一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种提取方法，具体是一种总核酸 、总RNA和基因组DNA的同步提取方法。

背景技术

高质量的RNA和DNA在植物分子生物学研究中具有重要的作用，关系到 后续分子生物学研究的成功与否，如分子标记、基因克隆、基因上游 启动子序列的分离、Southern印迹分析、表达特性分析和cDNA文库构 建等。另外，随着分子生物学的发展，实验中对所需的核酸要求不但 质量高，而且类型多样，可能有的实验需要总核酸、部分实验需要总 RNA、还有实验需要基因组DNA。

目前，关于植物总核酸、总RNA和基因组DNA提取方法的报道较多，技 术也非常成熟，但多是在植物中应用不同方法分别对总核酸、总RNA和 基因组DNA进行提取，在应用中，由于分子生物学研究需要的核酸类型 多样，如分别提取总核酸、总RNA和基因组DNA，过程较为繁琐。经检 索，对于采用一种方法或一套试剂从植物中同步提取总核酸、总RNA和 基因组DNA的方法，未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种总核酸、总RNA和基因 组DNA的同步提取方法，可以同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA，不 仅节约了时间，而且节约了提取成本，以满足多种分子生物学研究的 需要。

本发明所采用的技术原理：

总核酸的提取：提取总核酸时，用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂进 行抽提。理论上，当用水饱和酚（pH ≈ 5，呈酸性）进行抽提时， RNA溶解于酸性的水相，DNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离。但实 验表明，水饱和酚只能去除少量的DNA，所以本方法采用水饱和酚提取 总核酸。提取总核酸时所用氯仿 的作用主要有以下几点：1、它是分子量比较大的有机溶剂，能加速有 机相与水相分层；2、它能去除核酸溶液中的痕量酚（酚易溶于氯仿中 ）；3、它能使蛋白质变性；4、它作为有机溶剂可抽提样品中的一些 脂溶性杂质（如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。 

总RNA的提取：提取总RNA时，除了用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂 进行抽提，还用到高浓度的酸性醋酸钾溶液，该溶液能使多糖和DNA一 起沉淀下来，使得水相中就只剩下RNA。

基因组DNA的提取：提取基因组DNA时，用Tris-饱和酚（pH > 7.8） 和氯仿组成的混合试剂进行抽提。Tris-饱和酚的中性偏碱性的环境使 DNA处于水相，RNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离，但实验证明， Tris-饱和酚也只能去除少量的RNA。为了有效去除RNA和多糖，本方法 中加入无水乙醇，原因在于这个体积比的无水乙醇能将多糖和RNA一起 沉淀下来，使得水相中就只剩下DNA。氯仿的作用与总核酸的提取中的 描述相同。

本发明所采用的技术方案：

一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，其步骤如下：

1、粗提

将植物材料粉碎后与SDS提取液混合，60～70℃水浴10～60分钟；离心 ，取上清得到粗提物上清液，三等分粗提物上清液后分别用于总核酸 、总RNA和基因组DNA的提取。

所述植物材料是指富含多糖多酚的植物，进一步优选香蕉。

所述植物材料粉碎是在液氮中将植物材料研磨成粉末。

所述的离心条件为：转速8000～12000 rpm，时间5～20分钟。

2、提取

总核酸的提取：在粗提物上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试 剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相；在上清液中加入 2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃ 并放置10分钟以上；离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次， 室温干燥，得到包含总RNA和 基因组DNA的总核酸。所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚 与氯仿的体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH 值为5.2。

总RNA的提取： 在粗提物上清液中加入1／5～5／5体积的醋酸钾溶液 ，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得 到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入水饱和酚与氯仿组 成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相，得到 第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和 1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离 心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到总RNA 。所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为 1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。

基因组DNA的提取：在粗提物上清液中加入1／10～1／2体积无水乙醇 ，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得 到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入Tris-饱和酚与氯仿 组成的混合试剂，混匀，离心，取上清，重复此步至无中间相，得到 第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和 1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离 心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到基因组 DNA。所述Tris-饱和酚与氯仿组成的混合试剂中Tris-饱和酚与氯仿的 体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。

本发明将SDS提取液与其它试剂相结合，可以同步提取总核酸、总RNA 和基因组DNA，不仅节约了时间，而且节约了提取成本，可以满足多种 分子生物学研究的需要，具有现实意义。

附图说明

图1是香蕉叶片总核酸、总RNA和基因组DNA提取电泳图。1：总核酸； 2：总RNA；3：基因组DNA。

图2是香蕉Actin1基因的RT-PCR。M：DNA Marker；1:总核酸中的总R NA的反转录产物；2：总RNA的反转录产物。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下 实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中 未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建 议的条件。

实施例一、香蕉叶片总核酸、总RNA和基因组DNA的提取

称取香蕉叶片约0.6 g，于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有2.4  mL SDS提取液的10 mL离心管中，65 ℃水浴10分钟；12000 rpm离 心10分钟，得到粗提物上清液，三等分上清液后分别用于总核酸、总 RNA和基因组DNA的提取。

总核酸的提取：在粗提物上清液中加入与粗提物上清液等体积的由水 饱和酚和氯仿组成的混合试剂（其中水饱和酚和氯仿的体积比为1︰1 ），轻轻上下颠倒混匀，12000 rpm离心10分钟，取上清，重复此步 至无中间相；加入1／10上清液体积的3 mol／L醋酸钠溶液（pH值为 5.2）和2倍上清液体积的无水乙醇，冰浴10分钟以上；12000 rpm离 心10分钟，弃上清，用75 %的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，得到包 含总RNA和基因组DNA的总核酸。

