注射用阿奇霉素中有关物质的检查方法

技术领域

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及注射用阿奇霉素中有关 物质的检查方法。

背景技术

注射用阿奇霉素中有关物质的检查是评价其安全性的一个重要 指标。注射用阿奇霉素中有关物质主要指阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、 红霉素A偕亚胺醚等。

相关技术中，注射用阿奇霉素中有关物质的检查是采用薄层色 谱法（TLC）：将供试品（注射用阿奇霉素）和对照液分别在硅胶G 薄层板上点样，通过比较两者的斑点数量和颜色深浅来判断有关物 质含量是否达到安全水平。各种检查方法只是将对照液的种类和浓 度稍作改变，所用的原理都相同，例如，国家药品标准WS₁-（X-296） -2003Z：

取供试品（注射用阿奇霉素），用无水乙醇溶解并稀释制成每 1ml含阿奇霉素20mg的溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液和 红霉素标准品，用无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中含阿奇霉素和 红霉素各0.4mg的溶液，作为对照溶液（1）；另取供试品溶液二份， 分别用无水乙醇制成每1ml含阿奇霉素0.6mg和0.2mg的溶液，作 为对照溶液（2）和（3）。精密吸取上述四种溶液各10μl，分别点 于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-正己烷-二乙胺（10:10:2）为 展开剂，展开后晾干，喷以显色剂（取钼酸钠2.5g、硫酸铈1g，加 10％硫酸溶液溶解并稀释至100ml），置105℃加热数分钟。当对照 溶液（1）中阿奇霉素与红霉素斑点完全分离，供试品溶液的杂质斑 点不超过3个，且各杂质斑点的颜色与对照溶液的主斑点比较，最 大的一个杂质斑点不深于对照溶液（2）的主斑点（3％），其他两个 杂质斑点均分别不深于对照溶液（3）的主斑点（1％）时，该供试 品有关物质含量达到安全水平，否则达不到安全水平。

由上文可知，相关技术中的检查方法只能实现半定量评价有关 物质含量的目的，无法实现定量评价，因而不能进行更科学地研究， 例如影响其注射剂安全性的原因分析等。

发明内容

本发明的目的在于提供注射用阿奇霉素中有关物质的检查方 法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了注射用阿奇霉素中有关物质的检查 方法，包括下列步骤：

步骤A：取阿奇霉素B对照品，并用氯化钠注射液将其稀释为 同一浓度或不同浓度的溶液，再用这些溶液按照阿奇霉素B注入量 递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验，直至某一阿奇霉素B注 入量的试验的复试中出现小鼠死亡结果时，将该试验的前一个试验 中所用的阿奇霉素B注入量定为阿奇霉素B的注入量限度；

步骤B：取阿奇霉素G_x对照品，并用氯化钠注射液将其稀释为 同一浓度或不同浓度的溶液，再用这些溶液按照阿奇霉素G_x注入量 递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验，直至某一阿奇霉素G_x注入量的试验的复试中出现小鼠死亡结果时，将该试验的前一个试 验中所用的阿奇霉素G_x注入量定为阿奇霉素G_x的注入量限度；

步骤C：取红霉素A偕亚胺醚对照品，并用氯化钠注射液将其 稀释为同一浓度或不同浓度的溶液，再用这些溶液按照红霉素A偕 亚胺醚注入量递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验，直至某一 红霉素A偕亚胺醚注入量的试验的复试中出现小鼠死亡结果时，将 该试验的前一个试验中所用的红霉素A偕亚胺醚注入量定为红霉素 A偕亚胺醚的注入量限度；

步骤D：定量分析待测注射用阿奇霉素中阿奇霉素B的含量 C₁、阿奇霉素G_x的含量C₂、红霉素A偕亚胺醚的含量C₃、阿奇霉 素的含量C；

步骤E：根据待测注射用阿奇霉素的每次最大用量m，以及下 列公式计算，得到阿奇霉素B的杂质限度W₁、阿奇霉素G_x的杂质 限度W₂和红霉素A偕亚胺醚的杂质限度W₃：

