X为D-无水葡萄糖的质量(mg)。 

2.精密度试验 

取同一批号(200911004-1)样品，取约2g，精密称定，按照供试品溶液制备方法操作，按供试品溶液的测定方法，于487nm处连续测定吸光度6次，计算得吸光度的RSD为0.36％(n＝6)。结果见表2。 

表2精密度试验 

3.重复性试验 

取同一批号(200911004-1)样品，取约2g(共6份)，精密称定，按照供试品溶液制备操作，按供试品溶液的测定方法，于487nm处分别测定吸光度，计算茶多糖含量，RSD为1.13％(n＝6)。结果见表3。 

表3重复性试验 

4.稳定性试验 

取同一批号(200911004-1)样品，取约2g，精密称定，按照供试品溶液制备方法操作，按供试品溶液的测定方法，在0、2、4、6、8、10、12h于487nm处测定其吸光度，计算得吸光度的RSD为0.44％(n＝6)。结果见表4。 

表4稳定性试验 

5.回收率试验 

取同一批号(200911004-1)样品，取约2g(共6份，茶多糖含量为61.01mg/g)，精密称定，按照供试品溶液制备操作，在挥干80％热乙醇后，加入20mg的D-无水葡萄糖对照品溶液，进行加样回收实验，按供试品溶液的测定方法，于487nm处分别测定吸光度，计算茶多糖含量，回收率RSD为3.65％(n＝6)。结果见表5。 

表5回收率试验 

实施例2：普洱茶提取物中茶多糖含量测定 

一.仪器与试剂 

1.仪器 

紫外-可见分光光度计；微型漩涡混合仪；万分之一天平；超声仪。 

2.供试品及试剂 

供试品：速溶普洱茶 

试剂：重蒸酚；硫酸。 

对照品：D-无水葡萄糖，中国药品生物制品检定所(供含量测定用)。 

三.试验方法 

1.供试品溶液的制备 

普洱茶提取物供试品溶液的制备方法：取普洱茶提取物粉末约1g(精确至 0.001g)，置250ml烧瓶中，加80％乙醇50ml，95℃水浴回流30min，趁热滤过，用热80％乙醇洗涤3次(30ml/次)，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加50ml水，加热回流1h，趁热过滤，用热水洗涤，合并滤液，定容至100ml。精密吸取5Ml提取溶液，加入盐酸溶液(混合液中盐酸的浓度为0.5mol/L)，在40℃下水解30min，冷却后调pH至中性。将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱(15cm×2cm)中，用热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

2.对照品溶液的制备：同实施例1。 

3.标准曲线的绘制：同实施例1。 

4.供试品溶液的测定，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

三.试验结果 

以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为：Y＝8.0339X-0.0332 

式中：Y为对照品溶液的吸光度；X为D-无水葡萄糖的质量(mg)。 

                吸光度A          茶多糖含量(％) 

普洱茶提取物    0.294            8.15 

实施例3：普洱茶中茶多糖含量测定 

一.仪器和试剂：同实施例1。 

二.方法： 

1.供试品溶液的制备 

普洱茶叶供试品溶液制备方法：将普洱茶样品配制成检测液包括以下步骤：取普洱茶2g，置250ml烧瓶中，分别加入10ml沸水浸提4次，每次5min，合并滤液；加乙醇调整至乙醇含量60％；过滤，用热浓度为60％乙醇洗涤滤渣2次，20ml/次，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加20ml水，加热回流0.5h，趁热过滤，用60℃热水洗涤，合并滤液，定容至100ml；精密吸取5ml提取溶液，加入盐酸溶液，混合液中盐酸的浓度为0.2mol/L，在30℃下水解15-60min，冷却后调pH至中性；将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱中，用60℃热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

