疫苗施用方法、新猫杯状病毒、及抗猫细小病毒和猫疱疹病毒的动物免疫方法

本申请是申请日为2006年7月17日、申请号为200680035988.9 的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及提供新的向各种动物施用各种疫苗的方式。本发明公 开几种分离的猫杯状病毒(feline caliciviruses，FCV)。还公开将 FCV疫苗呈递给猫的新方法。本发明还涉及编码猫杯状病毒的核酸克 隆。涉及FCV衣壳蛋白、活的或死的疫苗、包含衣壳蛋白的亚单位疫 苗、核酸疫苗、和包含编码分离的猫杯状病毒的衣壳蛋白的核酸的重 组病毒载体疫苗。本发明也涉及鉴定可在疫苗组合物的制备中及在诊 断感染猫杯状病毒的猫的试验中使用的猫杯状病毒的方法。本发明也 提供将新的和老的FCV疫苗施用给猫的新方式。

背景技术

杯状病毒据报道是猫的一种重要的致病因素。可以观察到多种症 状，例如发烧、鼻炎、打喷嚏、轻微的结膜炎、眼屎、在外鼻孔、口 腔粘膜中或在舌上出现疱囊、肺炎、气管支气管炎、腹泻、肌肉疼痛、 离子通道闸门僵直(stiff gate)以及感觉过敏。机会细菌感染常常伴 随FCV感染，这使得治疗和痊愈变得复杂化。严重的FCV感染可以导 致死亡，尤其是在幼猫中。应当注意，这些征候，尽管据报道在天然 情况下是常见的，但是在实验性感染中并不总是显著的。似乎不同的 猫杯状病毒(FCV)野外毒株在其致病潜力上是不同的，或者与其它病 因的共同感染将影响疾病症状。

抗猫杯状病毒疫苗已经存在有二十年以上。尽管存在大量的FCV 血清型，但是发现某些毒株，例如F9，可以诱导针对广谱FCV毒株的 抗体。见，J.L.Bittle和W.J.Rubic，Am.J.Vet.Res.37：275-78 (1976)。因此，最早的抗猫杯状病毒疫苗使用的是FCV-F9毒株的修饰 的或减毒的形式。见J.L.Bittle和W.J.Rubic的美国专利号 3,937,812，在此将其完整地并入作为参考。

尽管来自FCV-F9的疫苗和其它商业可获得的疫苗可以提供对抗 许多野外分离株的保护作用，但是事实上这些疫苗并不能阻止所有毒 株的感染。而且，由于FCV一直在不断进化，基于FCV-F9的疫苗防卫 越来越少的野外分离株(Lauritzen等，1997，Vet Microbiology，56： 55-63)。此外，兽医从业者也对基于单种血清型的疫苗的效力表现出 担心。实际上，野外研究提示，来源于FCV-F9毒株的疫苗对许多猫杯 状病毒株不能提供充分的免疫力。见例如，N.C.Pederson等，Feline  Pract.13(1)：26-35(1983)；S.Dawson等，Vet.Rec.132：346-50 (1993)。从业者也对在某些情况下可能在原本健康的动物中引起疾病 的修饰活病毒的施用产生了担心。研究者已经报道，因疏忽将皮下施 用的FCV疫苗通过口服途径给药导致了急性疾病。见R.C.Povey， Feline Pract.7(5)：12-16(1977)。因此，对于单独地或者与其它 疫苗组合可以在接种猫后提供期望保护作用的疫苗，一直存在研发兴 趣。我们在此描述几种从猫上分离的分离株，并提供一种在免疫的猫 中实现广泛保护作用的手段。

资料公开

美国专利文献

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5266313  1993年11月Esposito等，5338683  1994年8 月Paoletti等

5494807  1996年2月Paoletti等，5559041  1996年9 月Kang等

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5585100  1996年12月Mond等，5589384  1996年12 月Liscombe

5589466  1996年12月Felgner，5620845  1997年4月Gould 等

5656448  1997年8月Kang等，5693761  1997年12月Queen 等

5693762  1997年12月Queen等，5695928  1997年12 月Stewart等

5703055  1997年12月Felgner，5716784  1998年2 月DiCesare

5716822  1998年2月Wardley，5718901  1998年2月Wardley

5725863  1998年3月Daniels等，5728587  1998年3月Kang 等

5800821  1998年9月Acheson等，59773221999年11 月Marks等

6010703  2000年1月Maes等，63552462002年3月 Kruger等

6,534,066B1 2003年3月Poulet等

外国专利文献

0484382  1995年3月EP，WO2004/083390

其它出版物

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发明概述

本发明提供新的猫杯状病毒株并涉及几种分离的猫杯状病毒 (FCV)。本发明还公开将疫苗呈递给动物，尤其是，将FCV呈递给猫的 新方法。本发明也涉及编码猫杯状病毒的核酸克隆。涉及FCV衣壳蛋 白、活的或杀死的疫苗、包含衣壳蛋白的亚单位疫苗、核酸疫苗、和 包含编码该分离的猫杯状病毒的衣壳蛋白的核酸的重组病毒载体疫 苗。本发明也涉及鉴定可在疫苗组合物的生产中以及在诊断感染了猫 杯状病毒的猫的试验中使用的猫杯状病毒的方法。本发明也提供将新 的和旧的FCV疫苗施用给猫的新方式。在此还描述使用疫苗治疗和免 疫动物，尤其是猫，以抵抗FPV或猫细小病毒(也称作全白细胞减少症 或FPL)以及另一种疾病，FHV或猫疱疹病毒(也称作猫鼻气管炎病毒) 的方法和材料。以下描述新的疫苗组合，该组合当以本文所述方式呈 递给猫时可以实现FPV和/或FHV疫苗的有效口服/口服以及皮下 (subq)/口服递送。

具体地，本发明公开以下用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗。 FCV-21衣壳蛋白或分离的FCV-21衣壳蛋白，(SEQ ID NO：13)及具有 至少大约91.2％、95％和99％同一性的序列。包含编码FCV-21衣壳蛋 白或分离的FCV-21衣壳蛋白的核酸序列的DNA疫苗，其中所述DNA 包括序列(SEQ ID NO：12)和具有至少大约78.7％或79.2％序列同一 性和允许保护替代的序列。

包含FCV-49衣壳蛋白或分离的FCV-49衣壳蛋白的疫苗，其中所 述衣壳蛋白包含来自FCV-49株的蛋白质序列(SEQ ID NO：15)或具有 至少大约92.7％、95％和99％同一性的序列；其中所述衣壳蛋白以有 效的量提供。包含编码FCV-49衣壳蛋白或分离的FCV-49衣壳蛋白的 核酸序列的DNA疫苗，其中所述DNA包括序列(SEQ ID NO：14)和具有 至少大约78.9％，即79.4％(78.9+0.5)，序列同一性和允许保护替代 的序列。

包含FCV-26391-4衣壳蛋白或分离的FCV-26391-4衣壳蛋白的疫 苗，其中所述衣壳蛋白包含来自FCV-26391-4株的蛋白质序列。包含 FCV-26391-4衣壳蛋白的疫苗，其中所述衣壳蛋白包括蛋白质序列 (SEQ ID NO：17)和具有至少大约91.8％、95％和99％同一性的序列。 包含编码FCV-26391-4衣壳蛋白或分离的FCV-26391-4衣壳蛋白的核 酸序列的DNA疫苗，其中所述DNA包括序列(SEQ ID NO：16)和具有至 少大约78.4％，即78.9％(78.4+0.5)，序列同一性的序列。

疫苗，其中所述多核苷酸选自基本上由SEQ ID NO：12、14和16 组成的组。该疫苗可以是以下单独的或者任何组合的形式：其中该疫 苗含有佐剂，其中该FCV成分是活的，其中该FCV成分是减毒的，其 中该FCV成分是灭活的，其中该疫苗可以包括至少一种选自FCV-F9、 FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280的其它猫杯状病毒株。

用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含有效产生免疫应答 的量的FCV衣壳蛋白核苷酸序列和药学上可接受的载体，其中所述FCV 衣壳蛋白选自与SEQ ID NO：13、15或17有93％或更大同一性的多 肽，其中该FCV分离株不是213-95株，并且其中该核酸序列与异源启 动子序列可操作连接。用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含 选自基本上由SEQ ID NO：12、14和16组成的组的FCV衣壳蛋白的核 苷酸序列。疫苗，其中所述核苷酸序列为以下任一种形式：质粒、重 组病毒载体或任何其它核苷酸载体。

疫苗，其中重组病毒载体选自猫疱疹病毒、浣熊痘病毒、金丝雀 痘病毒、腺病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒和痘苗病毒。

本发明还描述免疫原性组合物，其包含兽医学上可接受的赋形剂 运载体和分离的FCV株，其中所述FCV株可以与选自本文描述为23、 26、41、44和56的单克隆抗体的单克隆抗体结合。在本发明一些形 式中，该免疫原性组合物包含兽医学上可接受的赋形剂运载体和分离 的FCV株，其中该FCV株选择性地与选自本文描述为23、26、41、44 和56的单克隆抗体的单克隆抗体结合。这些免疫原性组合物包括其中 所述FCV株是灭活的、其中所述FCV株是疫苗、以及其中该组合物包 含佐剂的那些组合物。

