四环素适配体与检测四环素的适配体电化学生物传感器

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种四环素适配体以及检测四环素的适配体 电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。

背景技术

四环素（tetracyclines，TCs）是由放线菌产生的一类含有骈四苯结构的广谱 抗菌药物，对革兰阳性菌、革兰阴性菌及螺旋体、立克次体、衣原体、支原体及 原虫等均有抑制作用，其抗菌机制主要为抑制菌体蛋白质合成。目前四环素类抗 生素已经成为我国畜禽饲养业中生产量和临床使用量最大的抗生素。四环素可直 接作为一种饲料添加剂投放到饲料中，也可用作生长促进剂投喂给动物，在药品 市场中占有重要地位。但由于四环素的滥用给人和动物的健康带来极大的危害同 时对动物性食品的食用安全带来不稳定因素，影响养殖业的健康发展和走向国际 市场。四环素的危害集中体现在：急性中毒，过敏反应和变态反应，三致作用： 致癌、致畸、致突变，影响胃肠道菌群，细菌耐药性增加。

目前关于四环素类抗生素的检测方法有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、 毛细管电泳法、电化学法、质谱连用法和高效液相色谱法等，其中微生物法操作 简单、费用低，但特异性差，灵敏度低，耗时长；酶联免疫法虽特异性较高，但 存在高背景吸收、操作繁琐（需大量的孵育及洗涤步骤）以及酶易受样品影响等 缺点，薄层色谱法的测量灵敏度难以达到要求，毛细血管法分析速度快、分离效 率高、运行成本低，但技术不是很成熟，且不适用于小分子的检测，质谱连用法 和高效液相色谱法需要大型的仪器，价格昂贵。而电化学方法具有操作简单、特 异性好、灵敏度高、可在线和易于微型化等优点，目前已引起了人们的广泛关注。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于样品中四环素含 量快速检测的生物传感器。该生物传感器灵敏度更高，稳定性和重现性更好，响 应时间更快，并且可快速用于样品中四环素检测的生物传感器及其组装方法。

为了解决现有四环素检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点， 本发明的第一个目的是提供一种四环素适配体。

本发明所述的四环素适配体为含有TTGAGCCCT序列、长度为13-20bp的 单链DNA探针，且5’端修饰了氨基即5’-NH₂-(CH₂)₆-。

本发明的第二个目的是提供一种检测四环素的适配体电化学生物传感器。

本发明所述的检测四环素的适配体电化学生物传感器，含有本发明所述的 四环素适配体。

本发明的第三个目的是提供一种适配体电化学生物传感器的制备方法。

本发明所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用 超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的 Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极；

（2）活化电极的适配体修饰：合成如本发明所述的适配体，配制100μmol/L 的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤（1） 所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，密封4℃下组装24小时，得到所 述的适配体电化学生物传感器。

根据本发明所述的适配体电化学生物传感器的制备方法的进一步特征，所述 步骤（1）中采用的Piranha溶液中，浓硫酸与30%H₂O₂的体积比是7:3。

本发明的第四个目的是提供一种本发明所述的适配体电化学生物传感器的 用途，即将本发明所述的适配体电化学生物传感器用于检测四环素的用途。

本发明的第五个目的是提供一种检测四环素的方法，该方法是基于本发明所 述的适配体电化学生物传感器的检测方法。

本发明所述的基于如权利要求2所述的适配体电化学生物传感器的检测四 环素的方法，包括以下步骤：

（1）对四环素标准溶液进行检测，建立标准曲线：

将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl（饱和KCl）电 极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；

将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然 后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的含0.1mol/L KCl的 电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到 适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0；

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度 1.0ng/mL的四环素水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特 异性吸附的四环素，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1： 1的含0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率 为0.1-1.0×10⁵Hz，得到浓度为1.0ng/mL的四环素标准液的交流阻抗图谱及其阻 抗值Ret1；

同理，将上述修饰电极依次放入浓度5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、 1.0×10²ng/mL、5.0×10²ng/mL、1.0×10³ng/mL、5.0×10³ng/mL的四环素标准液 中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交 流阻抗图谱及阻抗值Retn（n=2,3…8），并计算各标准液相对初始的适配体电化 学生物传感器的阻抗变化值ΔRet即各标准液对应的阻抗值Retn（n=1,2,3…8）减 去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0；