步骤F：将分别一一对应地与所述W₁，W₂，W₃进行比较；若且且则所述待测注射用阿 奇霉素中有关物质含量达到安全水平，否则达不到安全水平。

本发明上述实施例的注射用阿奇霉素中有关物质的检查方法， 可以实现定量检查注射用阿奇霉素中阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、红 霉素A偕亚胺醚三种有关物质的目的，具体为：

所述步骤A至C采用异常毒性检查法，分别测定了阿奇霉素B、 阿奇霉素G_x、红霉素A偕亚胺醚三种有关物质的注入量限度，进而 通过所述步骤E得到三种有关物质的杂质限度W₁，W₂，W₃；

再通过所述步骤D的定量分析得到三种有关物质的含量C₁、 C₂、C₃，以及该药物的有效成分阿奇霉素的含量C；

最后计算待测注射用阿奇霉素中三种有关物质与有效成分阿奇 霉素的含量比值，即再将这三个值分别一一对应地与 所述W₁，W₂，W₃进行比较，即与W₁，与W₂，与W₃进行比较，若且且则所述待测注射用 阿奇霉素中有关物质含量达到安全水平，否则没达到安全水平；

由此可知，本发明的方法通过定量测定阿奇霉素B、阿奇霉素 G_x、红霉素A偕亚胺醚三种杂质有关物质的杂质限度，以及待测注 射用阿奇霉素中三种有关物质的含量，实现了定量评价的目的，该 结果可用于其它进一步的研究。

附图说明

图1为本发明的试验例中所述第一样品的高效液相色谱图；

图2为本发明的试验例中所述第二样品的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细 描述。

实施例

本发明的实施例提供了注射用阿奇霉素中有关物质的检查方 法，包括下列步骤：

步骤101：取阿奇霉素B对照品，并用氯化钠注射液将其稀释 为同一浓度或不同浓度的溶液，再用这些溶液按照阿奇霉素B注入 量递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验，直至某一阿奇霉素B 注入量的试验的复试中出现小鼠死亡结果时，将该试验的前一个试 验中所用的阿奇霉素B注入量定为阿奇霉素B的注入量限度；

步骤102：取阿奇霉素G_x对照品，并用氯化钠注射液将其稀释 为同一浓度或不同浓度的溶液，再用这些溶液按照阿奇霉素G_x注入 量递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验，直至某一阿奇霉素G_x注入量的试验的复试中出现小鼠死亡结果时，将该试验的前一个试 验中所用的阿奇霉素G_x注入量定为阿奇霉素G_x的注入量限度；

步骤103：取红霉素A偕亚胺醚对照品，并用氯化钠注射液将 其稀释为同一浓度或不同浓度的溶液，再用这些溶液按照红霉素A 偕亚胺醚注入量递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验，直至某 一红霉素A偕亚胺醚注入量的试验的复试中出现小鼠死亡结果时， 将该试验的前一个试验中所用的红霉素A偕亚胺醚注入量定为红霉 素A偕亚胺醚的注入量限度；

步骤104：定量分析待测注射用阿奇霉素中阿奇霉素B的含量 C₁、阿奇霉素G_x的含量C₂、红霉素A偕亚胺醚的含量C₃、阿奇霉 素的含量C；

步骤105：根据待测注射用阿奇霉素的每次最大用量m，以及 下列公式计算，得到阿奇霉素B的杂质限度W₁、阿奇霉素G_x的杂 质限度W₂和红霉素A偕亚胺醚的杂质限度W₃：

步骤106：将分别一一对应地与所述W₁，W₂，W₃进行比较；若且且则所述待测注射用阿 奇霉素中有关物质含量达到安全水平，否则达不到安全水平。

上述实施例的注射用阿奇霉素中有关物质的检查方法，可以实 现定量检查注射用阿奇霉素中阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、红霉素A 偕亚胺醚三种有关物质的目的，具体为：

所述步骤101至103采用异常毒性检查法，分别测定了阿奇霉 素B、阿奇霉素G_x、红霉素A偕亚胺醚三种有关物质的注入量限度， 进而通过所述步骤105得到三种有关物质的杂质限度W₁，W₂， W₃；