本文描述的疫苗可以包括至少一种选自猫疱疹病毒、猫白血病病 毒、猫免疫缺陷病毒、鹦鹉热衣原体(Chlamydia pssittaci)和猫细小 病毒、狂犬病毒和支气管败血性鲍特菌(Bordetella bronchiseptica) 的其它猫病原体。该疫苗也可以另外地包含佐剂或者与佐剂一起施用。

发明详述

本发明提供可以显著地降低与猫杯状病毒(FCV)相关的死亡率以 及增加FCV疫苗的安全谱的免疫接种方案。此外，本发明的免疫接种 方案诱导比现有FCV-F9疫苗方案更宽的血清交叉中和谱，由此应提供 更好的跨不同猫杯状病毒株的免疫力。

本发明一方面提供使用疫苗免疫动物，尤其是猫，以抵抗猫杯状 病毒的方法。本文还描述了另外两种猫疾病，FPV和FHV，的新疗法。 所述方法包括将治疗有效量的第一疫苗、第二疫苗施用给猫，并且任 选地还可以在如上的120天内或者更经常的是在大约1年后作为每年 一次的加强剂给予第三疫苗施用。第一疫苗通过胃肠外途径(例如，皮 下、肌内等)施用。第二疫苗通过口服或口鼻途径在第一疫苗施用后大 约N天施用，而第三疫苗通过胃肠外途径、口服、或口鼻途径在第一 或第二疫苗施用后大约M天施用。在此，N和M独立地是3至120(包 括3和120在内)的整数。也优选N为大约3周以及大约2-4周。此外， 在本发明一方面中，某些所述疫苗可以以两个口服剂量的形式施用而 无需第一次胃肠外施用。也建议使用每年一次的加强剂。

序列表简述

定义和缩写

“大约”，当与可测量的数值变量联用时，指所给出的该变量的 值以及该变量的位于该给出值的实验误差范围内(例如，对于平均值 而言在95％置信区间内)的所有值或者位于该给出值的百分之十范 围内的所有值，以范围大的为准，但是“大约”与周为单位的时间间 隔联用时除外，在此“大约3周”为17至25天，而大约2至4周为 10至40天。

“自动免疫”包括用本发明疫苗接种猫而诱导的抗猫病毒的体液 免疫和/或细胞介导的免疫。

“抗体”指因针对特定抗原的免疫应答而导致的、能够与该特定 抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是血清蛋白质，由具有“恒 定区”和“可变区”的“轻链”和“重链”多肽链组成，并基于恒定 区的组成而分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。对给定抗原具 有“特异性”的抗体意味着该抗体的可变区能够专一地识别和结合特 定抗原——例如，尽管在衣壳蛋白和其它多肽之间存在局部的序列同 一性、同源性或相似性，该抗体仍能够通过可测量的结合亲和力差异 而将特定衣壳蛋白与其它已知蛋白区分开。特异性抗体也可以与其它 蛋白质(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A或 ELISA技术中的其它抗体)通过和抗体可变区外的序列，尤其是，该分 子恒定区中的序列的相互作用而发生相互作用。确定抗体的结合特异 性的筛选试验是熟知的。对于此类试验的全面讨论，见Harlow等(编)， Antibodies：A Laboratory Manual，第6章(1988)。如果抗体对FCV 衣壳蛋白具有特异性，该抗体也可能识别和结合FCV衣壳蛋白的片段。 抗体可以使用本领域已知的方法制备。

“抗原”或“免疫原”指含有一个或多个表位(线性的、构象的或 两者)的分子，在该分子接触个体后将诱导特异于该抗原的免疫应答。 表位是抗原中可以与T细胞受体或特异性抗体结合的特定位置，典型 地包含大约3个氨基酸残基至大约20个氨基酸残基。术语“抗原”指 亚单位抗原——来自与抗原天然联系的整个生物体的分离和离散的抗 原——以及死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它 微生物。术语抗原也指抗体，例如抗独特型抗体或其片段，以及能够 模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟表位(mimotope)。术语抗 原也指在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在 DNA免疫应用中。

“赋形剂”指疫苗中非抗原的任何成分。

FELOCELL 3是无鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)的FELOCELL 4。

FELOCELL 4含有修饰的活猫鼻气管炎(rhiotracheitis)病毒 [FHV]、杯状病毒[FCV-F9]、全白细胞减少症病毒[FPV]和鹦鹉热衣原 体[FCp]。FELOCELL 4A含有修饰的活猫鼻气管炎病毒[FHV]、杯状病 毒[FCV-21]、全白细胞减少症病毒[FPV]和鹦鹉热衣原体[FCp]。 FELOCELL 4A是无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 4。FELOCELL 3A 是无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 3。4、Felocell 4 或FELOCELL 4或后面有数字“3”或“4”的这些词是Fe1ocell的变 体疫苗，Pfizer拥有名称Felocell的任何变体疫苗。

“第一疫苗”、“第二疫苗”、“第三疫苗”等指可分开施用的 疫苗，它们可以相同或不同，并且一般可以以任何顺序施用。因此， 第三疫苗可以在第二疫苗之前或之后施用给个体。

与多肽有关的氨基酸序列“同一性”百分数中，“同一性”在本 文中定义为：为达到最大序列同一性百分数而将候选序列与靶序列比 对并在必要时引入缺口之后，在候选序列中与靶标序列中的残基相同 的氨基酸残基的百分数。序列同一性百分数通过常规方法确定。简而 言之，两个氨基酸序列使用ClustalW算法(Thompson等，Nuc.Ac.Res. 22：4673-4680，1994)和PAM250权重矩阵(Dayhoff等，“Atlas of  Protein Sequence and Structure.”National Biomedical Research  Foundation.Washington，DC 5：345—358(1978)和程序MegAlign提 供的默认参数(DNASTAR，Inc.；Madison，WI)进行比对以优化比对分 数。表1-1给出该PAM250权重矩阵表(氨基酸以标准单字母代码表示)。

表1-1

然后按如下计算同一性百分数：

相同匹配的总数/[较长序列的长度+为比对两个序列而引入该较 长序列中的缺口数目]×100

个体中的“免疫应答”指响应于抗原出现的体液免疫应答、细胞 免疫应答、或体液及细胞免疫应答。“体液免疫应答”指由抗体介导 的免疫应答。“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞或其它白细胞或这两 者所介导的免疫应答，包括细胞因子、趋化因子及由活化的T细胞、 白细胞或这两者产生的类似分子的生成。免疫应答可以使用本领域已 知的标准免疫试验和中和试验确定。

抗原的“免疫学保护量”或“有效产生免疫应答的量”是可以有 效地在受体中诱导足以预防或改善因病因(尤其是猫杯状病毒)感染 所致的疾病的征候或症状(包括不良健康影响或其并发症)的免疫原性 应答的量。可以诱导体液免疫或细胞介导的免疫或两者。动物对疫苗 组合物的免疫原性应答可以例如间接地通过测量抗体滴度、淋巴细胞 增殖试验，或者直接地通过监测野生型毒株攻击后的征候和症状来评 价。疫苗所赋予的保护性免疫可以通过测量，例如临床征候例如，死 亡率、发病率、个体的温度数值以及整体身体情况及整体健康和表现 的减少而评价。该免疫应答可以包含，但不限于，细胞和/或体液免疫 的诱导。治疗有效的疫苗量可以随着所用的具体病毒或者猫的情况而 改变，并且可以由兽医从业者确定。

“鼻内”施用指通过或者经由鼻将物质例如疫苗引入个体体内， 并涉及物质主要通过鼻粘膜的运输。

“分离的”，当用于描述任何具体限定的物质，例如，多核苷酸 或多肽时，指所述物质与正常发现该物质例如多肽或核酸所在的最初 细胞环境相分离。因此正如本文中所用，仅仅作为例子，使用本发明 多核苷酸构建的重组细胞系利用了该“分离的”核酸。备选地，FCV 衣壳蛋白或特异的免疫原性片段可以用作疫苗，因此其将被认为是分 离的，因为其已经得以鉴定、分离并且相对于其天然可能存在的状况 在一定程度上是纯化的。如果该衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段在 可以产生该抗原的重组细菌或真核表达载体中产生，则其被认为以分 离的蛋白质或核酸形式存在。例如，用多核苷酸构建的重组细胞系利 用了“分离的”核酸。

“单克隆抗体”指由单个杂交瘤细胞系产生的抗体，这些抗体均 指向特定抗原上的一个表位。用于制备单克隆抗体的抗原可以以分离 的病原体蛋白质的形式或者以整个病原体的形式提供。杂交瘤是由杂 种细胞组成的克隆细胞系，该杂种细胞通过骨髓瘤细胞和特定的抗体 生产细胞融合而形成。一般地，单克隆抗体是小鼠来源的；然而，单 克隆抗体也指通过噬菌体展示技术或者等同于噬菌体展示技术的方法 产生的或者由非小鼠来源的杂种细胞产生的、抗抗原的特定表位而形 成的克隆抗体群。

“N天”，“N”时间间隔或时间段或“M天”位于一个事件之后 分别指该事件之后第N天或第M天上的任何时间。例如，在第一疫苗 施用后3天用第二疫苗接种个体意味着第二疫苗在第一疫苗施用之后 第3天的任何时间施用。该描述常常应用于第一和第二免疫接种之间 的时间间隔。典型地，优选的N时间间隔是大约3周，或者17-25天， 但大约2-4周或10-40天也是常见的，并且本发明采用3至120天的 “N”时间段是有效的。