以浓度为1.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×10²ng/mL、1.0×10³ng/mL、5.0×10³ng/mL的四环素标准液浓度的对数为横坐标，以这8种标准液对 应的阻抗变化值ΔRet为纵坐标作图，建立标准曲线；

（2）对含四环素的样品溶液进行定量检测：

根据GB/T21317-2007所述方法对样品中的四环素进行提取纯化；将得到的 四环素干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测；

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从样品 溶液中提取纯化得到的四环素水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲 洗，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的，含浓度 0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为 0.1-1.0×10⁵Hz，得到样品中四环素溶液检测的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets；

通过步骤（1）建立的标准曲线，计算出Rets-Ret0对应的四环素浓度，即 为样品中四环素的浓度。

本发明所述的检测方法的原理是：在有四环素存在的情况下，本发明中所 述适配体与四环素特异性结合，引起所述适配体的空间构象及其在金电极表面取 向的变化，进一步影响电解液中电化学活性指示剂铁氰化钾与电极界面的电子转 移速率，即表现为电子转移阻抗变化，通过电化学活性指示剂铁氰化钾显示的阻 抗值与四环素浓度的对数之间的线性关系，建立四环素的快速电化学传感器检测 技术。

本发明的有益效果在于：

（1）提供了一种对目标四环素非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗 体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、 修饰方便快速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好 等优点。

（2）基于本发明所述的适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器， 可以将样品中四环素目标物的存在转变为电信号进行快速检测。它将电化学方法 的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费 用低、易于微型化、可再生，不受样品中脂血、溶血情况干扰。

（3）本发明解决了现有四环素检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长 的缺点。本发明采用可特异性识别四环素的核酸适配体应用于电化学传感器，大 大提高了检测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性，是一种 检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。

附图说明

图1为四环素适配体修饰电极在不同浓度四环素标准溶液中检测的交流阻 抗图谱。

图2为四环素适配体修饰电极在不同浓度四环素标准溶液中检测的信号变 化趋势图。

图3为四环素标准品溶液检测得到的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步地描述。

实施例一：适配体电化学生物传感器的构建

（1）裸金电极表面的抛光及活化处理

将裸金电极用0.3μm的氧化铝粉末打磨10分钟，再用0.05μm的氧化铝粉 末打磨20分钟，然后用超纯水超声清洗2次，每次5分钟，彻底去除非特异性 吸附在裸金电极表面的氧化铝粉末。将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的 Piranha溶液（浓硫酸:30%H₂O₂=7:3，V:V）于室温下活化10分钟，得到活化的 裸金电极。然后分别用超纯水和无水乙醇超声清洗2次，每次5分钟。

（2）适配体电化学传感器的修饰

取2μL浓度100μmol/L的四环素适配体溶液加入到98μL浓度1mol/L的NaCl 溶液中，配制成2μmol/L适配体组装液，转入50mL离心管中；将步骤（1）抛 光活化处理后的裸金电极放入50mL离心管并浸入适配体组装液中，密封后，4℃ 下组装24小时，即得到四环素核酸适配体修饰的电极。

四环素核酸适配体序列从5’端到3’端的核酸序列如：AGTTGAGCCCTACGC （SEQ ID NO.1），5’端修饰了氨基即5’-NH₂-(CH₂)₆-。

浓度100μmol/L的四环素适配体溶液是5’端修饰了氨基即5’-NH₂-(CH₂)₆- 的DNA适配体探针溶液。

实施例二：四环素适配体电化学生物传感器对四环素标准溶液的电化学响应

（1）将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器作为工作电极， Ag/AgCl（饱和KCl）电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极。将实施例一制 作的电化学核酸适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体， 然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](1：1)电解液中，电解液 含浓度0.1mol/L的KCl，交流阻抗分析，初始电位0.22V，频率：0.1-1.0×10⁵Hz， 得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0。

（2）将步骤（1）所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度 1.0ng/mL的四环素水溶液中，室温孵育反应15分钟，反应后用超纯水冲洗去除 非特异性吸附的四环素，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] (1：1)，含浓度0.1mol/L KCl的电解液中。交流阻抗分析，初始电位0.22V，频 率：0.1-1.0×105Hz，得到浓度1.0ng/mL的四环素标准液的交流阻抗图谱及其阻 抗值Ret1。

（3）同理，将步骤（2）所述的适配体电极依次放入浓度5.0ng/mL、10.0 ng/mL、50.0ng/mL、1.0×10²ng/mL、5.0×10²ng/mL、1.0×10³ng/mL、5.0×10³ng/mL的四环素标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗 分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn（n=2,3…8）。

