一种鉴别迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的PCR鉴定引物及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的PCR鉴定引物及其鉴定方法，特别涉 及一种基于PCR-RFLP技术鉴别韭蛆与菌蛆的引物及鉴别方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

韭菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga）幼虫俗称韭蛆，是韭菜的主要害虫。以幼虫危害 韭菜叶鞘、幼芽和鳞茎，引起鳞茎腐烂、叶片枯死，轻者造成倒伏枯黄，重者缺苗断垄，严 重影响韭菜产量和质量。

异迟眼蕈蚊（Bradysia difformis）幼虫俗称菌蛆，与迟眼蕈蚊同隶属于迟眼蕈蚊属。韭 蛆与菌蛆传统的区分方法是依据两者的形态特征（石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭菜迟 眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11：21-22.；张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌异 迟眼蕈蚊的生物学特性.中国食用菌，27（6）：54-56.），而韭蛆与菌蛆在形态上相似，非 专业人士不能区分，不利于韭蛆与菌蛆的快速鉴定。同时韭蛆与菌蛆常混合发生，精确区分 韭蛆与菌蛆是进行有效防控的前提和基础，这对于韭蛆与菌蛆的综合防控具有重要的理论意 义和指导价值。

PCR-RFLP（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）技术，又称为CAPS技术（Cleaved  Amplilfed Polymorphism Sequences），其基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源（基因 数据库、基因组或cDNA克隆及克隆的RAPD条带等）设计一套特异性的PCR引物（19～27bp）， 然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。该技术揭示的是特异PCR片段 的限制性长度变异的信息。PCR-RFLP是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中 膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度-能够揭示单个碱基的差异。另外，由于很多 限制性内切酶均可与DNA扩增片段酶切，所以检测到多态性机会较大。

PCR-RFLP技术已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传 分化鉴定等方面。但利用PCR-RFLP技术构建区分韭蛆与菌蛆的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别韭蛆与菌蛆的引物及方法。

一种鉴别韭蛆与菌蛆的PCR鉴定引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID  NO.2所示的核苷酸序列。

正义引物F1：5’-TCTTTAAGWATATTAATTCGAGC-3’；SEQ ID NO.1

反义引物R1：5’-TCAAAATARATGTTGATA-3’；SEQ ID NO.2

一种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：

（1）提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA中 的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）用限制性内切酶EcoR Ⅴ酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显 示被测样品有200bp和400bp的两条带时，则该被检测样品为韭菜迟眼蕈蚊幼虫；当PCR 产物电泳图谱显示被测样品有600bp的一条条带时，则为异迟眼蕈蚊幼虫。

优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq Buffer（缓 冲液）2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH₂0补至25μl；

优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行35个循环； 72℃延伸7分钟。

优选的，所述步骤（3）中限制内切酶EcoR Ⅴ酶切反应条件如下：37℃酶切1～16小时。

上述步骤（1）中提取待鉴定样品的基因组DNA和步骤（4）中琼脂糖凝胶电泳分析均 按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版 （北京：科学出版社，2002）。

所述步骤（1）中的待鉴定样品为韭菜迟眼蕈蚊幼虫或异迟眼蕈蚊幼虫。

有益效果

1、本发明所述鉴别韭蛆与菌蛆的引物能够扩增韭蛆与菌蛆基因组DNA中的线粒体COI 基因，为鉴定韭蛆与菌蛆提供了简便稳定的分子标记，解决了区分韭蛆与菌蛆的难题。

2、本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选韭蛆与菌蛆提供了简便 稳定的酶切标记。

3、本发明从分子水平探索了韭蛆与菌蛆线粒体COI基因的不同，探索建立了韭蛆与菌 蛆的鉴别技术，为今后韭蛆的种群动态鉴定、生物学以及综合防治奠定了基础。

附图说明

图1是实施例2中PCR产物经EcoR Ⅴ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中A、C：菌蛆，B：韭蛆；M：DL2000 DNA Marker；Cut、代表经过限制内切酶EcoR Ⅴ 酶切，Uncut、代表未经过限制内切酶EcoR Ⅴ酶切。

图2是实施例3中PCR产物经EcoR Ⅴ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中A：韭蛆，B：菌蛆；M：DL2000 DNA Marker；Cut、代表经过限制内切酶EcoR Ⅴ 酶切，Uncut、代表未经过限制内切酶EcoR Ⅴ酶切。

