鉴别检测绵羊痘病毒和山羊痘病毒的试剂盒

技术领域

 本发明涉及一种检测试剂盒，确切讲是一种用于检测绵羊痘病毒和山羊痘病毒的试剂盒。

背景技术

羊痘（Capripox，CP）包括绵羊痘、山羊痘和牛的皮肤疙瘩病，其中前两者是由绵羊痘病毒（Sheeppox virus，SPPV）和山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）分别引起绵羊和山羊发生的接触性传染病。病畜体温升高，全身出现丘疹或结节、水疱、内脏病变甚至死亡，给世界养羊业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。绵羊痘和山羊痘的鉴别诊断一直是研究的热点。

研究表明，SPPV 和GTPV 基因序列同源性达到96%-97%, 仅在基因组末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差异，见：Tulman, E.R., Afonso, C.L., Lu, Z., Zsak, L., Sur, J.H., Sandybaev, N.T., Kerembekova, U.Z., Zaitsev, V.L., Kutish, G.F.,Rock, D.L., 2002. The genomes of sheeppox and goatpox viruses. J Virol. 76, 6054-6061.。一般来说, SPPV、GTPV 具有较严格的宿主嗜性, 但有一些研究表明试这两种病毒也可发生宿主嗜性改变, 引起交叉感染见：M.G. Garner, S.D. Sawarkar, E.K. Brett, J.R. Edwards, V.B. Kulkarni, D.B. Boyle;S.N. the Extent and Impact of Sheep Pox and Goat Pox in the State of Maharashtra, India , Tropical Animal Health and Production.2000,32(4):205-223.,继而可能导致错误的临床诊断和获得不准确的流行病学信息, 不利于对该病的有效防控。对羊痘病毒分离株进行准确的种属鉴别有助于解决生产中遇到的这个问题, 但SPPV 和GTPV 之间抗原性具有明显交叉, 用血清学方法很难区别开来, 需通过分子生物学方法进行鉴别，Sheeppox and goatpox virus. World Organisation for Animal Health (2009). - Terrestrial Animal Health Code. OIE,Paris.。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于羊痘的流行病学分析, 具有重要意义。

目前为止，基于基因序列分析的分子生物学鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期本实验室通过克隆结合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了PCR-RFLP方法，而印度的Gnanavel Venkatesanl和Madhusudan Hosamani等也分别建立了分析P32基因的PCR-RFLP，但是该方法需要专用的PCR仪器和酶切操作，相对来说比较繁琐且费用较多，不利于生产实践中的实际应用，见：颜新敏,吴国华,李健等.山羊痘病毒感染绵羊的诊断及其基因的分子分析.中国兽医科学,2011,41(01):14.、Gnanavel Venkatesan,Vinayagamurthy Balamurugan,RevaniahYogisharadhya etal., Differentiation of sheeppox and goatpox viruses by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. VIROLOGICA SINICA,2012,27(6):353-359.、Madhusudan Hosamani, Bimalendu Mondal, Prabhakar A et al.. Differentiation of Sheep Pox and Goat Poxviruses by Sequence Analysis and PCR-RFLP of P32 Gene, Virus Genes 29:1, 73–80, 2004。而国内肖雯[6]等建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR 方法扩增灵敏度仅为1.725×10⁷ copies/μL 的SPPV 和1.71×10⁶ copies/μL 的GTPV，且同样需要专门的PCR仪器，因此该方法在生产实践中也存在这局限性，肖雯，聂福平，王昱 等.绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用.中国预防兽医学报.2012, 7(7):551-554.。环等温介导技术（loop mediated isothermal amplication, LAMP）由于其具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被广泛应用于各种疾病病原的检测中。目前为止，美国科学家Amaresh Das等人建立了检测羊痘病毒属的Lamp方法，参见：Amaresh Das, Shawn Babiuk,and Michael T. McIntosh.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses. Journal of Clinical Microbiology.2012, 1613–1620.。该研究靶向SPPV、GTPV和LSDV三种病原共有的保守的VP39基因，因此该方法并不能够区分出绵羊痘病毒和山羊痘病毒；而国内重庆出入境检验检疫局李应国等人也建立了检测羊痘病毒属的Lamp诊断试剂盒，参见：羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法，专利号：CN102373302A，该方法也是以SPPV、GTPV和LSDV三种病原共有的基因组1119272bp-120322bp保守序列为靶标基因。因此，他们所建立的方法或者试剂盒仅仅能检测出羊痘病毒属病毒，而不能够区别出同属不同种的病毒，即不能够区分绵羊痘病毒和山羊痘病毒。同时这些方法同样存在的检测灵敏度较低的不足，这对病毒检测是不利的。

