PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种重组质粒，尤其是涉及PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与在 制备治疗人胆管癌药物中的应用。

背景技术

FBW7（F-box and WD repeat domain-containing7）最早发现于大肠杆菌中，最初命名为 Cdc4，又称FBXW7、SEL-10、hAgo、hCDC4，是SCF(SKP1/CUL1/F-box)复合物型泛素连接 酶，常参与底物的泛素化。

所谓泛素化是指将底物蛋白转变成为泛素的化学反应，导致底物功能丧失并降解。泛素 化具有重要的生命意义，近年来，从泛素化的角度研究肿瘤的发生发展成为肿瘤研究的重要 部分(1.Philip Cohen and Marianna Tcherpakov.Will the Ubiquitin System Furnish as Many Drug  Targets as Protein Kinases?Cell.2010.143:686-693)。通过泛素连接酶了解泛素化是该研究的重 要部分。FBW7在大肠杆菌分裂中发挥作用。

其他研究证实，FBW7还可调控细胞周期、细胞生长、分化等，FBW7突变或功能缺失 会引起染色体不稳定及细胞的病变，甚至癌变。文献报道，在胆管癌中FBW7突变率是最高 的，达到35%(2.Shahab Akhoondi,Dahui Sun,Natalie von der Lehr,et al.FBXW7/hCDC4is a  General Tumor Suppressor in Human Cancer.Cancer Res.2007.67(19):9006-12)，在T型急性淋巴 细胞白血病、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜、胰腺癌、和胃癌中的突变率均大于6%。在小鼠中 FBW7+/-杂合体比FBW7+/+纯合体有更高的致瘤率(3.Welcker M，Clurman BE.Ubiquitin  ligase：a tumour suppressor at the crossroads of cell division，growth and differentiation.Nat Rev  Cancer.2008.8:83-93)。

由此可见，FBW7突变和肿瘤关系密切。FBW7作用底物很广泛，有的是原癌基因，有 的是细胞周期蛋白，很多都和肿瘤的发生和发展具有密切关系。

现已有文献证实，在细胞水平FBW7的高表达将会直接导致癌细胞生长的不正常、甚至 凋亡，证明了FBW7就是抑癌基因(4.Crusio KM,King B,Reavie LB,Aifantis I.The ubiquitous  natureof cancer:the role of the SCF(Fbw7)complex in development and transformation. Oncogene.2010.29:4865–73)。

此外FBW7的缺失会促进肿瘤的抗药性(5.Zhiwei Wang,Hidefumi Fukushima,Daming  Gao,Hiroyuki Inuzuka,Lixin Wan,Alan W.Lau,Pengda Liu and Wenyi Wei.The two faces of  FBW7in cancer drug resistance.Bioessays.2011.33:851–859)。在乳腺癌中，FBW7和mTOR的 关系已有报道，敲除FBW7将会导致mTOR表达量的上升(6.Jian-Hua Mao,et al.FBXW7 Targets mTOR for Degradation and Cooperates with PTEN in Tumor Suppression. Science.2008.321:1499-1502)。此外，在乳腺癌中C/EBPδ可以抑制FBW7的表达，从而增 强mTOR/AKT/HIF-1信号通路的活性，利于乳腺癌的发生和发展；FBW7和NOTCH1信号 通路在乳腺癌中也具有重要的关系，FBW7的缺失使得NOTCH1信号加强，进一步导致 NOTCH1依赖性的MYC调节失败，和AKT高表达。MYC在乳腺癌中也受到FBW7直接 泛素化的调节，所以乳腺癌中NOTCH1/AKT/mTOR信号通路都和FBW7具有密切的关系 (7.Jinhua Xu,Yinghua Chen,and Olufunmilayo I.Olopade.MYC and Breast Cancer.Genes& Cancer.2010.1(6):629-640)。

另外，FBW7的拮抗物去泛素化酶Usp28在乳腺癌中常常高表达，对乳腺癌的发生发展 有利，而KLF5等乳腺癌的原癌基因都受到FBW7的泛素化降解。在胆管癌中已经发现 mTOR和NOTCH1不正常表达，和胆管癌关系密切(8.Wang Z,Zheng T,Wu Q,Wang J,Wu C, Wang J.Immunohistochemical analysis of the mTOR pathway in intrahepatic cholangiocarcinoma. Neoplasma.2012.59(2):137-41;9.Hyun Ah Yoon,Myung Hwan Noh,Byung Geun Kim,Ji Sun Han, Jin Seok Jang,Seok Ryeol Choi,Jin Sook Jeong,Jin Ho Chun.Clinicopathological signiicance of  altered Notch signaling in extrahepatic cholangiocarcinoma and gallbladder carcinoma.World J  Gastroenterol.2011.17(35):4023-4030)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与应用。

