一种脂肪酶催化在线合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种微流控通道反应器中脂肪酶催化在线可控选择性合成蔗糖-6-月桂酸酯 的方法，属于微流控技术与生物催化选择性合成蔗糖酯等非离子型表面活性剂技术领域。

(二)背景技术

微流控学(Microfluidics)是在微米级结构中操控纳升至皮升体积流体的技术与科学，是近 十年来迅速崛起的新交叉学科。当前，微流控学的发展已大大超越了原来的主要为分析化学 服务的目的，而正在成为整个化学学科、生命科学、仪器科学乃至信息科学新一轮创新研究 的重要技术平台。

自1997年Harrison课题组发表了首篇在微流控芯片微反应器中合成化合物的文献后，微 流控芯片反应器已成功地用于多种有机合成反应，并展示了广泛的应用前景。随着微流控芯 片中微混合、微反应技术的发展，在芯片中进行合成反应已经成为微流控芯片领域的研究热 点之一。

同常规化学反应器相比，微通道反应器不仅具有使反应物间的扩散距离大大缩短，而且 传质速度快；反应物配比、温度、反应时间和流速等反应条件容易控制，副反应较少；需要 反应物用量甚微，不但能减少昂贵、有毒、有害反应物的用量，反应过程中产生的环境污染 物也极少，是一种环境友好、合成研究新物质的技术。

蔗糖脂肪酸酯作为一种蔗糖衍生物，是一种性能优良的安全、无毒、无异味、无污染、 对人体无任何副作用无刺激、稳定性好、可完全生物降解的多元醇型非离子表面活性剂。它 能有效地降低水的表面张力，在润湿力、分散力、增溶性、发泡力、乳化力、去污力等方面 具有优良的性能。同时，还具有杀虫抑菌性能。因此，它的适应性强，应用范围广。目前已 被广泛地用于食品工业、日用化工、医药工业、纺织、农牧等领域，特别是用作食品工业中 的乳化剂、分散剂、起泡剂、润湿剂和清洁剂；日用化工中的化妆品、洗涤剂等。

蔗糖酯一般为白色粉状、块状或蜡状固体，有时也以无色或微黄色粘稠状或树脂状液体 形式存在，无毒、不刺激皮肤与粘膜。食入人体内，可水解为可食用脂肪酸和蔗糖，具有营 养价值，参与人体的新陈代谢，具有乳化、分散、润湿、起泡、粘度调节、防止老化和防止 晶析等性能，易溶于乙醇、丙醇、氯仿、丙二醇等有机溶剂中，无明显熔点，在50℃以上即 开始熔化，在温水中分散或溶解，在冷水中的溶解度较小，在弱酸弱碱下稳定，在强酸强碱 下易发生水解。

至今蔗糖酯的合成有溶剂法、微乳化法、水溶剂法、酶法和无溶剂法等。但现有方法存 在着或多或少的缺陷。

微乳化法和水溶剂法都需大量的皂作乳化剂，产品精制困难，色泽较深，而且水溶剂法 还有产率低的缺点。无溶剂法虽然反应时间短，不使用任何溶剂，符合绿色化学的发展要求， 但是由于无溶剂法合成的脂肪酸酯的转化率低，蔗糖酯的单酯含量低，产品成本高，限制了 它们的应用。溶剂法由于溶剂DMSO、DMF等易燃、有毒，产品纯化较难，因此不宜应用于 食品级蔗糖酯的生产。因此开发高效的蔗糖酯的合成方法具有十分重要的实际意义。

目前，有较多的国内外学者对有机介质中蔗糖酯的酶催化合成进行了研究，先后报道了 叔丁醇体系以及叔丁醇与DMSO混合溶剂体系(4∶1)中脂肪酶催化多种二糖的酯化。与传 统的溶剂法相比，混合溶剂体系采用无毒的或毒性较小的叔戊醇作为反应介质，大大减少了 有毒溶剂的使用，适用于开发各种具有应用价值的蔗糖酯产品。但是该方法往往需要较长的 反应时间(24h)，且反应的转化率与选择性不高，后续分离困难。因此我们研究了微流控通 道反应器中脂肪酶催化选择性合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种微流控通道反应器中脂肪酶催化选择性合成蔗糖 -6-月桂酸酯的新工艺，具有反应时间短、选择性高及产率高的优点。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种脂肪酶催化在线合成蔗糖-6-月桂酸酯的方法，所述方法采用微流控通道反应器，所 述的微流控通道反应器包括注射泵、注射器、反应通道和产物收集器，所述注射器安装于注 射泵中，通过一个接口与反应通道入口连接，所述产物收集器通过一个接口与反应通道出口 连接，所述反应通道内径为0.8～2.4mm，反应通道长为0.5～1.0m；所述方法包括：以摩尔比 为1∶8-12的蔗糖与月桂酸乙烯酯为原料，以0.5-1.0g脂肪酶Lipozyme TLIM为催化剂，以叔 戊醇和二甲亚砜(DMSO)的混合溶剂为反应溶剂，将原料和反应溶剂置于注射器中，将脂 肪酶Lipozyme TLIM均匀填充在反应通道中，在注射泵推动下使原料和反应溶剂连续通入反 应通道中进行酰化反应，控制酰化反应温度为40-55℃，酰化反应时间为20-35min，通过产 物收集器在线收集反应液，反应液经常规后处理得到蔗糖-6-月桂酸酯。