寻找一种可以鉴别诊断绵羊痘病毒和山羊痘病毒试剂盒和检测方法，特别是找到一种可以有更高检测灵敏度的检测试剂盒和检测方法，对羊痘病的诊断、治疗与预防有重要意义。

发明内容

本发明提供一种可以克服现有技术不足，能联合鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒的检测试剂盒，特别是提供一种可比现有技术有更高检测灵敏度或更廉价方便的检测试剂盒。

本发明的鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒检测盒内包括有三组引物：SEQ ID №1、SEQ ID №2、SEQ ID №3、SEQ ID №4、SEQ ID №5、SEQ ID №6、SEQ ID №7、 SEQ ID №8、SEQ ID №9、SEQ ID №10、SEQ ID №11和SEQ ID №12。

本发明的六对序列分别为：

可特异性扩增山羊痘病毒核酸的引物：SEQ ID №1：ACCAAAACAAATAATCAGAGATG，在本发明中被命名为GTPV F3；SEQ ID №2：CCTAATCCATTTAAGACACTACG，在本发明中被命名为GTPV B3；SEQ ID №3：AAGATGTCTTCCGGTAACTATGTCT-GCGGTTGTGATATCGTCA，在本发明中被命名为GTPV FIP；SEQ ID №4：CCGAACTTGTTATTTCTTGTGCTT-CACAATAAGGAACCACCTAGA，在本发明中被命名为GTPV BIP；

可特异性扩增绵羊痘病毒核酸的引物：SEQ ID №5：TGAGGCATCCTTTTTGAAAG，在本发明中被命名为SPPV F3；SEQ ID №6：AAGAAATAACAAGTTCGGGTTA，在本发明中被命名为SPPV B3；SEQ ID №7：GCCATCTCTGATTATTTGTTTTGGT-AACACATTTCCAGCAACCT，在本发明中被命名为SPPV FIP；SEQ ID №8：CATCTGAAAAGTTGTTTCGGTAGAC-AGAGACTTTTATCCCGTTCA，在本发明中被命名为SPPV BIP；

可同时特异性扩增绵羊痘病毒和山羊痘病毒核酸的通用引物：SEQ ID №9：AGCTGTTAGATCATTTCCAAAT，在本发明中被命名为GSPV F3；SEQ ID №10：CGTTCATTTTACAAGATGTCTTC，在本发明中被命名为GSPV B3；SEQ ID №11：CATCTAGGGAGGTTGCTGGAAAT-GTGAGGCATCCTTTTTGAAAG在本发明中被命名为GSPV FIP；SEQ ID №12：ATCAGAGATGGCTGTTGTGATATC-CAGCAACTATGTCTACCGA在本发明中被命名为GSPV BIP。

相关的实验表明，本发明的序列GTPV F3、GTPV B3、 GTPV FIP、 GTPV BIP可特异性快速扩增山羊痘病毒的核酸，但同等条件下不能扩增绵羊痘病毒的核酸，通过核酸电泳检测到是否有特异性条带可确定出被检样品是否带有山羊痘病毒特异性条带。本发明的序列SPPV F3、SPPV B3、 SPPV FIP、 SPPV BIP可特异性快速扩增绵羊痘病毒的核酸，但同等条件下不能扩增绵羊痘病毒的核酸，通过核酸电泳检测到是否有特异性条带可确定出被检样品是否带有绵羊痘病毒。本发明的序列GSPV F3、GSPV B3、 GSPV FIP、 GSPV BIP可特异性快速扩增绵羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸，通过核酸电泳检测到是否有特异性条带可确定被检样品是否带有绵羊痘病毒或山羊痘病毒。

本发明设计思路上比美国科学家Amaresh Das等人和李应国等人的方法设计更为精细，本发明中精心选取了羊痘病毒属基因组的反向末端重复序列ITR区为靶基因，在选取保守的靶基因的基础上设计出一组通用引物，又另外专门分别设计了只能匹配一种病毒而不匹配另外一种病毒的两组特异性引物，三组引物结合或分别使用均可鉴别检测出绵羊痘病毒和山羊痘病毒。而且，本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增45min之后最少可检出1.037×10⁴个拷贝的模板。山羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增60min之后最少可检出1.045×10⁶个拷贝的模板，通用lamp引物在62℃下，扩增45min之后最少可检出1.037×10³个拷贝的模板。三组引物配合使用检测的灵敏度远高于已有的双重PCR以及PCR-RFLP方法，且使用更为方便和廉价，三组引物检测结果互为验证，使得结果更为准确。因此，本发明的检测羊痘病毒的试剂盒能够快捷高效灵敏的区别检测出绵羊痘病毒和山羊痘病毒，为羊痘病毒的鉴别诊断提供可靠方法。