所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒是通过提取人Fbw7基因全长，以含新霉素筛选标签的 PcDNA3.1(+)质粒为载体，在PcDNA3.1(+)的和限制性酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间插入 Fbw7基因全长，构建的一种含Fbw7基因全长和新霉素筛选标签的PcDNA3.1(+)-Fbw7重组 质粒。

所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)将PSG5-Myc-Fbw7质粒谱图信息与PcDNA3.1(+)质粒谱图信息比较，确定双酶切位点 EcoRⅠ和NotⅠ；

2)双酶切PSG5-Myc-Fbw7质粒，具体反应体系（20μL）如下：

PSG5-Myc-Fbw71μg，EcoRⅠ1.0μL，NotⅠ1.0μL，1×H2.0μL，BSA2.0μL，灭菌超 纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

3)双酶切PcDNA3.1(+)质粒载体，具体反应体系（20μL）如下：

PcDNA3.1(+)1μg，EcoRⅠ1.0μL，NotⅠ1.0μL，1×H2.0μL，BSA2.0μL，灭菌超纯 水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

4)通过琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效率，将质粒载体PcDNA3.1(+)和目的基因Fbw7全长 进行连接，具体反应体系（10μL）如下：

10×反应缓冲液1.0μL，PCDNA3.1(+)2.0μL，Fbw76.0μL，T4DNA连接酶1.0μL， 各组份混匀后，16℃金属浴中连接过夜；

5)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，如鉴定结果为阳性克隆， 则抽提PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒；

6)将步骤5)所述抽提的PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒进行DNA测序分析，选取双向测序 模式，使用PcDNA3.1(+)质粒通用引物横跨质粒的多克隆位点区逐个碱基检测，检测结果与 Fbw7序列进行比对。

在步骤5）中，所述测序鉴定的具体方法可为：

用第1对引物进行菌落PCR扩增，对扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，如所得DNA 片段长度为244bp，则鉴定为阳性克隆，所述第1对引物为：

正向引物：5’-ctacccaaaagtaatcatcttaagtg-3’；

反向引物：5’-cccaaccatgacaagattttcc-3’；

用第2对引物进行菌落PCR扩增，对扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，如所得DNA 片段长度为278bp，则鉴定为阳性克隆，所述第2对引物为：

正向引物：5’-tttctgtttctccctctg-3’；

反向引物：5’-gagcatttaagggagagataagag-3’。

在步骤6)中，所述进行DNA测序分析可将步骤5)所述抽提的PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质 粒送至美国Invitrogen公司进行DNA测序分析；所述选检测结果与Fbw7序列进行比对的结 果如下：

结果显示在914位点发生一同义突变：CUC突变为CUU，由于生物的遗传密码子存在 简并现象，所编码的氨基酸仍旧为亮氨酸，不会影响其翻译的蛋白质的结构和功能，鉴定结 果为阳性，完成PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒的构建。

本发明应用带有Fbw7的质粒的胆管癌细胞株（即稳定表达Fbw7的胆管癌细胞株）研究 泛素连接酶Fbw7对胆管癌细胞的影响，所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒可用于制备治疗人 胆管癌的药物。

以下给出稳定转染PcDNA3.1(+)-Fbw7质粒的细胞株的建立方法，具体步骤为：

1)将带新霉素抗性筛选的PcDNA3.1(+)-Fbw7质粒用脂质体2000试剂转染人胆管癌细胞 株，转染具体步骤如下：

(1)待细胞生长至密度为70%～90%时进行转染，使用150μL的opti-MEM稀释3μg质粒；

(2)用150μL的opti-MEM稀释10μL的然后室温作用5min；

(3)5min后将步骤(1)中的混合液加至步骤(2)中的混合液，轻轻吹打混匀，室温作用c；

(4)20min期间，将转染的细胞用磷酸缓冲液漂洗一次，更换为无双抗的培养基；

(5)20min后将上述混合的转染液加入细胞左右摇匀；

(6)细胞培养两天后检测转染效率并准备开始筛选工作；

2)转染后，将人胆管癌细胞株消化后转接到细胞培养皿中，培养液可为1640培养基；

3)在培养液中加入G418（新霉素类似物）进行筛选；筛选期间换培养液的间隔时间为3～ 4天；

4)将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100μg/ml～1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选， 选择出在10～14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验；