本发明采用的微流控通道反应器中，所述注射器数目可以是一个或多个，视具体反应需 求而定。比如，当使用两个注射器时，可采用T型或Y型接口使不同的反应物从两个入口引 入，汇流进入公共的反应通道，通过微通道的中反应物分子接触与碰撞几率增大，使两股反 应液流在公共的反应通道中混合并进行反应。

所述的微流控通道反应器还包括恒温箱，所述的反应通道置于恒温箱中，以此可以有效 控制反应温度。所述的恒温箱可以根据反应温度要求自行选择，比如水浴恒温箱等。

本发明对于反应通道的材质不限，推荐使用绿色、环保的材质，如硅胶管；对于反应通 道的形状最好为曲线形，可以保证反应液匀速稳定的通过。

本发明在实施过程中，可先用叔戊醇和DMSO的混合溶剂(叔戊醇∶DMSO＝4∶1)溶解 蔗糖，其用量只要保证蔗糖能充分溶解即可，并装于注射器中备用；仅用无毒的叔戊醇溶解 月桂酸乙烯酯，装于另一注射器中备用；然后在注射泵(例如PHD2000注射泵)推动下使反 应原料按比例混合通入反应通道中进行反应。因此，本发明相比于常规的摇床反应，可以将 有毒的DMSO的使用量降至最低。

本发明中，所述的脂肪酶Lipozyme TLIM使用诺维信(novozymes)公司生产的商品，其 是一种由微生物制备的、1，3位置专用、食品级脂肪酶(EC3.1.1.3)在颗粒硅胶上的制剂。 它是从Thermomyces lanuginosus得到的、用一种基因改性米曲霉(Aspergillus oryzae)微生 物经过深层发酵生产的。

进一步，所述蔗糖与月桂酸乙烯酯的摩尔比优选为1∶9～11，最优选为1∶11。

进一步，所述酰化反应温度优选为50～55℃，最优选为52℃。

进一步，所述酰化反应时间优选为25～30min，最优选为30min。

本发明的反应产物可以在线收集，所得反应液可以通过常规后处理方法即可获得蔗糖-6- 月桂酸酯。所述常规后处理方法可以是：所得反应液减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶 湿法装柱，洗脱试剂为氯仿∶甲醇＝10∶1，样品用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，收集洗脱液， 同时TLC跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，可以得到白色的单酯晶 体，即为蔗糖-6-月桂酸酯。

本发明中，虽然蔗糖中有8个性能相近的羟基，但在微流控微通道反应器中脂肪酶催化 选择性合成蔗糖-6-月桂酸酯具有较高的转化率和选择性，二酯的转化率很低，几乎没有，通 过柱层析分离得到的单酯的含量可达98％。产物的结构经¹H NMR确证。这表明微流控微通 道反应器中蔗糖-6-月桂酸酯的酶促选择性合成具有很好的反应转化率及选择性，能实现高的 单酯化率。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明微流控通道反应器中选择性合成蔗糖-6- 月桂酸酯，该法不仅大大地缩短了反应时间，而且具有高的转化率和反应选择性；同时降低 了DMSO的使用量，具有环保优势。

(四)附图说明

图1为实施例采用的微流控通道反应器的结构示意图。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的保护范围作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

本发明实施例使用的微流控通道反应器的结构参考图1，包括一个注射泵(未显示)、两 个注射器1和2、反应通道3、水浴恒温箱(5，仅显示其平面示意图)和产物收集器4；两 个注射器1和2安装于注射泵中，通过一个Y型接口与反应通道3入口连接，所述反应通道 3置于水浴恒温箱5中，通过水浴恒温箱5控制反应温度，所述的反应通道3的内径2.4mm， 管长1m，所述反应通道3出口通过一接口与产物收集器4连接。