本发明是利用环等温介导技术进行检测。环等温介导技术进行检测（loop mediated isothermal amplication, LAMP）由于其具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被广泛应用于各种疾病病原的检测中。但是目前国内外尚无基于LAMP鉴别诊断绵羊痘病毒和山羊痘病毒试剂盒和检测方法的报道。

相关的实验提示本发明的序列可用于制备快速鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒LAMP诊断试剂盒，并在羊痘病毒流行病学研究中应用。

附图说明    

图1(A)为绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62℃和64℃均有扩增条带产生，66℃和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃和64℃中任意一个温度。

图1(B)为山羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62℃和64℃均有扩增条带产生，66℃和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃和64℃中任意一个温度。

图1(C)为绵羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62、64℃和66℃均有扩增条带产生，对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃、64℃和66℃中任意一个温度。

图2(A)为绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增45min、60min后均有扩增条带产生，扩增30min和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用lamp引物在62℃下扩增时间可在45min之后扩增出特异性条带。

图2(B)为山羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增60min后均有扩增条带产生，扩增30min、45min、和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在60min之后扩增出特异性条带。

图2(C)为绵羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增30min、45min和60min后均有扩增条带产生，扩增对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在30min之后扩增出特异性条带。

图3(A)为以羊的不同病原体基因组为模板，以绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物在62℃下扩增45min后核酸电泳检测结果。其中M表示100bp DNA Ladder marker；1为山羊痘病毒扩增产物；2为绵羊痘病毒扩增产物；3为羊口疮病毒扩增产物；4为支原体扩增产物；5为衣原体扩增产物；6为螺旋体扩增产物；7为弓形虫扩增产物；8为羊泰勒虫扩增产物；9为羊巴贝斯虫扩增产物；10为无形体扩增产物；11为阴性对照。由图可见，通用lamp引物特异性扩增出了绵羊痘病毒和山羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明通用lamp引物特异性很高。

图3(B)为以羊的不同病原体基因组为模板，以山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增60 min后核酸电泳检测结果。其中M表示100bp DNA Ladder marker；1为山羊痘病毒扩增产物；2为绵羊痘病毒扩增产物；3为羊口疮病毒扩增产物；4为支原体扩增产物；5为衣原体扩增产物；6为螺旋体扩增产物；7为弓形虫扩增产物；8为羊泰勒虫扩增产物；9为羊巴贝斯虫扩增产物；10为无形体扩增产物；11为阴性对照。由图可见，山羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明山羊痘病毒lamp引物特异性很高。 

图3(C)为以羊的不同病原体基因组为模板，以绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增45 min后核酸电泳检测结果。其中M表示100bp DNA Ladder marker；1为绵羊痘病毒扩增产物；2为山羊痘病毒扩增产物；3为羊口疮病毒扩增产物；4为支原体扩增产物；5为衣原体扩增产物；6为螺旋体扩增产物；7为弓形虫扩增产物；8为羊泰勒虫扩增产物；9为羊巴贝斯虫扩增产物；10为无形体扩增产物；11为阴性对照。由图可见，绵羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了绵羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明绵羊痘病毒lamp引物特异性很高。

图4(A) 为绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果，扩增条件为62℃，扩增时间为45min。其中M代表100bp DNA marker；1为1.037×10⁹个拷贝，2为1.037×10⁸个拷贝；3为1.037×10⁷个拷贝，4为1.037×10⁶个拷贝；5为1.037×10⁵个拷贝，6为1.037×10⁴个拷贝，7为1.037×10³个拷贝，8为1.037×10²个拷贝，9为1.037×10¹个拷贝，10为1.037×10⁰个拷贝，11为阴性对照。由图可见，1.037×10⁹-1.037×10³个拷贝的模板均有特异性产物产生，和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用lamp引物在62℃下，扩增45min之后最少可检出1.037×10³个拷贝的模板。

图4(B) 为山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为60min。其中M代表100bp DNA marker；1为1.045×10⁹个拷贝，2为1.045×10⁸个拷贝；3为1.045×10⁷个拷贝，4为1.045×10⁶个拷贝；5为1.045×10⁵个拷贝，6为1.045×10⁴个拷贝，7为1.045×10³个拷贝，8为1.045×10²个拷贝，9为1.045×10¹个拷贝，10为1.045×10⁰个拷贝，11为阴性对照。由图可见，1.045×10⁹-1.045×10⁶个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增60min之后最少可检出1.045×10⁶个拷贝的模板。

图4(C) 为绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为45min。其中M代表100bp DNA marker；1为1.037×10⁹个拷贝，2为1.037×10⁸个拷贝；3为1.037×10⁷个拷贝，4为1.037×10⁶个拷贝；5为1.037×10⁵个拷贝，6为1.037×10⁴个拷贝，7为1.037×10³个拷贝，8为1.037×10²个拷贝，9为1.037×10¹个拷贝，10为1.037×10⁰个拷贝，11为阴性对照。由图可见，1.037×10⁹-1.037×10⁴个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增45min之后最少可检出1.037×10⁴个拷贝的模板。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细解说.