2.对照品溶液的制备：同实施例1。 

3.标准曲线的绘制：同实施例1。 

4.供试品溶液的测定，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

三.结果 

以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为：Y＝8.0339X-0.0332 

式中：Y为对照品溶液的吸光度；X为D-无水葡萄糖的质量(mg)。 

          吸光度A      茶多糖含量(％) 

普洱茶叶  0.124        1.96 

实施例4：普洱茶中茶多糖含量测定 

一.仪器和试剂：同实施例1。 

二.方法： 

1.供试品溶液的制备 

普洱茶叶供试品溶液制备方法：将普洱茶样品配制成检测液包括以下步骤：取普洱茶2g，置250ml烧瓶中，分别加入30ml沸水浸提2次，每次20min，合并滤液；加乙醇调整至乙醇含量90％；过滤，用热浓度为90％乙醇洗涤滤渣4次，40ml/次，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加80ml水，加热回流1.5h，趁热过滤，用100℃热水洗涤，合并滤液，定容至100ml；精密吸取5ml提取溶液，加入盐酸溶液，混合液中盐酸的浓度为1.0mol/L，在70℃下水解15-60min，冷却后调pH至中性；将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱中，用100℃热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

2.对照品溶液的制备：同实施例1。 

3.标准曲线的绘制：同实施例1。 

4.供试品溶液的测定，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

三.结果 

以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为：Y＝8.0339X-0.0332 

式中：Y为对照品溶液的吸光度；X为D-无水葡萄糖的质量(mg)。 

          吸光度A      茶多糖含量(％) 

普洱茶叶  0.055        1.10 

实施例5：普洱茶提取物中茶多糖含量测定 

一.仪器和试剂：同实施例1。 

二.方法： 

1.供试品溶液的制备 

普洱茶提取物供试品溶液制备方法：取普洱茶提取物1g，置250ml烧瓶中，加60％乙醇20ml，80℃水浴回流15min，趁热滤过，用热60％乙醇洗涤2次，20-40ml/次，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加20ml水，加热回流0.5h，趁热过滤，用热水洗涤，合并滤液，定容至100ml；精密吸取5ml提取溶液，加入盐酸溶液，混合液中盐酸的浓度为0.2mol/L，在30℃下水解15-60min，冷却后调pH至中性；将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱中，用60℃热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

2.对照品溶液的制备：同实施例1。 

3.标准曲线的绘制：同实施例1。 

4.供试品溶液的测定，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

三.结果 

以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为：Y＝8.0339X-0.0332 

式中：Y为对照品溶液的吸光度；X为D-无水葡萄糖的质量(mg)。 

              吸光度A      茶多糖含量(％) 

普洱茶提取物  0.249        7.01 

实施例6：普洱茶提取物中茶多糖含量的测定 

一.仪器和试剂：同实施例1。 

二.方法： 

1.供试品溶液的制备 

普洱茶提取物供试品溶液制备方法：取普洱茶提取物1g，置250ml烧瓶中，加90％乙醇80ml，95℃水浴回流60min，趁热滤过，用热90％乙醇洗涤4次，20-40ml/次，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加80ml水，加热回流1.5h，趁热过滤，用热水洗涤，合并滤液，定容至100ml；精密吸取5ml提取溶液，加入盐酸溶液，混合液中盐酸的浓度为1.0mol/L，在70℃下水解15-60min，冷却后调pH至中性；将酸水解后的多糖提取液置聚酰胺层析柱中，用100℃热水洗脱，收集滤液，定容至100ml，作为供试品溶液。 

2.对照品溶液的制备：同实施例1。 

3.标准曲线的绘制：同实施例1。 

4.供试品溶液的测定，计算普洱茶或普洱茶提取物样品中茶多糖含量。 

三.结果 

以吸光度(Y)和质量(X)作标准曲线，回归方程为：Y＝8.0339X-0.0332 

式中：Y为对照品溶液的吸光度；X为D-无水葡萄糖的质量(mg)。 

                吸光度A      茶多糖含量(％) 

普洱茶提取物    0.196        5.71。