“口服”或“经口”施用指通过或经由口将物质例如疫苗引入个 体体内，涉及吞咽或通过口腔粘膜的运输(例如，舌下或口颊吸收)或 这两者。

“口鼻”施用指通过或经由鼻和口将物质例如疫苗引入个体体内， 例如将一滴或多滴滴剂置于鼻内时所发生的。口鼻施用涉及与口服和 鼻内施用相关的运输过程。

“胃肠外施用”指通过或经由不包括消化道的途径将物质例如疫 苗引入个体体内。胃肠外施用包括皮下施用、肌内施用、经皮施用、 皮内施用、腹膜内施用、眼内施用和静脉内施用。为了本公开的目的， 胃肠外施用不包括主要涉及通过口、鼻、气管和肺中的粘膜组织运输 物质的施用途径。

“被动免疫”指通过使用包含抗FCV株或其免疫原性成分或成分 的片段的抗体的疫苗免疫接种猫而向猫提供的抗猫杯状病毒保护作 用。

“药学上可接受的”指属于合理的医学判断范围内的物质，该物 质适于与个体组织接触而不引起过度毒性、激惹、过敏反应等、与合 理的收益风险比相称、并对于其预期用途而言是有效的。

“多克隆抗体”指针对特定病原体或抗原产生的混合的抗体群。 一般地，该群体含有多组抗体，每一组均针对病原体或抗原的一个特 定表位。为了制备多克隆抗体，可以通过接种或感染将整个病原体或 分离的抗原引入宿主中，诱导宿主产生抗该病原体或抗原的抗体。

“呼吸”施用指通过或经由吸入雾化的(喷雾化的)物质而将物质 例如疫苗引入个体体内。在呼吸施用中，主要的运输机制涉及通过气 管、支气管和肺的粘膜吸收雾化的物质，因此其不同于鼻内或经口施 用。

“单施用剂量”指于同一天或大约同一天施用，即，所有成分在 大约1天内施用。这些成分可以在或者可以不在单一一个容器中。

“特异于”，当用于描述本发明抗体时，指本发明抗体的可变区 专一地识别和结合特定的病毒株(即，能够借助于可测量的结合亲和力 差异而区分特定的FCV衣壳蛋白和其它已知的蛋白质，即使FCV衣壳 蛋白和这些多肽之间存在局部的序列同一性、同源性或相似性)。可以 理解，特异性抗体也可以与其它蛋白质(例如，金黄色葡萄球菌蛋白A 或ELISA技术中的其它抗体)通过和抗体可变区外的序列，尤其是该分 子恒定区中的序列相互作用而发生相互作用。确定本发明抗体的结合 特异性的筛选试验是本领域熟知和常规实践的。对于此类试验的全面 讨论，见Harlow等(编)Antibodies：A Laboratory Manual；Cold  Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，第6 章。也可以考虑识别和结合本发明FCV衣壳蛋白片段的抗体，条件是 这些抗体对FCV衣壳蛋白具有特异性。本发明抗体可以使用本领域熟 知和常规实践的任何方法制备。

“特异的免疫原性片段”指可以由特异于该序列的抗体识别的序 列的部分，见下面的详细定义。

“个体”指具有免疫系统的任何动物，包括哺乳动物例如猫。

“亚单位疫苗”指包括一个或多个抗原但不是所有抗原的一类疫 苗，其中所述的抗原来源于目的病原体(例如，病毒、细菌、寄生虫 或真菌)的抗原或者与目的病原体的抗原同源。此类组合物基本上无 完整的病原体细胞或者致病颗粒或者该细胞或颗粒的裂解物。因此， 亚单位疫苗可以从自病原体至少部分纯化的、或者基本上纯化的免疫 原性多肽或者其类似物制备。获得亚单位疫苗中的抗原(一种或多种) 的方法包括标准纯化技术、重组生产或者化学合成。

“TCID₅₀”指“组织培养物感染剂量”，并定义为感染50％的给 定批次的接种的细胞培养物所需的病毒稀释度。可以使用各种方法计 算TCID₅₀，包括本说明书中使用的Spearman-Karber法。对于 Spearman-Karber法的描述，见B.W.Mahy&H.O.Kangro，Virology  Methods Manual 25-46(1996)。

“治疗有效量”在本公开的上下文中指在接受抗原或疫苗的个体 (例如猫)中诱导足以预防或改善因病原体(例如病毒，如FCV、细菌、 寄生虫或真菌)感染所致的疾病征候或症状(包括不良健康影响)或其 并发症的免疫应答的抗原或疫苗量。可以诱导体液免疫或细胞介导的 免疫或者体液及细胞免疫两者。动物对疫苗的免疫原性应答可以例如 间接地通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖试验，或者直接地通过监测 野生型毒株攻击后的征候和症状而评价。疫苗所赋予的保护性免疫可 以通过测量，例如临床征候(例如死亡率、发病率、个体的温度数值和 整体身体情况及整体健康和表现)的减少来评价。治疗上有效的疫苗量 可以随着所用的具体病毒或者个体的情况而变，并且可以由医师确定。

“治疗”指逆转、减轻、抑制该术语所应用的病症、状况或疾病 的进程，或者预防该病症、状况或疾病、或者预防该病症、状况或疾 病的一个或多个症状。

“疗法”指紧上面定义的“治疗”的行为。

“疫苗”指包含抗原的组合物，并且包括以下定义的所谓“亚单 位疫苗”。将疫苗施用给个体导致免疫应答。疫苗可以直接地通过任 何已知施用途径，包括胃肠外、经口等，引入个体。

第一部分

本发明疫苗、病毒株、衣壳蛋白和抗体

本发明提供基于活的或死的选自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4 的FCV株的疫苗。本发明还提供编码来自本发明FCV株的FCV衣壳蛋 白或其特异的免疫原性片段的核酸疫苗。本发明还提供来源于本发明 FCV株的分离的衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段。

对于FCV株，产生自衣壳蛋白的抗原决定簇可以诱导良好的免疫 应答。在此我们描述和要求保护几种FCV株，包括密切相关的衣壳蛋 白及其变体。具体地，我们描述FCV-21株和蛋白质序列(SEQ ID NO：13) 及具有91.2％、95％和99％或更高同一性的序列；FCV-49株和蛋白质 序列(SEQ ID NO：15)及具有92.7％、95％和99％或更高同一性的序列； FCV-26391-4株和蛋白质序列(SEQ ID NO：17)及具有91.8％、95％和 99％或更高同一性的序列。

本发明疫苗一般旨在是免疫猫以抵抗因猫杯状病毒的毒性株导致 的疾病的预防性疗法。然而，疫苗也旨在用于治疗已经感染了猫杯状 病毒的毒性株的猫。例如，包含通过使用FCV衣壳或其免疫原性成分 免疫异源宿主而产生的抗体的疫苗，可用于治疗被猫杯状病毒感染的 猫。

然而，甚至是提供自动免疫的疫苗，即，包含选自FCV-21、FCV-49 和FCV 26391-4或其突变体的FCV株或者源于本发明FCV株的衣壳蛋 白或其特异的免疫原性片段的疫苗，当作为抵抗各种疾病的治疗性疗 法给予时也预期有效。因此，通过本发明提供的免疫可以是自动免疫 或被动免疫，而疫苗的预期用途可以是预防性的或治疗性的。

对于本发明疫苗的任一种实施方案，施用途径包括，但不限于， 口鼻、肌内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内、和口服 以及经皮、或者通过吸入或者栓剂。优选的施用途径包括口鼻、肌内、 腹膜内、皮内和皮下注射。疫苗可以通过任何手段施用，包括但不限 于注射器、雾化器、喷雾器、无针头注射装置、或微粒轰击基因枪(生 物轰击)。

对于本发明任一实施方案，疫苗根据待使用的施用模式在药学上 可接受的载体中进行配制。本领域技术人员可以容易地配制包含如下 成分的疫苗：活的或死的FCV-21、FCV-49或FCV26391-4、源于本发 明任何FCV株的衣壳蛋白或其免疫原性片段、编码FCV-21、FCV-49 或FCV26391-4衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的重组病毒载体、或 编码源于FCV-21、FCV-49或FCV26391-4的衣壳蛋白或其特异的免疫 原性片段的DNA分子。在优选肌内注射的情况下，优选等渗制剂。一 般地，用于等渗的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨 糖醇和乳糖。在特定的情况下，优选等渗溶液例如磷酸盐缓冲的盐水。 所述配制也可以提供稳定剂，例如明胶和白蛋白。在一些实施方案中， 向制剂添加血管收缩剂。根据本发明的药物制品以无菌及无致热原的 形式提供。然而，本领域技术人员熟知，对于包含本发明疫苗的药学 上可接受的载体，优选的制剂是获得美国农业部或者等同的外国(例如 加拿大或墨西哥或任一一个欧洲国家)政府机构所颁布的条例批准用 于活猫杯状病毒疫苗、死猫杯状病毒疫苗、多肽(抗原)亚单位疫苗、 重组病毒载体疫苗、抗体疫苗和DNA疫苗的那些药学载体。因此，用 于商业生产本发明疫苗的药学上可接受的载体是已经或将要得到美国 或外国的适当政府机构批准的载体。疫苗还可以与药学上可接受的佐 剂混合。在本发明疫苗的某些制剂中，疫苗与其它猫疫苗联合以产生 多价疫苗产品，该产品可以针对由其它猫病原体引起的种类广泛的疾 病向猫提供保护作用。目前，猫疫苗的商业生产者以及最终用户偏爱 多价疫苗产品。因此，在一个优选实施方案中，本发明提供可以免疫 猫以抵抗猫杯状病毒以及至少一种其它的猫病原体的多价疫苗，其中 所述其它猫病原体优选选自：猫疱疹病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺 陷病毒、猫衣原体和猫全白细胞减少症病毒。