1. 序列的制备

应用网上lamp引物设计软件（PrimerExplorerV3）对羊痘病毒基因组反向重复末端（1-2000bp内）设计三个组引物，从获得的数百对引物中选择评分较高的引物在进行将设计好的序列发送至南京金斯瑞生物工程有限公司进行5’端修饰合成。

2．病毒基因组提取

将Vero细胞接种细胞培养瓶，单层细胞长至80%以上融合后，接种羊痘病毒病毒，37℃孵育1h后弃去毒液。加入细胞维持液含有1%胎牛血清DMEM，37℃5%CO₂培养，定期观察细胞病变（CPE），待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒反复冻融3次，置-20℃冰箱保存备用。使用TaKaRa 公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中的DNA，获得的病毒DNA即可用于检测。

3.Lamp扩增条件优化

以提取纯化的病毒DNA 为模板进行扩增，实验体系如下：

12.5 μL LAMP 反应缓冲液(40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、20 mmol/L KCl、16 mmol/L MgSO4、20 mmol/L (NH4)2SO4、0.2% Tween 20、1.6 mol/L 甜菜碱、2.8 mmol/L dNTPs)、0.9 μL 引物混合液 (40 pmol FIP、BIP、5 pmol F3、B3)、2.0 μL DNA 样 品、1.0 μL (8U) Bst DNA 聚合酶 (New England Biolabs, M0275L) 和 8.2 μL 灭菌水。反应条件为在60-64℃之间，反应30-60min可鉴别检测出绵羊痘病毒和山羊痘病毒。

3.1反应温度的优化

在进行lamp引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。其中使用绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物时，使用模板为绵羊痘病毒或山羊痘病毒基因组均可；使用绵羊痘病毒lamp引物时，使用模板为绵羊痘病毒；使用山羊痘病毒lamp引物时，使用模板为山羊痘病毒。反应温度设为 60℃、62℃、64℃和66℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为60 min，结束后 80℃加热 2 min，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。

经过检测绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62℃和64℃均有扩增条带产生，66℃和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃和64℃中任意一个温度。

山羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62℃和64℃均有扩增条带产生，66℃和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃和64℃中任意一个温度。

绵羊痘病毒lamp引物扩增温度梯度优化，扩增60min后核酸电泳检测结果。其中60℃、62、64℃和66℃均有扩增条带产生，对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物扩增温度可选择60℃、62℃、64℃和66℃中任意一个温度。

3.2 反应时间的优化

在进行lamp引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。其中使用绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物时，使用模板为绵羊痘病毒或山羊痘病毒基因组均可；使用绵羊痘病毒lamp引物时，使用模板为绵羊痘病毒；使用山羊痘病毒lamp引物时，使用模板为山羊痘病毒。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间为30~60 min，结束后 80℃加热 2 min，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。

检测结果显示，绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增45min、60min后均有扩增条带产生，扩增30min和对照组均无条带产生，可看出本发明所设计的通用lamp引物在62℃下扩增时间可在45min之后扩增出特异性条带。

山羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增60min后均有扩增条带产生，扩增30min、45min、和对照组均无条带产生，此图可看出本发明所设计的通用山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在60min之后扩增出特异性条带。

绵羊痘病毒lamp引物扩增在62℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果。其中扩增30min、45min和60min后均有扩增条带产生，扩增对照组无条带产生，可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增时间可在30min之后扩增出特异性条带。

3.3 反应特异性检测

在进行lamp引物的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物、绵羊痘病毒lamp引物、山羊痘病毒lamp引物的模板分别为绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊水泡病毒、支原体、为衣原体、螺旋体、弓形虫、羊泰勒虫、羊巴贝斯虫和无形体。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间按优化结果，绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物设为45min、绵羊痘病毒lamp引物反应60min、山羊痘病毒lamp引物为60 min。反应结束后 80℃加热 2 min，之后取出反应管，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。