总RNA的提取：在粗提物上清液中加入相当于粗提物上清液1／3体积的 5 mol／L醋酸钾溶液（pH值为4.8），轻轻上下颠倒混匀，冰上放置 10分钟；12000 rpm离心10分钟，取上清，后续步骤中的水饱和酚和 氯仿混合试剂抽提总RNA、总RNA的沉淀和洗涤、以及总RNA的电泳检查 与总核酸提取方法中的相应步骤相同。

基因组DNA的提取：在粗提物上清液中加入相当于粗提物上清液1／3体 积的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，冰上放置10分钟；12000 rpm离 心10分钟，取上清，加入与上清液等体积的Tris-饱和酚和氯仿组成的 混合试剂，其中Tris-饱和酚和氯仿的体积比为1︰1，轻轻上下颠倒混 匀，重复此步至无中间相；12000 rpm离心10分钟，取上清，上清液 中的基因组DNA的沉淀、洗涤以及电泳检查与总核酸提取方法的相应步 骤相同。

试验分析：

1、总核酸的质量分析

将总核酸溶于50 μL DEPC处理的双蒸水中；取2 μL总核酸，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压为120 V，当溴酚蓝离进样孔的距 离达到胶面长度的1／3时取出，于凝胶成像系统上拍照分析，结果如 图1所示。从电泳结果可以看出，本发明提取的总核酸中没有蛋白、多 糖等物质的污染，并且DNA和RNA条带清晰、整齐。

1）、总核酸中总RNA的质量分析

取20μL总核酸，用不含RNA酶的DNA酶消化总核酸中的DNA，然后用水 饱和酚和氯仿混合试剂抽提一次，以去除DNA酶，接着加入1／10上清 液体积的3 mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2）和2倍上清液体积的无水 乙醇沉淀总RNA，将总RNA用75 %的乙醇洗涤2次后，溶于10 μL D EPC处理的双蒸水中。用紫外可见分光光度计（岛津UV-2550）检测总 RNA的质量，结果表明：RNA浓度为150.73 ± 2.16 μg／ml，OD2 60／280为2.029 ± 0.027，OD260／230为2.184 ± 0.035。将0 .5μg总RNA进行反转录，用M-MLV反转录酶（TransGen Biotech No  AT101-01）进行反转录，反转录反应体系和反应程序参考说明书的 方法进行。以香蕉Actin1基因为内参基因，检测反转录合成cDNA的质 量。根据NCBI数据库中登录的香蕉Actin1序列（AF246288.1），设计 扩增香蕉Actin1基因的特异引物，Actin1-F：CCTCCATCCTTCGGTCTCCT ；Actin1-R：GACCCATTCCGACCATCACA。取l μL的cDNA模板进行PCR扩 增，PCR扩增体系为：模板1 μL，10×PCR缓冲溶液2.5 μL，2.5  mmol／L dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL，Taq酶0.2 μL，最 后加灭菌的双蒸水至总体积为25 μL。反应条件为：94 ℃预变性2 分钟，94 ℃变性30秒，59 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，共进行 35个循环，72 ℃延伸7分钟。在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产 物，结果见图2。如图2所示，本方法从香蕉叶片总核酸的总RNA反转录 产物中成功地克隆到了大约241 bp的目标片段，测序结果表明克隆到 的片段与目标片段的同源性达到了99 %。这些实验结果说明该方法提 取的香蕉总核酸中总RNA的质量较高。

2）、总核酸中基因组DNA的质量分析

取20μL总核酸，用不含DNA酶的RNA酶消化总核酸中的RNA，然后用Tr is- 饱和酚和氯仿混合试剂抽提一次，以去除RNA酶，接着加入1／10上清 液体积的3 mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2）和2倍上清液体积的无水 乙醇沉淀基因组DNA，将基因组DNA用75 %的乙醇洗涤2次后，溶于10  μL灭菌的双蒸水中。用紫外可见分光光度计检测基因组DNA的质量 ，结果表明：DNA浓度为121.14 ± 2.95 μg／ml，OD260／280为 1.912 ± 0.033，说明该方法提取的总核酸中基因组DNA的质量较高 。

2、基因组DNA的质量分析

取2 μL基因组DNA，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1 所示。 基因组DNA条带整齐、无降解。用紫外可见分光光度计检测基 因组DNA的质量，结果表明：所提取的DNA浓度为137.65 ± 3.81  μg／ml，OD260／280是1.937 ± 0.020，说明提取的基因组DNA质 量较高。 

3、总RNA的质量分析

取2 μL总RNA，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示 。 RNA没有蛋白、多糖和DNA的污染，并且28S、18S条带清晰、整齐 。用紫外可见分光光度计检测RNA的质量，RNA浓度为142.96 ± 4. 73 μg／ml，OD260／280为2.035 ± 0.036，OD260／230为2.236  ± 0.028。将0.5μg总RNA进行反转录，反转录完成后以香蕉Acti n1基因为内参基因，检测总RNA提取以及cDNA合成的质量。总RNA反转 录产物的PCR反应体系和反应程序与总核酸中总RNA反转录产物的PCR反 应体系和反应程序相同。结果如图2所示，本方法从香蕉叶片的总RNA 反转录产物中成功地克隆到了大约241 bp的目标片段，测序结果表明 克隆到的片段与目标片段的同源性达到了100%。这些实验结果说明该 方法提取的香蕉总RNA具有较高的质量，能满足分子生物学研究的要求 。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出 若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。