图3是实施例4中PCR产物经EcoR Ⅴ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

其中M：DL2000 DNA Marker；Cut、代表经过限制内切酶EcoR Ⅴ酶切，Uncut、代表 未经过限制内切酶EcoR Ⅴ酶切；A：样品采自山东省聊城市、B：样品采自山东省潍坊市、 C：样品采自山东省枣庄市、D：样品采自山东省菏泽市。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1、2中所述韭蛆与菌蛆于2011年采集于山东省威海市；按照（石宝才，路虹， 宫亚军等，2010.韭菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11:21-22.；张宏瑞，张晓云，沈登 荣等，2008.食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用菌，27（6）:54-56.） 中记载的方法对上述韭蛆与菌蛆进行检测，采集于山东省威海市的幼虫为韭蛆与菌蛆。

实施例所述EcoR Ⅴ内切酶购自TaKaRa公司，Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸 钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。

实施例1

（1）韭蛆与菌蛆基因组DNA的提取

将单头韭蛆与菌蛆分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为： 50mmol·L^-1Tris-HCl（pH8.0）、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS （十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃ 水浴10min后，制得韭蛆与菌蛆基因组DNA溶液。

（2）韭蛆与菌蛆COI基因的PCR扩增

分别以韭蛆基因组DNA溶液和菌蛆基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR 扩增产物；

PCR扩增体系为：

韭蛆基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.5μl；10×Taq Buffer： 5μl；10mM dNTP：1μl；ddH₂0补至50μl；

引物序列如下：

正义引物Hap-F：5’-TCTTTAAGWATATTAATTCGAGC-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Hap-R：5’-TCAAAATARATGTTGATA-3’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸 50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测，均检测出一 长度在600bp左右条带（如图1所示），对该条带进行双向测序，韭蛆得到的条带序列如SEQ  ID NO.3所示，菌蛆得到的条带序列如SEQ ID NO.4所示。

（4）利用限制性内切酶酶切位点分析软件WatCut(该分析软件可登陆如下网址使用 http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=restriction_new)，分析可得在片段 432bp处韭蛆与菌蛆有碱基差异，且韭蛆得到的条带在该处可被限制性内切酶EcoR Ⅴ酶切 （酶切位点GATATC）。

实施例2

一种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：

（1）将采集于山东省济南市的单头韭蛆与菌蛆个体分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml 的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L^-1Tris-HCl（pH8.0）、20mmol·L^-1NaCl、1mmol·L^-1EDTA、 1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min 后，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体COI基因进 行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

PCR扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer 2.5μl， 10mM dNTP 0.5μl，ddH₂0补至25μl；

引物序列如下：

正义引物Hap-F：5’-TCTTTAAGWATATTAATTCGAGC-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Hap-R：5’-TCAAAATARATGTTGATA-3’；SEQ ID NO.2

PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸 50秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

（3）用限制性内切酶EcoR Ⅴ酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

酶切体系如下：10×NEB缓冲液2μl；PCR扩增产物5μl；EcoR Ⅴ内切酶0.5μl；灭菌双 蒸水至15μl。

反应条件如下：37℃水浴2小时。

（4）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（3）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶 成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上有200bp和400bp左右的两条条带时 为韭蛆；成像胶片上有一条片段长度600bp左右的条带时为菌蛆，结果如图1所示，与按照 （石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11:21-22.；张宏 瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用 菌，27（6）:54-56.）中记载的方法进行检测的结果一致。

实施例3

如实施例2所述的鉴别韭蛆与菌蛆的方法，不同之处在于，所述韭蛆与菌蛆于2011年 采集于山东省济南市。

结果显示，成像胶片上有200bp和400bp左右的两条条带时为韭蛆；成像胶片上有一条 片段长度600bp左右的条带时为菌蛆，结果如图1所示，与按照（石宝才，路虹，宫亚军等， 2010.韭菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11:21-22.；张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008. 食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用菌，27（6）:54-56.）中记载的 方法进行检测的结果一致。

实施例4

如实施例3所述的鉴别韭蛆与菌蛆的方法，不同之处在于，所述韭蛆与菌蛆于2011年 采集于山东省4个地区，分别为A：样品采自山东省聊城市、B：样品采自山东省潍坊市、 C：样品采自山东省枣庄市、D：样品采自山东省菏泽市。

结果显示，成像胶片上有200bp和400bp左右的两条条带时为韭蛆；成像胶片上有一条 片段长度600bp左右的条带时为菌蛆，结果如图1所示，与按照（石宝才，路虹，宫亚军等， 2010.韭菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11:21-22.；张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008. 食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用菌，27（6）:54-56.）中记载的 方法进行检测的结果一致。