再通过所述步骤104的定量分析得到三种有关物质的含量C₁、 C₂、C₃，以及该药物的有效成分阿奇霉素的含量C；

最后计算待测注射用阿奇霉素中三种有关物质与有效成分阿奇 霉素的含量比值，即再将这三个值分别一一对应地与 所述W₁，W₂，W₃进行比较，即与W₁，与W₂，与W₃进行比较，若且且则所述待测注射用 阿奇霉素中有关物质含量达到安全水平，否则没达到安全水平；

由此可知，本发明的方法通过定量测定阿奇霉素B、阿奇霉素 G_x、红霉素A偕亚胺醚三种有关物质的杂质限度，以及待测注射用 阿奇霉素中三种有关物质的含量，实现了定量评价的目的，该结果 可用于其它进一步的研究。可见，本发明为药物中有关物质的安全 性评价提供了一个新的科学途径，并且该方法还可以用于检查注射 用阿奇霉素中的其它有关物质，具体试验条件可以通过有限次的试 验得出。

其中，所述异常毒性检查法参见《中华人民共和国药典》2010 年版附录XIC：取体重为17-20g的健康小鼠5只，将对照品溶液注 入小鼠尾静脉，应在4-5秒内匀速注射完毕，记录给药后48小时内 小鼠死亡情况；如有死亡时，另取体重18-19g的健康小鼠10只复 试，记录给药后48小时内小鼠死亡情况。

所述m针对不同的治疗对象，会有所不同，一般人用该药物的 m为0.5g。（可参见具体产品的说明书）

所述定量分析方法可采用高效液相色谱分析法，或者其它适于 定量测量三种有关物质及有效成分的方法。

上述方法的所述步骤101至103中，用氯化钠注射液将每步对 应的对照品稀释为不同浓度的溶液，再取相同剂量的这些溶液按照 浓度递增的顺序依次进行异常毒性检查法试验。采用这种“剂量相 同、浓度不同”的方式改变注入量，可以减少各个试验组间的其它因 素的影响，提高方法的准确度。

当所述步骤104使用高效液相色谱分析法进行定量分析时，为 了更进一步的本检查方法的准确度、科学性，该方法还可以在以下 方面进行改进。

（一）优选地，所述高效液相色谱法检测C₁、C₂、C₃、C所用 的填充剂均为十八烷基硅烷键合硅胶，所用的流动相均为体积比为 45:55的磷酸盐缓冲液-乙腈；检测波长为210nm。经试验证明，采 用这种分析条件，分析结果准确度和精确度更高，且检测时间短。

（二）优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为8.2-8.4，其中更 优选地为8.2。经试验证明，采用该pH值的缓冲液，检测时间更短， 提高了检测效率。其中，优选地，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为： 取0.05mol/L磷酸氢二钾溶液，用0.2g/mL的磷酸溶液调节pH值至 8.2，该方法所用的两种试剂成本低，且易获得，降低了试验成本。

（三）优选地，所述高效液相色谱法为：用乙腈将待测注射用 阿奇霉素稀释为一定浓度的溶液，作为第一样品；再将第一检测样 品稀释n倍作为第二样品；向高效液相色谱仪注入所述第一样品， 检测C₁，C₂，C₃；向高效液相色谱仪中注入所述第二样品，检测C； 所述n为50-150。阿奇霉素及三种有关物质在乙腈中的溶解度高， 更利于检测。而同时采用不同浓度的溶液分别检测三种物质和有效 成分，可以提高方法的准确度：通常待测注射用阿奇霉素中的有关 物质（杂质）含量较低，即同一溶液中三种有关物质的浓度和阿奇 霉素的浓度相差过大，如果采用同一浓度的溶液同时检测这四种物 质，会超出仪器的检测限或者过于接近仪器的检测限，降低方法的 准确度。

（四）优选地，所述第一样品中注射用阿奇霉素的浓度为 8-10mg/mL，且所述n=100。经过试验证明，该检测方法的准确度 和精密度更高。同理，优选地，所述第一样品和第二样品的注入量 均为50μL。