检测结果显示以羊的不同病原体基因组为模板，以绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物在62℃下扩增45min后核酸电泳检测结果。通用lamp引物特异性扩增出了绵羊痘病毒和山羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明通用lamp引物特异性很高。 

以羊的不同病原体基因组为模板，以山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增60 min后核酸电泳检测结果。山羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明山羊痘病毒lamp引物非常特异。 

以羊的不同病原体基因组为模板，以绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增45 min后核酸电泳检测结果。结果显示绵羊痘病毒lamp引物特异性扩增出了绵羊痘病毒基因片段，而其他病原体均无特异性产物产生，阴性对照组无条带产生，说明绵羊痘病毒lamp引物特异性很高。

3.4 反应灵敏度检测

在进行lamp引物的反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物时，使用模板为绵羊痘病毒或山羊痘病毒基因组均可；使用绵羊痘病毒lamp引物时，使用模板为绵羊痘病毒；使用山羊痘病毒lamp引物时，使用模板为山羊痘病毒。所有模板均通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为1.037×10⁹-1.037×10⁰个拷贝共计10个梯度作为模板。反应温度设为 62℃的水浴锅或PCR仪中进行，反应时间按优化结果，绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物设为45min、绵羊痘病毒lamp引物设为45min、山羊痘病毒lamp引物为60 min。反应结束后 80℃加热 2 min，之后取出反应管，各取2μL Lamp产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。

结果显示，绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果，扩增条件为62℃，扩增时间为45min。结果显示，1.037×10⁹-1.037×10³个拷贝的模板均有特异性产物产生，和对照组均无条带产生，由此可看出本发明所设计的通用lamp引物在62℃下，扩增45min之后最少可检出1.037×10³个拷贝的模板。

山羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为60min。结果显示，1.045×10⁹-1.045×10⁶个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的山羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增60min之后最少可检出1.045×10⁶个拷贝的模板。

为绵羊痘病毒lamp引物在62℃下扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果,扩增时间为45min。结果显示，1.037×10⁹-1.037×10⁴个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。对照组无条带产生，此图可看出本发明所设计的绵羊痘病毒lamp引物在62℃下，扩增45 min之后最少可检出1.037×10⁴个拷贝的模板。

3．5检测结果判定

和阴性对照相比，GSPV通用引物扩增产物经核算电泳检测出现条带，判定为羊痘病毒，同时GTPV引物扩增产物出现条带而SPPV引物扩增产物不出现条带判定为山羊痘病毒； GSPV通用引物扩增产物经核算电泳检测出现条带，同时GTPV引物扩增产物不出现条带而SPPV引物扩增产物出现条带判定为绵羊痘病毒；GSPV通用引物扩增产物经核算电泳检测出现条带，同时GTPV引物扩增产物出现条带且SPPV引物扩增产物出现条带判定为绵羊痘病毒和山羊痘病毒混合物。

综上可见，本发明设计合成的12个基因序列以及其形成的LAMP试剂盒及检测方法可以联合使用快速鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒,而且3组引物在灵敏度上互为补充，检测方法简单、检测结果真实可靠。

<110>  中国科学院兰州兽医研究所

<120>  鉴别绵羊痘病毒和山羊痘病毒检测盒

<160>  序列表中序列的个数 （如18） （注：CN1至CN8的基因序列与其氨基酸序列）

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列（GTPV F3）

<400> 

accaaaacaa ataatcagag atg                                              23

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列（GTPV B3）

<400>

cctaatccat ttaagacact acg                                              23

<210>  3

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列（GTPV FIP）

<400>

aagatgtctt ccggtaacta tgtctgcggt tgtgatatcg tca                        43

<210>  4

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列（GTPV BIP）

<400>

ccgaacttgt tatttcttgt gcttcacaat aaggaaccac ctaga                      45

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列（SPPV F3）

<400>

tgaggcatcc tttttgaaag                                                  20

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列（SPPV B3）

<400>

aagaaataac aagttcgggt ta                                               22

<210>  7

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列（SPPV FIP）

<400>

gccatctctg attatttgtt ttggtaacac atttccagca acct                       44

<210>  8

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列（SPPV BIP）

<400>

catctgaaaa gttgtttcgg tagacagaga cttttatccc gttca                      45

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列（GSPV F3）

<400>

agctgttaga tcatttccaa at                                               22

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列（GSPV B3）

<400>

cgttcatttt acaagatgtc ttc                                              23

<210>  11

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列（GSPV FIP）

<400>

catctaggga ggttgctgga aatgtgaggc atcctttttg aaag                       44

<210>  12

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列（GSPV BIP）

<400>

atcagagatg gctgttgtga tatccagcaa ctatgtctac cga                        43