优选通过可以产生完全而广泛的免疫原性应答的单次免疫接种来 接种猫。在本发明另一实施方案中，给予猫一系列免疫接种以产生完 全而广泛的免疫应答。当提供一系列免疫接种时，这些免疫接种的提 供可以间隔大约1天至4周或更长的时间。在特定实施方案中，给猫 在不同位置同时进行接种。关于途径和施用的其它细节见下面题为“免 疫猫以抵抗杯状病毒的方法”的章节。

疫苗组合物任选地可以包括与疫苗相容的、药学上可接受的(即， 无菌的和无毒性的)液体、半固体或固体稀释剂，这些稀释剂可以充当 药学运载体(vehicle)、赋形剂或介质。稀释剂可以包括水、盐水、葡 萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、 山梨糖醇和乳糖等等。稳定剂包括白蛋白等。本领域已知的任何佐剂 均可以用于疫苗组合物中，包括基于油的佐剂，例如，弗氏完全佐剂 和弗氏不完全佐剂，基于霉菌酸的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)， 细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即，胞壁质、粘肽或糖蛋白例如N-Opaca、 胞壁酰二肽[MDP]或MDP类似物)、蛋白聚糖(例如，提取自肺炎克雷伯 氏杆菌(Klebsiella pneumoniae))、链球菌制品(例如OK432)、 Biostim^TM(例如，01K2)、EP 109 942、EP 180 564和EP 231 039的 “Iscoms”、氢氧化铝、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(例如，miglyol)、 植物油(例如花生油)、脂质体、多元醇类。佐剂包括，但不 限于，RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、胆固醇、 水包油乳剂、油包水乳剂，例如，弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚 物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、佐剂、皂苷、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL) 或其它皂苷级分、单磷酰脂A、Avridine脂-胺佐剂、来自大肠杆菌(E. coli)的热不稳定性肠毒素(重组的或者其它形式)、霍乱毒素、或胞壁 酰二肽等等。该免疫原性组合物还可以包括一种或多种其它免疫调制 剂，例如，白介素、干扰素或其它细胞因子。该免疫原性组合物还可 以包括庆大霉素和硫柳汞。尽管可用于本发明上下文的佐剂和添加剂 的量和浓度可以容易地由本领域技术人员确定，但本发明考虑组合物 包含大约50μg至大约2000μg佐剂以及优选地大约500μg/2ml剂量 的疫苗组合物。另一优选实施方案中，本发明考虑疫苗组合物包含大 约1μg/ml至大约60μg/ml抗生素，更优选地小于大约30μg/ml的 抗生素。

本发明免疫原性组合物可以根据施用途径制备为各种形式。例如， 可以将免疫原性组合物制备成适于注射使用的无菌水溶液或分散体， 或者使用冷冻干燥技术制备成冻干形式。冻干的免疫原性组合物典型 地在大约4℃下维持，并且可以在带有或不带有佐剂的稳定化溶液， 例如，盐水或/和HEPES中重构(reconstitute)。

此外，本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物可以包括一种或多 种药学上可接受的载体。本文中，“药学上可接受的载体”包括任何 及所有的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、 抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。载体必须在与本发明 成分相容并且无害于待免疫的个体这个意义上是“可接受的”。典型 地，载体将是无菌的且无致热原。

活疫苗

本发明疫苗的一个实施方案中，疫苗包含活的FCV疫苗，其中该 FCV成分选自：FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4。由于这些病毒株以 无毒性形式分离，故尤其优选用于制备可以刺激猫的免疫系统但不引 起疾病的活疫苗。

病毒的减毒方法是本领域已知的，包括诸如在适宜细胞系上在细 胞培养中连续传代或者紫外线或化学诱变等方法。

灭活疫苗

在本发明另一实施方案中，疫苗包含含有选自FCV-21、FCV-49 和FCV 26391-4的FCV株的灭活的或死的FCV疫苗。灭活疫苗可以通 过本领域熟知的方法制备。例如，一旦病毒增殖至高滴度后，本领域 技术人员易于明了，可以通过本领域熟知的方法获得该病毒的抗原性 物质。例如，可以通过稀释、浓缩或提取，获得该病毒的抗原性物质。 所有这些方法均已经被用于获得适当的病毒抗原性物质以制备疫苗。 可以通过使用福尔马林、β-丙内酯(betapropriolactone，BPL)或者 使用Binary ethyleneimine(BEI)处理，或者使用本领域已知的其它 方法，灭活杯状病毒。

福尔马林灭活通过将杯状病毒悬浮液与37％甲醛混合至0.05％甲 醛终浓度而实现。杯状病毒-甲醛混合物通过在室温下持续搅拌大约 24小时来混合。然后可以通过测试在适宜的猫细胞系例如CRFK细胞 上的生长的试验，检测该灭活的杯状病毒混合物中的残余活病毒。

BEI灭活通过将本发明的杯状病毒悬浮液与0.1M BEI(0.175N NaOH中2-溴-乙胺)混合至最终BEI浓度为1mM而实现。该杯状病毒 -BEI混合物通过在室温下持续搅拌大约48小时并之后添加1.0M硫代 硫酸钠至终浓度0.1mM而混合。再持续进行2小时的混合。通过测试 在适宜的猫细胞系例如NLFK细胞上的生长的试验，检测该灭活的杯状 病毒混合物中的残余活杯状病毒。

上述本发明灭活杯状病毒与任何一种药学上的载体混合以制备具 有适当剂量水平的灭活病毒疫苗。除了选自FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4的FCV成分，该灭活疫苗还可以包括至少一种其它的猫杯状 病毒株，此其它的猫杯状病毒优选地选自FCV-F9、FCV-M8、FCV-255 和FCV-2280。在一个优选实施方案中，疫苗还包括用于免疫猫以抵抗 一种或多种其它猫病原体的疫苗，其中所述其它猫病原体优选地选自 猫疱疹病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫衣原体和猫全白细 胞减少症病毒。

重组疫苗

在本发明再一实施方案中，疫苗包含含有编码此处公开的FCV衣 壳蛋白或其特异的免疫原性片段的核酸的重组病毒载体。

在一个特定的实施方案中，重组病毒载体是可以免疫猫以抵抗猫 杯状病毒及猫疱疹病毒两者的猫疱疹病毒。在另一实施方案中，重组 病毒载体包含一种或多种优选选自猫疱疹病毒、猫白血病病毒、猫免 疫缺陷病毒、猫衣原体和猫全白细胞减少症病毒、狂犬病毒和支气管 败血性鲍特菌的抗原。

为了制备表达FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的重组病毒 载体，将编码该衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的cDNA插入病毒载 体例如疱疹病毒、痘病毒或腺病毒的基因组中。Wardley等的美国专 利号5,716,822描述了将编码猫杯状病毒株CFI-68 FIV衣壳蛋白的 DNA插入猫疱疹病毒胸苷激酶基因中的方法。本发明包括的其它重组 病毒载体疫苗包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、细小病毒和各种痘 病毒载体以表达FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段。本发明尤其 包括表达FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的重组痘病毒载体疫 苗，该疫苗根据Paoletti等的美国专利号5,338,683和5,494,807(在 该专利文献中教导了由表达外来抗原的痘苗病毒或金丝雀痘病毒组成 的重组病毒载体)；Esposito等的美国专利号5,266,313(该专利文献 教导了表达狂犬病毒抗原的重组浣熊痘病毒载体)；以及Maes等的美 国专利号6,010,703(该专利文献教导了表达猫疱疹病毒gD或gB抗原 的重组浣熊痘病毒载体)之任一中教导的方法制备。

对于上述任何重组病毒载体，编码FCV衣壳蛋白或其特异的免疫 原性片段的cDNA与真核启动子(位于编码该抗原的cDNA的5’末端) 以及真核终止信号和Poly(A)信号(位于编码该抗原的cDNA的3’末端) 可操作地连接。在本文中，术语“可操作地连接”指：本发明多核苷 酸(作为cDNA分子)和含有表达控制序列的多核苷酸(DNA)，例如转录 启动子和终止序列，在载体或细胞中所处的位置使得该cDNA编码的抗 原的表达受到该表达控制序列的调节。用于克隆DNA例如编码FCV衣 壳蛋白或其特异的免疫原性片段的cDNA及与其可操作连接的含有表 达控制序列的DNA的方法，是本领域熟知的。适用于在重组病毒载体 中表达FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的启动子的实例是巨细 胞病毒立即早期(CMV)启动子、Rous肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启 动子、猿猴病毒40(SV40)立即早期启动子，和诱导型启动子例如金 属硫蛋白启动子。具有终止信号和Poly(A)信号的DNA的实例是SV40 的晚期poly(A)区。适用于产生抗原的另一病毒表达系统实例是可从 Invitrogen获得的Sindbis表达系统。这些商业可获得的表达载体和 系统的应用是本领域熟知的。

核酸或DNA分子疫苗

在本发明再一个实施方案中，提供核酸或DNA分子疫苗形式的疫 苗，该疫苗可以在猫中引起自动免疫反应。该DNA分子疫苗由具有编 码本文公开的FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的核酸序列的 DNA组成。