实施例1：蔗糖-6-月桂酸酯的合成

参照图1，将蔗糖(0.4mmol)溶解在10mL(叔戊醇∶DMSO＝4∶1(v/v))的混合溶剂中， 月桂酸乙烯酯(4.4mmol)溶解在10mL叔戊醇中，然后分别装于10mL注射器中备用。0.87g 脂肪酶Lipozyme TLIM均匀填充于反应通道中，在PHD2000注射泵推动下，两路反应液分 别以10.4μLmin^-1的流速通过“Y”接头进入反应通道中进行酰化反应，通过水浴恒温箱控制 反应器温度在52℃，反应液在反应通道内连续流动反应30min，通过产物收集器在线收集反 应液，减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱液为氯仿∶甲醇＝10∶1，柱高 35cm，柱直径4.5cm，样品用少量洗脱剂溶解后湿法上柱，洗脱液收集流速2mL/min^-1，同 时TLC跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，可以得到白色的晶体。通 过HPLC测定转化率和产物选择性，结果为：蔗糖转化率为92％，蔗糖-6-月桂酸酯选择性(蔗 糖-6-月桂酸酯含量/生成的蔗糖酯总含量)为98％。

核磁表征结果如下：

蔗糖-6-月桂酸酯：¹H-NMR(DMSO-d6，δ，ppm)：5.18-5.14(m，3H，蔗糖的2β-OH，3α-OH 和4β-OH)，5.03(d，1H，J＝5.5Hz，蔗糖的3′β-OH)，4.90(s，1H，蔗糖的4′α-OH)，4.83-4.80(t，1H， J＝6.5Hz，蔗糖的5′β-OH)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，蔗糖的1′β-OH)，4.41-4.39(t，1H，J＝5.0Hz， 蔗糖的H_α-6α)，4.24(d，1H，J＝10.5Hz，蔗糖的H_b-6α)，4.04-3.99(m，1H，蔗糖的H-5β)， 3.92-3.86(m，2H，蔗糖的H-5′α和H_α-1′α)，3.73(d，1H，J＝6.0Hz，蔗糖的H_b-1′α)，3.60-3.47(m， 4H，蔗糖的H-3′α，H-4′β，H_a-6′β和H_b-6′β)，3.35(m，1H，蔗糖的H-3β)，3.22-3.19(m，1H，蔗糖的 H-2β)，3.09-3.04(m，1H，蔗糖的H-4β)，2.31-2.29(m，2H，a-CH₂)，1.52-1.50(t，2H，J＝7.0Hz， β-CH₂)，1.25(m，16H，n-CH₂)，0.86(t，3H，J＝7.0Hz，CH₃).

实施例2-5

改变微流控通道反应器的温度，其他同实施例1，反应结果如表1所示：

表1：温度对反应的影响

[a]：转化率通过HPLC测定；[b]：总蔗糖酯产物中蔗糖-6-月桂酸酯的含量

表1的结果表明，当流速为10.4μLmin^-1，反应时间均为30min时，反应随温度的升高， 转化率也明显升高，当反应温度达到52℃时，反应的转化率及选择性都最佳，此时如果继 续升温，将会引起酶活性的降低，从而导致了反应的转化率及选择性有所降低，所以微流控 通道反应器中蔗糖-6-月桂酸酯的最佳反应温度为52℃。

实施例6-9

改变微流控微通道反应器中月桂酸乙烯酯与蔗糖的底物摩尔比为8∶1(实施例6)、9∶1(实 施例7)、10∶1(实施例8)、12∶1(实施例9)，其他同实施例1，结果如表2所示。

表2：蔗糖与月桂酸乙烯酯底物比对反应的影响

[a]：转化率通过HPLC测定；[b]：总蔗糖酯产物中蔗糖-6-月桂酸酯的含量表2的结果表明，随着 反应物月桂酸乙烯酯的增加，反应的转化率也随着增加，当底物比为11∶1时，反应的转化率 及选择性最优。此时如果继续增加反应物月桂酸乙烯酯的用量，将会导致反应的选择性降低， 因而，该反应的最佳底物比为11∶1。

实施例10-14

改变微流控微通道反应器中反应时间为15min(实施例10)、20min(实施例11)、25min (实施例12)、35min(实施例13)、40min(实施例14)，其他同实施例1，结果如表3所示。

表3：反应时间对反应的影响

[a]：转化率通过HPLC测定；[b]：总蔗糖酯产物中蔗糖-6-月桂酸酯的含量

表3的结果表明，随着反应时间的增加，反应的转化率及选择性也逐渐增加，当反应进 行30min时，反应的转化率及选择性最优，此时如果继续延长反应时间，将会导致蔗糖-6- 月桂酸酯转化率降低，蔗糖月桂酸二酯的转化率增加，反应选择性降低，因而，微流控通道 反应器中蔗糖-6-月桂酸酯合成的最佳时间为30min。