5)由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质，在转染24h之后加G418 筛选，每3～5天都要更换一次含有G418的筛选液，这时药物浓度可以降至1000μg/mL；

6)挑选单克隆的优化，为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增 加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆；加药后，在 高倍镜下刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环 内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养，最后再用有限稀释法把 阳性克隆在96孔板中筛选；

7)经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定，外源基因没有整合到基因组中的 目的基因会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异，随着培养时间的延续，那些丢失了外源 基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少，经 过2次以上的筛选之后得到强分泌目的蛋白，遗传稳定的细胞克隆。

实验发现，胆管癌患者Fbw7核酸表达水平显著低于正常人，将Fbw7转染到胆管癌细胞 株中，结果显示，Fbw7可以抑制胆管癌细胞的增殖和迁移能力，并且介导胆管癌细胞对药物 的耐受性。

本发明提供了一种PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒的构建方法以及PcDNA3.1(+)-Fbw7重组 质粒在制备治疗人胆管癌肿瘤药物中的应用。该重组质粒可溶于水或者TE等缓冲液配成溶 液，或用冷冻干燥法制成干粉。该重组质粒能在能在细胞水平抑制人胆管癌细胞的增殖和迁 移能力，降低和肿瘤相关的细胞抗凋亡基因表达，阻断肿瘤细胞周期相关进展，并降低人胆 管癌细胞的抗肿瘤药物的耐药性。为人胆管癌的治疗提供新的靶点和治疗思路，推动人胆管 癌研究的进展。

附图说明

图1为重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7抑制胆管癌细胞株增殖的能力。在图1中，横坐标 为天数，纵坐标为吸光值(560nm)；标记■为vector，●为Fbw7。

图2为重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7抑制胆管癌细胞株迁移的能力。在图2中，纵坐标 为细胞数量（10⁴）。

图3为Fbw7对顺铂介导QBC939增殖的影响。在图3中，纵坐标为吸光值（490nm）； 标记a为8uM，b为16uM。

图4为pcDNA3.1(+)质粒图谱。

图5为pSG5-Myc质粒图谱。

具体实施方式

实施例1

重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7对胆管癌细胞株增殖能力的影响，具体操作步骤如下：

取对数生长期的胆管癌进行转染，对转染24h后的细胞消化后计数，以每孔5000个细胞 接种于96孔板中，每个组别设立8个复孔，终体积200μL/孔，并设一列无细胞仅有200μL 培养液作为空白对照孔，边缘孔用PBS填充，放入5%CO₂培养箱中37℃过夜贴壁。按实验 设计要求在培养不同时间后避光加入MTT，加入前每空移除培养基，每孔加入60μL培养基 和10μL浓度为5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育6h后小心吸出MTT，每孔加100μL二甲 基亚砜，避光低频振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪560nm测量各孔的吸 光值，通过比较吸光值判断细胞增殖或存活情况。

重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7抑制胆管癌细胞株增殖的能力，结果见图1，可以看出在胆 管癌细胞QBC939中，与转染空载质粒的细胞相比，转染重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7可以 抑制细胞增殖。

实施例2

重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7对胆管癌细胞株迁移能力的影响，具体操作步骤如下：

细胞血清饥饿处理24h，DMEM无血清培养液水化Migration/Invasion小室：小室上层加 入500μl培养液，下层加入700μl培养液，置于37℃细胞培养箱孵育2h，细胞消化、计数， 用无血清DMEM重悬稀释到1×10⁵/mL，去除小室的DMEM培养液，在小室下层加入700μl 10%FBS的DMEM培养液，上层加入500μl细胞悬液，培养箱孵育48h，去除培养液，用棉 签擦去上室的细胞，甲醇固定20min，PBS洗2遍，结晶紫染液染色30min，PBS洗3遍， 显微镜下拍照，取直径上8个视野计数。

重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7抑制胆管癌细胞株迁移的能力，结果见图2，可以看出在胆 管癌细胞Sk-chA-1中，转染重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7的细胞迁移能力低于对照组细胞， 差异具有统计学意义，说明重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7可以抑制细胞的迁移。

实施例3

重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7对胆管癌细胞药物敏感度的影响，具体操作步骤如下：

使用重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7作用胆管癌细胞株QBC939后，用化疗药物顺铂半致 死量IC50值得上下两个浓度培养48h，MTT法检测细胞的存活率（步骤参见实施例1），结 果如图3所示，表明重组质粒PcDNA3.1(+)-Fbw7能够增加胆管癌细胞对化疗药物顺铂的敏 感性，协同促进化疗药物抑制胆管癌细胞QBC939的增殖。