在一个优选实施方案中，该DNA分子疫苗包含SEQ ID NO：12、 14或16的核酸序列、或该核酸序列中编码SEQ ID NO：13、15或17 或SEQ ID NO：13、15或17的特异的免疫原性片段的片段。编码衣壳 蛋白或其特异的免疫原性片段的核酸可操作地连接在转录启动子的位 置或附近位置。这使得当该核酸被接种入猫细胞中时可以从该核酸实 现衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的转录。优选地，DNA分子是质 粒。可用于DNA疫苗的启动子是本领域熟知的，包括但不限于RSV LTR 启动子、CMV立即早期启动子和SV40T抗原启动子。还优选该核酸在 编码衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的序列的终止密码子位置或附 近位置可操作地连接至包含转录终止信号和poly(A)识别信号的核酸 片段上。可以在可接受的药学载体中或者在脂质或脂质替载体(类似于 Felgner的美国专利号5,703,055中公开的那些)中向猫提供DNA疫 苗。可以通过各种方法，例如肌内注射、intrajet注射或生物轰击， 将DNA疫苗提供给猫。DNA疫苗的制备方法及其使用方法提供在 Felgner的美国专利号5,589,466和5,580,859中。最后，制备药品 级质粒DNA的方法见Marquet等的美国专利号5,561,064中。

因此，使用上述方法，可以使用表达FCV衣壳蛋白或其特异的免 疫原性片段的DNA疫苗免疫猫以抵抗毒性猫杯状病毒。DNA疫苗的优 点在于该DNA分子可以方便地以质粒形式增殖，这是一种简单而价廉 的制备疫苗的方式，而且，由于该疫苗不是活的，故与活重组病毒载 体疫苗相关的许多管理问题不成为DNA疫苗的问题。本领域技术人员 将明了本发明DNA疫苗可以包含合成产生的核酸，该核酸可以通过本 领域熟知的化学合成方法制备。

分离的和纯化的FCV衣壳蛋白

在本发明再一实施方案中，疫苗由分离的和纯化的FCV衣壳蛋白 或其特异的免疫原性片段组成。尤其是，其中FCV衣壳蛋白或其特异 的免疫原性片段包含SEQ ID NO：13、15、17的氨基酸序列的疫苗。 优选地，该衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段在可产生该抗原的重组 细菌或真核表达载体中产生，该抗原可以被分离和纯化以制备所述疫 苗。例如，在微生物例如细菌、酵母或真菌中、在真核细胞例如哺乳 动物或昆虫细胞中、或通过重组病毒载体例如腺病毒、痘病毒、疱疹 病毒、Semliki森林病毒、杆状病毒、噬菌体、Sindbis病毒或Sendai 病毒，产生FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段。适用于产生FCV 衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的细菌包括大肠杆菌(Escherichia  coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或能够表达异源多肽的 任何其它细菌。适宜表达FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的酵 母类型包括酿酒酵母(Saccha romyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、假丝酵母(Candida)、或能够表达异 源多肽的任何其它酵母。使用上述细菌、真核细胞或重组病毒载体产 生可用于疫苗的抗原的方法是本领域熟知的。

为了制备由衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段组成的疫苗，可以 将编码FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的核酸克隆至质粒中， 并使该核酸与能够在微生物中实现该衣壳蛋白或其特异的免疫原性片 段的表达的启动子可操作地连接。适宜的启动子包括但不限于，T7噬 菌体启动子、T3噬菌体启动子、β-半乳糖苷酶启动子和Sp6噬菌体 启动子。FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段在微生物中的表达使 得可以使用商业上用于制备大量重组抗原性多肽的发酵技术生产该衣 壳蛋白。分离和纯化抗原的方法是本领域熟知的，包括例如凝胶过滤、 亲和层析、离子交换层析或离心等方法。

为了利于分离FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段，可以制备 融合多肽，其中衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段与使得可以通过亲 和层析进行分离的另一多肽连接。优选地，融合多肽使用以下一种表 达系统制备。例如，编码FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的cDNA 核酸序列在5’末端或3’末端与编码多肽的核酸连接。这些核酸连接 在正确的密码子阅读框中从而使得可以产生融合多肽，其中衣壳蛋白 或其部分的氨基和/或羧基端与允许该抗原以融合多肽形式得以简单 化地回收的多肽融合。融合多肽也可以防止抗原在纯化过程中被降解。 尽管包含融合多肽的疫苗是有效的，但是一些情况下可能期望在纯化 后除去该第二多肽。因此，也可以考虑该融合多肽在抗原和多肽之间 的接合位置含有切割位点。该切割位点由氨基酸序列组成，该氨基酸 序列可以被特异于该位点处的氨基酸序列的酶所切割。可以考虑的此 类切割位点的实例包括肠激酶切割位点(被肠激酶切割)、因子Xa切割 位点(被因子Xa切割)、和GENENASE切割位点(被GENENASE切割 (GENENASE是New England Biolabs，Beverly，Mass.的商标))。以 下是以融合多肽形式或者以无该多肽的分离的抗原形式生产衣壳蛋白 或其特异的免疫原性片段的方法。

以融合蛋白形式制备用于疫苗中的FCV衣壳蛋白或其特异的免疫 原性片段的原核表达系统的实例是可获自Amersham Pharmacia  Biotech，Piscataway，N.J.的谷光苷肽S-转移酶(GST)基因融合系 统，该系统使用pGEX-4T-1表达载体质粒。编码衣壳蛋白或其特异的 免疫原性片段的cDNA在正确的密码子阅读框中与编码GST的DNA融 合。该融合多肽的GST部分允许该融合多肽使用谷光苷肽Sepharose 4B亲和层析进行快速纯化。纯化后，融合多肽的GST部分可以通过使 用位点特异性蛋白酶例如凝血酶或因子Xa切割除去而产生无GST多肽 的抗原。无GST多肽的衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段可以通过第 二轮谷光苷肽Sepharose 4B亲和层析产生。

制备包含FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的疫苗的另一种 方法是将编码该抗原的cDNA和编码多组氨酸的DNA密码子在读框内连 接的方法。该多组氨酸优选地包含6个组氨酸残基，这允许通过金属 亲和层析(优选地，镍亲和层析)纯化该融合多肽。为了制备无该多组 氨酸的衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段，可以在正确读框内在编码 多组氨酸的密码子和编码抗原的密码子之间融合切割位点，例如肠激 酶切割位点。通过肠激酶的切割，以及随后第二轮结合游离多组氨酸 的金属亲和层析，从该抗原上可以去除掉该多组氨酸。此方法被证实 可以用于制备鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)的LcrV抗原，见Motin等 的公开(Infect.Immun.64：4313-4318(1996))。可从Invitrogen (Carlsbad，California)获得的Xpress系统是可用于制备并之后分离 多组氨酸-多肽融合蛋白的商业试剂盒的实例。

再一可用于制备包含FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的疫 苗的方法利用了Motin等，Infect.Immun.64：3021-3029(1995) 公开的方法。Motin等公开了编码融合多肽的DNA，该DNA由与编码蛋 白A部分的DNA连接的抗原编码DNA组成，其中编码肠激酶切割位点 的DNA在正确密码子阅读框中被置于编码蛋白A的DNA和编码抗原的 DNA之间。蛋白A使得该融合蛋白可以通过IgG亲和层析分离，并且 无蛋白A的衣壳蛋白可以通过使用肠激酶切割而产生。然后可以通过 第二轮IgG亲和层析去除蛋白A。

制备包含FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的疫苗的另一方 法基于Daniels等的美国专利号5,725,863中公开的方法(在此完整并 入作为参考)。Daniels等的方法可以用于制备由肠毒素分子组成的 FCV衣壳疫苗，其中每个分子在FCV衣壳蛋白的100个氨基酸的上游 插入其中。可以用于制备本发明疫苗的其它融合多肽疫苗制备方法公 开在美国专利号5,585,100(Mond等)和美国专利号5,589,384 (Liscombe)。最后，可从New England Biolabs获得的pMAL融合及 纯化系统是融合多肽制备方法的另一实例，其中麦芽糖结合蛋白与衣 壳蛋白或其特异的免疫原性片段融合。该麦芽糖结合蛋白利于该融合 多肽通过直链淀粉亲和层析而分离。该麦芽糖结合蛋白可以与抗原通 过一种以上提及的切割位点连接，由此该切割位点将使得可以制备无 该麦芽糖结合蛋白的该抗原。

尽管可以使用细菌方法制备用于疫苗的FCV衣壳蛋白或其特异的 免疫原性片段，但可能期望在真核表达系统中产生衣壳蛋白或其特异 的免疫原性片段。一个尤其有用的系统是Matsuura等的美国专利号 5,229,293中公开的杆状病毒表达系统(完整地并入此处作为参考)。 适于产生衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段的杆状病毒表达载体是来 自Stratagene的pPbac和pMbac；和可获自Invitrogen(Carlsbad， Calif.)的Bac-N-Blue载体、pBlueBac4.5载体、pBlueBacHis2-A，B，C 和pMelBac。

可用于表达在疫苗中使用的FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片 段的另一真核系统是酵母表达系统，例如可从Stratagene获得的ESP 酵母蛋白表达和纯化系统。另一酵母表达系统是来自Invitrogen的任 何一种基于毕赤酵母(Pichia)的表达系统。哺乳动物表达系统也在本 发明范围内。哺乳动物表达系统的实例是Stratagene的LacSwith II 系统、pBK噬菌粒、pXT1载体系统和pSG5载体系统；可从Promega 公司(Madison，Wis.)获得的pTargeT哺乳动物表达载体系统、pSI哺 乳动物表达载体、pCI哺乳动物表达载体和pAdVantage载体；和可从 Invitrogen获得的蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统、pCDM8、 pcDNA1.1和pcDNA1.1/Amp。