（4）计算步骤（2）与步骤（3）中各标准液相对步骤（1）中适配体电化学 生物传感器的阻抗变化值△Ret即各标准液对应的阻抗值Retn（n=1,2,3…8）减 去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0。以浓度为1.0ng/mL、10.0ng/mL、 50.0ng/mL、1.0×10²ng/mL、1.0×10³ng/mL、5.0×10³ng/mL的四环素标准液 浓度的对数为横坐标，以这8种标准液对应的阻抗变化值△Ret为纵坐标作图， 建立标准曲线。如图1和图2所示，随着四环素浓度的增加，响应信号Ret呈现 出先增后降的趋势。在5.0ng/mL-5.0×10³ng/mL浓度范围内，阻抗随四环素浓度 增加而降低，△Ret与四环素浓度的对数呈现很好的线性关系(R²=0.9879)，线 性方程为△Ret(Ω)=-3.2×10²lgC(ng/mL)+6.7×10²（图3），检测限为1.0ng/mL。

实施例三：适配体电化学生物传感器的稳定性和重现性

电极检测信号来源于适配体对四环素的识别作用，四环素与适配体的结合引 起信号的变化，组装在裸金上的适配体数量直接决定适配体电化学生物传感器的 检测灵敏性。为了能直观的反映电极组装的效果，同时又能反映适配体电化学生 物传感器的制作重现性，设定一个评价标准---组装率Q。

规定组装率Q为：$Q=\frac{\mathrm{Ip}\left(\mathrm{Au}\right)-\mathrm{Ip}\left(\mathrm{AP}\right)}{\mathrm{Ip}\left(\mathrm{Au}\right)}$

Ip(Au):裸金电极进行DPV扫描的峰电流值；

Ip(Ap):适配体电化学生物传感器进行DPV扫描的峰电流值；

用组装率Q的相对标准偏差值（Relative Standard Deviation，RSD）进行电 极制作重现性评价。组装4批电极共10根，平均组装率为82.4%，组装率Q的 RSD为4.6%，说明该适配体电化学生物传感器具有良好的制作重现性。

将实施例一制作的适配体电化学生物传感器存储在8mM pH5.0磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液（含50mM NaCl）上方，于4℃存储15天后检测，其信号较初始 AP修饰电极信号仅变化8.5%，说明该适配体电化学生物传感器具有较好的存储 稳定性。

实施例四：对牛奶进行测定及回收率实验：

牛奶样品的处理：取5.00g牛奶样品，加入不同浓度的四环素，根据GB/T 21317-2007所述方法对牛奶中的四环素进行提取纯化。将得到的四环素干粉用超 纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测。

将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除 未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](1：1)电 解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，交流阻抗分析，初始电位0.22V，频率： 0.1-1.0×10⁵Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0。

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从牛奶 中提取纯化得到的四环素水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗， 然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](1：1)，含浓度0.1mol/L KCl的电解液中。交流阻抗分析，初始电位0.22V，频率：0.1-1.0×10⁵Hz，得到 实际样品中四环素溶液检测的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets。通过实施例二建立 的标准曲线，计算出Rets-Ret0对应的四环素浓度即为实际样品中四环素的浓度。 测试结果如表一所示。所测得样品的相对标准偏差在3.4%～5.8%之间，加标回 收率在92.1%～95.3%之间，平均回收率为94.0%。

表一：牛奶中四环素含量的测定结果

实施例五：基于不同的适配体构建的电化学生物传感器

在上述实施例一至四中，通过实验验证了基于序列为SEQ ID NO.1的四环 素核酸适配体构建的电化学生物传感器在检测四环素样品的效果。

进一步的实验表明，在SEQ ID NO.1即AG TTGAGCCCT ACGC中，核心 序列是TTGAGCCCT，而其他碱基可以任意搭配，只要符合长度为13-20bp的要 求。表2是实验中设计的一系列适配体及其实验结果：

表2：四环素适配体

注：上述SEQ ID NO.2至14是专门设计的极端序列，在序列TTGAGCCCT的 两端加上连续的A或G或C或T碱基，通过实验表明这些序列的检测灵敏度与 随机设计的SEQ ID NO.1的相当，证明以序列TTGAGCCCT是关键序列，可以 其他碱基可以任意搭配为四环素适配体，序列长度符合13-20bp即可。