为了更详细地说明本发明的方法的性能，以下还提供了具体试 验例。

试验例

试验方法：

异常毒性检查法试验：分别取阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、红霉 素A偕亚胺醚对照品，用氯化钠注射液制成不同浓度的溶液，取健 康小鼠（体重17-20g）5只，将供试品溶液注入小鼠尾静脉，应在 4-5秒匀速注射完毕，每只小鼠分别给予供试品溶液0.5ml，记录给 药后48小时内小鼠死亡情况；如有死亡时，另取体重18-19g的健 康小鼠10只复试，记录给药后48小时内小鼠死亡情况。

高效液相色谱法试验：

精密称取注射用阿奇霉素98.21mg，加乙腈溶解并稀释制成浓 度为9.821mg/ml的溶液，作为第一样品；精密量取1ml，置100ml 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为第二样品，用十八烷基 硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（取0.05mol/L磷酸氢二 钾溶液，用20％的磷酸溶液调节pH值至8.2）-乙腈（体积比，45:55） 为流动相；检测波长为210nm，精密量取第一样品和第二样品各 50μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰（阿奇霉素的 峰）保留时间的2倍。

由于阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、红霉素A偕亚胺醚和阿奇霉素 四种物质在同一液相检测条件下的光吸收率不同，所以为了便于后 期四种物质浓度的比较，本试验还检测了阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、 红霉素A偕亚胺醚三种物质相对于阿奇霉素的校正因子f。

f的测量方法：取阿奇霉素和杂质阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、 红霉素A偕亚胺醚四个物质的对照品各适量，置同一容量瓶中加流 动相{磷酸盐缓冲液（取0.05mol/L磷酸氢二钾溶液，用20％的磷酸 溶液调节pH值至8.2）-乙腈（45:55）}溶解，并稀释成四种物质各 含约10mg/ml的溶液，作为混合溶液。量取上述混合溶液50μl注入 液相色谱仪，记录色谱图，读取各物质峰峰面积按下式计算各杂质 的校正因子：

M_杂质：杂质的称样质量

M_阿奇：阿奇霉素的称样质量

A_杂质：杂质的峰面积

A_阿奇：阿奇霉素的峰面积

试验结果：

异常毒性检查法试验：由表一至表三可知，阿奇霉素B注入量 限度为3.73mg，阿奇霉素G_x注入量限度为1.91mg，红霉素A偕亚 胺醚注入量限度为1.75mg。

本试验以人为药物将来的使用对象，其注射用阿奇霉素每次最 大用量m为0.5g。由此得到阿奇霉素B的杂质限度为0.746% （3.73/500），阿奇霉素G_x的杂质限度为0.382%（1.91/500），红霉 素A偕亚胺醚的杂质限度为0.35%（1.75/500）。

表一 阿奇霉素B对照品的异常毒性实验

表二 阿奇霉素G_x对照品的异常毒性实验

表三 红霉素A偕亚胺醚对照品的异常毒性实验

高效液相色谱法试验：

如图1和图2所示，阿奇霉素B，阿奇霉素G_x，红霉素A偕亚 胺醚、阿奇霉素的保留时间分别为：24.856，9.786，4.216，15.630。 图1为所述第一样品的色谱图；图2为所述第二样品的色谱图。

各杂质的校正因子如表四所示。

表四 各杂质校正因子测定结果

最后，将所述第一样品中阿奇霉素B、阿奇霉素G_x、红霉素A 偕亚胺醚的峰面积分别乘以各自的校正因子，由于所述第一样品的 浓度是所述第二样品的100倍，再将所述第二样品中阿奇霉素的峰 面积乘以100，再与上述校正过的三个杂质的峰面积相除，得到三 种杂质与阿奇霉素的含量比值：阿奇霉素B为0.434%，阿奇霉素 G_x为0.148%，红霉素A偕亚胺醚为0.179%，将该三个值与异常毒 性试验所得的杂质限度一一对应地进行比较：0.434%<0.746%， 0.148%<0.382%，0.179%<0.35%。

可见，本试验例中所检查的注射用阿奇霉素产品有关物质的含 量达到安全水平。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。