本发明还包括由包含作为热稳定性孢子递送系统的成分的FCV衣 壳蛋白或该衣壳蛋白的特定表位的疫苗组成的实施方案，其中所述递 送系统根据Acheson等的美国专利号5,800,821中教导的方法(完整地 并入作为参考)制备。因此，本发明提供含有编码FCV衣壳蛋白或其特 异的免疫原性片段的核酸的遗传工程细菌细胞。当将重组细菌孢子疫 苗通过口服施用给猫时，孢子在猫的胃肠道中萌发，并且该细菌表达 衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段，该衣壳蛋白或其特异的免疫原性 片段与猫的免疫系统发生接触并引发免疫应答。该疫苗具有热稳定的 优点；因此，可以在室温下无限期的贮存。

被动免疫疫苗

尽管本发明上述实施方案提供了抗猫杯状病毒的自动免疫，但本 发明还包括提供对猫杯状病毒的被动免疫力的疫苗。引发抗猫杯状病 毒的被动免疫的疫苗由抗FCV衣壳蛋白或其特异的免疫原性片段或整 个FCV病毒的多克隆抗体或单克隆抗体组成。

为了制备包含多克隆抗体的被动免疫疫苗，可以将FCV衣壳蛋白 或其特异的免疫原性片段注射入适宜宿主中以产生这些抗体，优选地， 所述宿主是马、猪、兔、绵羊或山羊。从这些宿主产生多克隆抗体疫 苗的方法是本领域熟知的。例如，可以将衣壳蛋白或其特异的免疫原 性片段或整个杯状病毒FCV衣壳与佐剂例如弗氏完全佐剂或可从 CytRx公司(Norcross，Ga.)获得的毒性较低的TiterMax混合，然后 通过本领域熟知的方法施用给宿主。监测抗体的产生，当已经产生了 足够抗体后，从宿主取出血清，并优选地从血清中回收该抗体。

被动免疫疫苗可以包含抗FCV衣壳蛋白或整个FCV病毒的一个或 多个表位的一种或多种单克隆抗体。用于生产单克隆抗体的方法和杂 交瘤是本领域熟知的。尽管可以使用杂交瘤技术制备单克隆抗体，但 是也可以根据噬菌体展示方法例如Marks等的美国专利号5,977,322 (完整地并入此处作为参考)中公开的方法制备抗该抗原的单克隆抗 体。可以根据已经用于使抗体人源化的方法，例如Queen等的美国专 利号5,693,762和5,693,761(完整地并入此处作为参考)公开的方法， 制备抗衣壳蛋白或其部分的猫源化抗体。一种可用于制备单克隆抗体 的噬菌体展示试剂盒是可从Amersham Pharmacia Biotech获得的重组 噬菌体抗体系统。

多克隆和单克隆抗体

本发明还包括、描述、和要求保护几种非常重要的单克隆抗体。 这些抗体在此研发以便快速地鉴定以及在一些情况下定义本文描述的 病毒株。单克隆抗体的具体实例及其描述可以见以下实施例。尤其参 见实施例1-2和表1-2，并特别参见实施例1-8，表1-4。

以下实施例旨在促进而非限制对本发明的进一步理解。

第1部分实施例

实施例1-1.FCV-21的分离和生长

猫杯状病毒(FCV)21株(FCV-21)于1993年6月自Michigan州Ann  Arbor的猫展示会上收集。将其稀释在含有1％培养基的96孔微量管中， 制成1∶10稀释液。将100μl该稀释的样品加入96孔板中的100μl CRFK细胞中。

通过在96孔板中有限稀释，将该FCV-21病毒纯化3次。自最终 纯化物获取病毒上清液，用于感染于T25烧瓶中生长至75％汇合度的 CRFK细胞。当观察到100％CPE时，冻/融上清液三次，并等分至冷冻 瓶(1ml/瓶)。该病毒原液的滴度经测定是1.5×10⁸TCID₅₀/ml。

FCV-21于2006年2月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC) (10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110，USA)，ATCC保藏 号为PTA-7346。

实施例1-2.使用各种商业或现有单克隆抗体对FCV-21进行的免 疫荧光和ELISA分析

对于免疫荧光分析试验(IFA)，使用FCV-21的病毒原液感染接种 在24孔板中生长至大约90％汇合度的NLFK细胞。感染后大约20小时， 用1×PBS洗涤板子2次，并用80％丙酮固定。将各种单克隆抗体稀 释至大约2μg/μl，并加入板子的各孔中(0.2ml/孔)。振荡下室温(RT) 孵育1小时后，用1×PBS洗涤每孔2次，加入二抗(抗小鼠FITC，10 μg/ml)。用铝箔覆盖板子并振荡下RT孵育30分钟后，用1×PBS洗 涤每孔2次，并空气干燥。然后在荧光显微镜下观察每孔的FITC染色 强度。

对于ELISA试验，用200μl以1∶1500稀释在碳酸钠缓冲液(1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃，溶解在1升水中)中的抗FCV兔多克隆抗体 (Pfizer#16)包被96孔ELISA板。4℃过夜孵育板子。用含有0.05％ Tween-20的1×PBS(pH7.4)(PBST)洗涤板子3次，然后用200μl 于PBST中的1％酪蛋白37℃封闭1小时。将各种单克隆抗体稀释至大 约0.1μg/ml并加至各孔(100μl/孔)。每种样品进行一式三份试验。 37℃温育1小时后，用PBST将每孔洗涤3次，并与100μl 1∶200稀 释的过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson  ImmunoResearch，cat.No.715-035-150)一起37℃温育1小时。然 后用PBST洗涤每孔3次，之后向每孔加入100μl ABTS过氧化物酶底 物(KPL，Gaithersburg，Maryland，cat.No.50-66-18)。RT大约 10分钟后，使用ELISA读数器于405-490nm(双波长)读板。基于信/ 噪比计算比活性。

来自IFA和ELISA试验的数据集彼此良好地相关(表1-2)，说明 FCV-21与F9(通常使用的FCV疫苗株)在免疫学上是不同的。两种单克 隆抗体(FCV 1-43和MAB791P)与F9反应，但不与FCV-21反应(表1-2)。

表1-2.总结各种单克隆抗体对FCV株F9和FCV-21的亲和力

实施例1-3.FCV-21衣壳序列分析

从FCV-21感染的细胞培养物上清液使用TRIzol试剂 (Invitrogen；Carlsbad，CA)分离总RNA。使用随机引物和 Superscript II逆转录酶(Invitrogen)合成“第一链”cDNA制备物。 使用XL rTth聚合酶(Applied Biosys tems；Foster City；CA)和寡 核苷酸引物DEL-653(SEQ ID NO：1)和DEL-651(SEQ ID NO：2)， 进行PCR反应。使用BigDye化学和ABI377遗传分析仪对所得PCR产 物进行测序。完整衣壳序列显示于SEQ ID NO：12(核苷酸序列)和SEQ  ID NO：13(编码的氨基酸序列)。

实施例1-4.FCV-49的分离和生长

猫杯状病毒(FCV)49株(FCV-49，也称作PHA-49)于1993年自 Philadelphia，PA猫展示会收集。将该标本稀释在含有1％培养基的 96孔微量管中，制成1∶10稀释物。将100μl该稀释的样品加入96 孔板中的100μl CRFK细胞中。通过在96孔板中有限稀释，将该FCV-49 病毒纯化3次。自最终纯化物获取病毒上清液，用于感染于T25烧瓶 中生长至75％汇合度的CRFK细胞。当观察到100％CPE时，冻/融上清 液三次，并等分至冷冻瓶(1ml/瓶)。该病毒原液的滴度经测定是6.8 ×10⁷ TC ID₅₀/ml。

FCV-49于2006年2月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC) (10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110，USA)，ATCC保藏 号为PTA-7347。

实施例1-5.FCV-49衣壳序列分析

从FCV-49感染的细胞培养物上清液使用TRIzol试剂 (Invitrogen；Carlsbad，CA)分离总RNA。使用随机引物和 Superscript II逆转录酶(Invitrogen)合成“第一链”cDNA制备物。 使用XL rTth聚合酶(Applied Biosystems；Foster City；CA)和寡 核苷酸引物DEL-653(SEQ ID NO：1)和DEL-651(SEQ ID NO：2)， 进行PCR反应。使用BigDye化学和ABI377遗传分析仪对所得PCR产 物进行测序。完整衣壳序列显示于SEQ ID NO：14(核苷酸序列)和SEQ  ID NO：15(编码的氨基酸序列)。

实施例1-6.FCV-26391-4的分离和生长

猫杯状病毒(FCV)26391-4株(FCV-26391-4)于2003年自Bay County的Humane Society(Panama City，Florida)收集。通过在含 有具2％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)的96孔板中有限稀释， 将其纯化1次。然后使用该纯化的病毒感染T150烧瓶中所含的 NLFK(Norden实验室猫肾)细胞。一旦达到100％CPE，冻/融上清液三 次，并等分至冷冻瓶(0.85ml/瓶)。该病毒原液的滴度经测定是5.6× 10⁷TCI D₅₀/ml。

FCV-26391-4于2006年2月1日保藏在美国典型培养物保藏中心 (ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110，USA)， ATCC保藏号为PTA-7348。