实施例4

大量研究表明，Fbw7在肝癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、食 管鳞状细胞癌及肝癌等多种癌症都表达，并且对乳腺癌、子宫癌及前列腺癌的发生发展有着 重要作用。近期的研究揭示FBW7通过NOTCH、C-Myc、NF-κB等多种信号通路来促进细 胞的凋亡，抑制细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL及cFLIPL的表达来降低细胞凋亡。此外， 研究发现FBW7在细胞的活性氧方面也具有重要的调控作用，从而影响着细胞的凋亡，因此 FBW7在调控细胞增殖和凋亡方面有着重要作用。FBW7和底物、抑制剂以及和其他信号通 路的相互关系的研究还有很多的空白，相信随着对FBW7了解的深入，FBW7在正常和癌变 细胞中功能的确立，为FBW7作为药物开发提供了可能性。

重组质粒图谱详细信息以及FBW7的全长序列信息如图4和5所示。

材料与方法

1、材料

1）主要试剂

质粒抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司；胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；限制性内 切酶EcoRⅠ、NotⅠ，T4DNA连接酶均购自大连Takara生物工程公司；转染试剂 Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；药物顺铂购自中国江苏豪森药业股份有限公司； 小牛血清、培养基购自美国Hyclone公司；细胞培养板购自美国Corning公司；引物合成、 测序分析由美国Invitrogen公司完成。

2）载体、菌株、细胞株

表达载体PcDNA3.1(+)、PSG5-Myc-Fbw7质粒、大肠杆菌DH5α、人胆管癌细胞QBC939 均为本实验室所保存。

3）主要仪器

TE2000荧光倒置显微镜（Nikon），1284 生物安全柜（Thermo），3110 CO2培养箱 （Thermo），Multiskan Mk3酶标仪（Thermo），水平凝胶电泳仪（北京六一），Tannon-2500R 凝胶成像系统（Tannon）。

2、实验方法

1）引物设计

使用生物软件Primer5，遵循引物设计的基本原则设计两对目的基因引物，所用引物如表 1所示。

表1

使用Takara公司的SYBR Ex Taq试剂盒来检测基因的表达含量，具体实验步骤如下：

反应条件为95℃预变性20s；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共循 环45次，在退火阶段检测荧光；融解曲线条件为50℃15s，51℃升温至99℃，每升高一 度停留5s；数据分析通过相对定量－ΔΔCt法进行。

2）质粒的提取

从平板上挑取单菌落于100mL含抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，将过夜 培养物以3,500rpm离心10min，弃上清，随后加入5ml P1，涡旋震荡悬浮细菌，确保细菌 全部悬起，室温放置2～3min后加入5ml P2，迅速来回轻柔颠倒混匀，室温放置3～5min 后加入5ml P3，迅速颠倒混匀，置于冰上5min，然后以12,000rpm的速度离心5min，收集 上清后再次离心10min以保证沉淀全部去除，然后将上清液吸至tip-100柱子（用4ml QBT  buffer对柱子进行平衡）中，待液体流尽后加入10ml QC buffer洗涤，流尽后再用10ml QC  buffer洗涤一次，随后加入5ml QF buffer洗脱DNA并收集洗脱液，洗脱液加入3.5ml异丙 醇沉淀DNA质粒，以13,000rpm的速度4℃离心30min，弃去上清，沉淀用1ml70%乙醇 洗涤，置于超净工作台内晾干，然后加入200μl Tris-HCl（pH8.0）溶解沉淀，所得DNA质 粒可用于细胞转染实验。

3）目的片段的获得

用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ同时酶切包含目的片段全长片段的载体质粒，酶切反应 体系和参数如下：

各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

4）产物的纯化

产物的纯化按公司胶回收试剂盒说明书操作，具体操作如下：

A、DNA片段用2%琼脂糖凝胶电泳分离；

B、对应分子量Marker，将预回收片段的凝胶条切下，放入离心管中，加入三倍体积的 PN，水浴放置，直至胶块完全溶解；

C、将上一步所得溶液加入吸附柱CA1中，13，000rpm离心30sed，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放入收集管中；

D、向吸附柱中加入700uL漂洗液PW，13，000rpm离心30sed，倒掉废液，将吸附柱 重新放入收集管中；

E、向吸附柱中加入500uL漂洗液PW，13，000rpm离心30sed，倒掉废液，将吸附柱 CA1重新放入收集管中，离心尽量出去漂洗液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干；

F、将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加适量65～70℃水浴 预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，13,000rpm离心1min收集DNA溶液；

G、为了提高DNA回收量，将离心所得的溶液重新加回离心管吸附柱中，重复步骤F。

5）酶切、连接目的片段和载体质粒

用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ同时酶切各个目的片段产物和载体，酶切反应体系和参 数如下：

各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

37℃作用2h，琼脂糖电泳鉴定酶切效率后，切胶回收酶切后的质粒和目的片段，定量。 酶切后的目的片段和线性PcDNA3.1(+)具有相同的粘末端，经T4DNA连接酶连接。连接反 应体系：

各组份混匀后，16℃金属浴中连接过夜；

6）感受态细菌的制备和转化

挑取大肠杆菌DH5α保存菌株，在不含抗生素的LB平板上划线接种，37℃培养过夜， 随后挑取单菌落于5ml LB培养基中，在摇床上过夜培养（37℃、200rpm），取0.5ml过夜 培养物接到50ml LB培养基中，37℃摇床培养至菌液OD600为0.2～0.4时将菌液转移到50 ml离心管中，置于冰上冰浴20min，然后以3,000rpm速度于4℃离心10min收集细菌， 菌体沉淀用10ml预冷的MgSO4（0.1M）轻柔重悬浮，置于冰上10min，再次以3,000rpm 速度于4℃离心10min，弃上清，加入8ml预冷的CaCl2（0.1M）重悬，置于4℃冰箱过 夜，加入2ml50％灭菌甘油，分装成50ul/管于-80℃保存待用。

从-80℃中取出感受态细胞，置于冰上待菌液溶化，于超净工作台中加入DNA，手指弹 动混匀，冰上放置30min后42℃水浴热激90s，热激后快速置于冰上1～2min，然后加入 200μL LB培养基在37℃摇床上复苏45min，最后将转化液涂布与含抗生素的LB平板上， 于37℃培养过夜，挑单菌落于含抗生素的LB培养基中培养并提质粒。

7）细胞的培养及传代

细胞培养在DMEM+10%FBS或RPMI1640+10%FBS培养基中，置于37℃、5％CO2＋ 95％空气的饱和湿度环境的培养箱中培养。

传代时先吸去贴壁细胞的培养液，PBS缓冲液漂洗一次，加入适量胰酶消化液进行消化， 随后加入少量培养液终止胰酶作用，移液管吹打数次形成单个细胞悬液，然后通过血球计数 板对细胞进行计数，根据实验需要接种不同浓度的细胞，或将悬液接种至其他预装有新鲜培 养基的细胞培养皿内继续培养。

8）细胞转染

使用Lipofectamine2000转染人胆管癌QBC939细胞，具体步骤为：转染前24h将细胞接入 24孔板或35mm的培养皿中，保持细胞密度约为60～70％，然后转染前1h将细胞换为无双抗 培养液，吸去旧培养液，小心加入37℃预热的培养液；然后制备转染液，以35mm的培养皿 为例，一支1.5ml的离心管中加入250μl的opti-MEM，然后加入4μg质粒混匀，另一支1.5ml 的离心管中加入250μl的opti-MEM，随后将10μl Lipofectamine2000转染试剂加入，混匀后室 温放置5min，然后将稀释后的转染试剂和质粒混匀，室温放置20min后将制备好的转染液逐 滴加入细胞中。不同规格培养皿配制方法如表2所示。

表2

9）细胞毒性实验

将细胞接种于96孔板中，每孔100μl，并设2孔无细胞仅有100μl培养液作为空白对照 孔，培养不同时间后每孔加入10μl浓度为5mg/ml MTT溶液，37℃反应4h后每孔加100μl 10％SDS-0.01M HCl溶解过夜，酶标仪测定OD₅₆₀，通过比较OD₅₆₀值判断细胞增殖或存活 情况。

10）细胞迁移实验

细胞血清饥饿处理24h；实验前小室上层加入500μl无血清培养液，下层加入700μl无 血清培养液，置于37℃细胞培养箱孵育2h对Migration/Invasion小室进行水化；饥饿处理 后的细胞消化、计数，用无血清培养液重悬稀释到1×105/ml；去除小室的水化培养液，在小 室下层加入700μl10%FBS的含10%FBS培养液，上层加入500μl细胞悬液，培养箱孵育48 h；去除培养液，用棉签擦去上室的细胞；甲醇固定20min，PBS洗2遍，结晶紫染液染色 30min，PBS洗3遍，显微镜下拍照，取直径上8个视野计数。

11）数据处理

实验结果中数据均为多次实验的平均值，并用平均值+标准差表示；用SPSS11.0对数据 进行显著差异性分析，以P<0.05为显著性差异。