实施例1-7.FCV26391-4衣壳序列分析

从FCV 26391-4感染的细胞培养物上清液使用QIAamp病毒RNA 分离试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)分离总RNA。将大约1μg病毒 RNA用于RT-PCR(使用Platinum Taq的SuperScript一步RT-PCR； 来自Invitrogen)。反应条件为：50℃ 30分钟；94℃ 2分钟；之后 40个循环，每个循环为94℃ 15秒、55℃ 30秒和70℃ 2分钟；之 后72℃最后温育10分钟，并4℃储存。所用引物是FCV-N2(SEQ ID NO： 3)和FCV-引物2(SEQ ID NO：9)。然后使用各种寡核苷酸引物(SEQ ID  NO：3，4，5，6，7，8，9，10和11)，对该PCR产物进行测序。FCV  26391-4的完整衣壳序列显示于SEQ ID NO：16(核苷酸序列)和SEQ ID  NO：17(编码的氨基酸序列)。

FCV-21、FCV-49和FCV-26391-4的衣壳基因的氨基酸序列与 GenBank中存在的所有全长FCV衣壳序列进行比对。该比对使用 ClustalW算法(Thompson等，1994)、PAM250权重矩阵(Dayhoff等， 1978)和默认程序参数(MegAlign；DNASTAR，Inc；Madison，WI)进行。 FCV-21和FCV 213-95的衣壳蛋白序列之间的同一性是GenBank中所 有条目中最高的，为90.7％。FCV-49和FCV 213-95衣壳序列有92.2％ 同一性。FCV 26391-4和FCV CFI-68衣壳序列彼此有91.3％同一性。

对于FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4，给出了单一一个衣壳序列， 该序列基于对所获PCR的直接测序。然而，这些序列每一个均代表一 个病毒准种群体(已知存在于RNA病毒群体中)(综述见Domingo等， Virus Res.82：39-44，2002)中的平均或共有序列。准种是RNA基 因组复制过程中发生的错误的直接结果，由此产生基因组中具有突变 的后代。因此，预期对于这些和其它FCV衣壳基因序列而言天然存在 衣壳序列的微小变异。然而，每个序列中突变的分布将对毒株(包括 FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4)之间的总体同一性几乎不/完全不产 生影响。

实施例1-8.特异于FCV-21的单克隆抗体的制备

A.FCV-21的纯化。将来自感染了FCV-21的NLFK细胞的约200ml 细胞培养物上清液以3,000rpm在10℃离心30分钟。将25ml上清液 转移至Beckman Ultraclear离心管中，并将10ml 10％蔗糖溶液铺在 管底。然后管子以27,000rpm、15℃离心2小时。离心后，取出上清 液并丢弃，沉淀重悬浮在250μl无菌水中。使用Micro BCA蛋白分析 试剂盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)测定蛋白浓度为 7mg/ml。

小鼠的免疫和杂交瘤细胞克隆的制备

将大约100μg纯化的FCV-21病毒蛋白与弗氏佐剂一起注射入每 只小鼠。免疫接种8只小鼠。使用100μg纯化的FCV-21和RIBI佐剂 以4周为间隔进行两次加强免疫。使用纯化的FCV-21在ELISA中测定 8只小鼠的免疫应答，具有31250或以上的效价。进行细胞融合产生 杂交瘤克隆。培养68个此类细胞克隆，并检测上清液与FCV-21的反 应性。

对于此ELISA，用100μl纯化的FCV以5μg/ml的浓度(稀释在1 ×PBS中)包被96孔ELISA板。板子在非增湿的温箱中37℃不加盖干 燥过夜。通过施用0.1ml甲醇并室温温育5分钟，固定板上的病毒。 然后用蒸馏水洗涤板8次，然后用200μl于1×PBS中的10％ house 血清4℃封闭过夜。再次用蒸馏水洗涤板子8次。将各种稀释度的小 鼠血清样品加入各孔(100μl/孔)。每个样品进行一式三份重复。37℃ 温育1小时后，每孔用PBST洗涤3次，并与100μl 1∶200稀释的过 氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson  ImmunoResearch，Cat.No.715-035-150)37℃温育1小时。然后每 孔用PBST洗涤3次，之后每孔加入100μl ABTS过氧化物酶底物(KPL， Gaithersburg，Maryland，Cat.No.50-66-18)。RT大约10分钟后， 用ELISA读数器于405-490nm(双波长)读板。基于信/噪比计算比活 性。

FCV-21特异性单克隆抗体的反应性

使用以上杂交瘤细胞克隆的上清液在夹心ELISA试验中检测其对 FCV-21和F9的反应性。简而言之，用200μl以1∶1500稀释在碳酸 钠缓冲液(1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃，溶解在1升水中)中的抗FCV 兔多克隆抗体(Pfizer#16)包被96孔ELISA板。4℃过夜孵育板子。 用含有0.05％ Tween-20的1×PBS(pH7.4)(PBST)洗涤板子3次， 然后用200μl于PBST中的1％酪蛋白37℃封闭1小时。向每孔加入 1∶10稀释的FCV-21和F-9上清液。37℃温育1小时后，洗涤板子并 按一式三份向各孔加入各种杂交瘤上清液和它们的各种稀释物(100μ l/孔)。然后，板子在37℃温育1小时，用PBST洗涤3次，并与100 μl 1∶200稀释的过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L) (Jackson ImmunoResearch，Cat.No.715-035-150)一起37℃温育1 小时。洗涤后，向每孔加入100μl ABTS过氧化物酶底物(KPL， Gaithersburg，Maryland，Cat.No.50-66-18)。RT大约10分钟后， 使用ELISA读数器于405-490nm(双波长)读板。基于信/噪比计算比 活性。

表1-3.ELISA筛选各种杂交瘤细胞上清液对FCV-21及F9的特异 反应性

B.特异于FCV-21而非其它FCV株的单克隆抗体。选择18个杂交 瘤细胞克隆(3、7、17、23、27、29、30、36、37、40、41、42、44、 53、56、59、60和61)，进一步检测其对FCV-21的特异性。在本试验 中使用11种FCV病毒(FCV-21，49，26391-4，F9，CFI-68，33585， 89391，255，J-1，2280和H)。再次使用如上所述的夹心ELISA。结 果总结在表1-4中。

表1-4.单克隆上清液对各种FCV株的反应性

如上显示的，杂交瘤细胞系23、41、44和56对FCV-21具有特异 性而对任何其它的测试FCV不具有特异性。因此，这些单克隆抗体可 以用作FCV-21的诊断工具。而且，杂交瘤36似乎仅与疫苗FCV株 (FCV-21、49、26391-4)反应而不与任何其它的FCV株反应。

杂交瘤细胞系23、36、41、44和56全部于2006年2月1日保藏 在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.， Manassas，VA，20110，USA)，并具有如下ATCC保藏号：

PTA-7349(23)

PTA-7350(36)

PTA-7353(41)

PTA-7351(44)

PTA-7352(56)

实施例1-9.FCV-21和FCV-49的血清针对1993年分离的FCV病 毒的血清交叉中和分析

A.同源抗血清的滴定。在无特定病原体(SPF)猫中产生抗12种 FCV分离株的恢复期抗血清，并在第一和第二次接种后收集该抗血清。 该病毒接种物根据原液滴度而变，范围在10⁴至10⁸TCID₅₀/猫之间。初 次给猫接种，3周后进行加强，然后于加强后2周放血取血清。所述 12种分离株包括F9、CFI-68、LSO12、JOK63、JOK92、和野外分离株 18、21、49、50、54、27和11。这些野外分离株基于各株衣壳蛋白序 列的高变区序列的系统发生分析而选择。选择最大趋异的分离株进行 该研究。

56℃30分钟热灭活血清，使用标准恒定病毒-可变血清技术 (Griest 1979，Mahy 1996)，针对其同源病毒进行滴定。简而言之， 向96孔组织培养板的每孔中加入培养基(100-150μl)。向顶排的每孔 加入血清(100-150μl)(1∶2或1∶4最初的血清稀释；F9和LSO12为 1∶4)，使用多道吸液器混合(1∶2稀释)后将100μl在板上向下转移。 丢弃最后的100μl。向每孔加入50μl滴定过的同源病毒(稀释至200 TCID₅₀/50μl)，板子在CO₂温箱中37℃温育2小时。温育后，每孔加 入50μl 1∶10稀释的CRFK细胞悬浮液。使用该稀释的病毒设置病毒 滴度板以确保向每孔添加适当的接种物。在含有150μl培养基的顶排 使用50μl病毒；板的剩余部分含有180μl/孔，并使用20μl在板 上向下实施10倍稀释。板子温育4天，使用公式计算血清和 病毒滴定(对于血清滴度，在等式中使用受保护的孔与未受保护的孔的 比率)。

当滴定血清时，TCID₅₀定义为50％的中和终点稀释度(Griest  1979)。一个抗体单位(AU)定义为在50％测试培养物中能够中和32-320 TCID₅₀的同源病毒的该抗血清的最高稀释度。因此，获得的该TCID₅₀等于1AU。针对2.5、5、10和20AU的血清浓度实施病毒交叉中和。

B.病毒交叉中和试验。每个病毒野外分离株以及病毒株F9、 LSO12、JOK63、JOK92、SA113和CFI-68在交叉中和试验中针对12种 FCV抗血清之每一种进行测试。每种病毒需要5块96孔板。每种血清 稀释至2.5、5、10和20AU，在板上向下8次重复接种(3种血清/板， 总4块板)，以及一块病毒滴度板(按用于血清滴定的相同方式设置)。 通过首先将血清稀释至20AU，然后向下进行2倍稀释至2.5AU，在DMEM 中制备抗血清稀释物。然后将每种稀释物的等分试样(100μl)加入板 的每一列孔。将病毒37℃快速融化，置于冰上，然后稀释至200TCID₅₀/ 孔(置于冰上)。为了维持均一性，对于大多数病毒原液使用3步稀释 法，在任一步都不超过1∶100。将稀释的病毒原液(50μl)加入血清板 的所有孔，按前述进行滴定。板子在37℃于CO₂温箱中温育2小时， 之后向每孔加入50μl 1∶10稀释的之前生长至汇合的CRFK细胞悬浮 液。在每一组5块板后更换吸液器头和储液槽。4天后对板子进行评 分。一些情况下，使用预先滴定的、预先稀释的病毒。

表1-5.血清交叉中和结果

*SN中使用2.5、5、10、20个抗体单位，N＝8/8被保护的孔

n＝4-7/8被保护的孔，-＝0-3/8被保护的孔，空白＝血清不足/未 做

表1-5(续)

*SN中使用2.5、5、10、20个抗体单位

N＝8/8被保护的孔

n＝4-7/8被保护的孔

-＝0-3/8被保护的孔

空白＝血清不足/未做

交叉中和数据总结在表1-5中。每个数据点代表分析的8个重复 孔。“N”、“n”或“-”代表被保护的孔相对于未保护的孔的比率， 该比率指示了交叉中和的程度。表中突出显示的血清中和结果对应于 每种单特异性血清针对其同源病毒检测到的结果。这些血清应当完全 地中和；对于大部分而言它们确是如此。少数例外，最显著的是JOK63、 JOK92和11，在较高AU值时表现出完全的中和作用，但是在2.5AU 时则不。这可能是由于稀释误差导致的。该数据集中最显著的结果是 血清FCV-21和FCV-49，尤其是后者，所表现出的高度交叉中和作用。 这些血清的交叉中和模式似乎类似于F9的。(应当注意，对于F9以 及对于FCV-21和FCV-49在20AU下的数据集由于血清量不足而是不完 全的)。尽管3种血清(FCV-21、FCV-49和F9)之间在中和模式上存在 一些差异，但是分离株11、38和39一贯地不被这三种血清中的任一 种所中和。

实施例1-10.FCV-21和FCV-49抗血清针对2003年分离的FCV 病毒进行的交叉中和分析

本研究中的FCV抗血清通过使用10⁵至10⁶TCID₅₀/ml FCV鼻内接 种猫(4-5只猫/组)而产生。之后3周使用相同量的病毒进行加强接种。 加强接种后2周收集血清，并56℃ 30分钟热灭活。

将来自每只接种的猫的血清样品用于血清中和试验中针对26种 FCV株之每一种进行分析(表1-6)。以1∶8稀释血清样品并之后在600 μl体积中进行2倍系列稀释至1∶16384(总共12次稀释)。将600μ l中具有50-500TCID₅₀/ml滴度的FCV与稀释的血清样品一起混合， 并室温温育45分钟。然后，按一式四份将200μl样品转移至接种有 CRFK细胞的96孔板的每孔中。板子于37℃，5％CO₂下温育6天，确 定终点中和滴度。根据Spearman-Karber的方法(Spearman C，1908， Brit J Psychol 2：227-242；Karber G，1931，Arch exp Path Pharmak  162：480-487)，计算血清中和(SN)滴度和攻击病毒的返滴定滴度 (back-t it er)。

用＞23和＞15和＞10的截断滴度分析血清中和数据。结果显示在表 1-7中。数据提示FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4具有更宽的交叉中 和谱，因此是比现有的FCV疫苗株F9更好的疫苗候选者。

表1-6.交叉中和研究中使用的26种FCV株

表1-7.与F9相比较对FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4进行的 交叉中和分析

实施例1-11.接种带有和不带有FCV-21的Felocell 4成分的猫 的死亡率和临床得分

约8周龄的家养短毛猫接种4成分，其中该成分含有 修饰的活猫鼻气管炎病毒[FHV]、杯状病毒[FCV-F9]、全白细胞减少症 病毒[FP]和鹦鹉热衣原体并含有或不含有另一种FCV株FCV-21。所评 价的免疫接种方案包括：初次皮下接种，之后于第21天皮下加强接种 (SQ/SQ)；初次皮下接种，之后在第21天进行一次口服加强免疫(SQ/ 口服)；或者初次口服免疫接种，之后于第21天第二次口服免疫接种。 口服接种通过将疫苗施用于口中来实现。第42天，用大约1ml强毒性 系统性FCV-33585(3log的TCID₅₀/ml)攻击所有的猫。攻击后持续 14天监测所有猫的疾病临床征候(温度、结膜炎浆液状排出物、结膜 炎含粘液脓性排出物、鼻炎浆液状排出物、鼻炎含粘液脓性排出物、 打喷嚏、可听见的罗音、咳嗽、张嘴呼吸、厌食、脱水、＜4mm的一个 口腔溃疡、多个口腔溃疡、＞4mm的口腔溃疡、过量分泌唾液、非流血 性表面溃疡、流血性表面溃疡)。将攻击后表现出与杯状病毒发病相一 致的几种临床征候的猫处安乐死。

如表1-8所示，添加新的毒株FCV-21显著地增加FELOCELL 4(有 或无FCV-F9存在)的效力。SQ/SQ接种和SQ/口服接种两者均似乎可以 有效地预防FCV感染。而且，我们已经证实在FELOCELL 4和FELOCELL  3(FELOCELL 3是无鹦鹉热衣原体的FELOCELL 4)中添加FCV-21但不 存在F9的情况下甚至通过口服/口服免疫接种也可以有效地抗FCV感 染。

对于表1-9，所评价的免疫接种方案包括初次皮下接种之后于第 21天和第42天进行两次口服加强免疫(SQ/口服/口服)。我们证实， 在FELOCELL 4中添加FCV-21，无论是否存在FCV-F9，均显著地降低 了死亡率和临床得分。

实施例1-12.来自使用具有和不具有FCV-21的FELOCELL 4成分 免疫接种的猫的血清的交叉中和分析

从实施例1-11所描述的研究中在第二次接种后但在85攻击之前 的每只猫收集血清。样品56℃热处理30分钟，并在血清中和试验中 针对之前实施例1-10中所述26种FCV株(表1-6)之每一种进行评价。

使用＞23和＞15的截断滴度分析血清中和数据，计算两个截断滴度 的平均值(Ave)。结果显示在表1-10种。数据显示，含有FCV-21的所 有疫苗制剂均比含有传统FCV-F9株的疫苗具有更宽的交叉中和谱(大 约60％对40％)。这导致被中和的FCV株数目增加了大约50％。

*FELOCELL 4A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 4

**FELOCELL 3A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 3

如表1-10所示，添加新毒株FCV-21，无论是否存在FCV-F9，均 显著地增加了FELOCELL 4的交叉中和谱。使用SQ/SQ接种和SQ/口服 接种均观察到较宽的中和谱。而且，我们证实FELOCELL 4和FELOCELL  3中存在FCV-21但无F9时使用口服/口服免疫接种增强了交叉中和 谱。

表1-11中，所评价的免疫接种方案包括初次的皮下接种及之后于 第21天和第42天的两次加强免疫(SQ/口服/口服)。结果说明，在 FELOCELL 4中添加FCV-21在有或无FCV-F9的情况下均导致显著更宽 的交叉中和谱(大约增加40％)。

*FELOCELL 4A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 4

编号的本发明描述。本发明的其它描述和实施例。1.用于免疫猫 以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-21衣壳蛋白或分离的FCV-21 衣壳蛋白。2.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-21 衣壳蛋白或分离的FCV-21衣壳蛋白和药学上可接受的载体，其中所述 衣壳蛋白包含蛋白质序列(SEQ ID NO：13)和具有至少大约91.2％、95％ 和99％同一性的序列；其中所述衣壳蛋白以有效产生免疫应答的量提 供。3.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的DNA疫苗，其包含编码FCV-21 衣壳蛋白或分离的FCV-21衣壳蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序 列(SEQ ID NO：12)和具有至少大约78.7％和79.2％序列同一性并允许 保守替代的序列。4.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含 FCV-49衣壳蛋白或分离的FCV-49衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包含 来自FCV-49株的蛋白质序列。5.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫 苗，其包含FCV-49衣壳蛋白或分离的FCV-49衣壳蛋白和药学上可接 受的载体，其中所述衣壳蛋白包含蛋白质序列(SEQ ID NO：15)和具有 至少大约92.7％、95％和99％同一性的序列；其中所述衣壳蛋白以有 效产生免疫应答的量提供。6.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的DNA 疫苗，其包含编码FCV-49衣壳蛋白或分离的FCV-49衣壳蛋白的核酸 序列，其中所述DNA包含序列(SEQ ID NO：14)和具有至少大约78.9％， 即79.4％(78.9+0.5)序列同一性并允许保守替代的序列。7.用于免 疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-26391-4衣壳蛋白或分离 的FCV-26391-4衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包含来自FCV-26391-4 株的蛋白质序列。8.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含 FCV-26391-4衣壳蛋白和药学上可接受的载体，其中所述衣壳蛋白包 含蛋白质序列(SEQ ID NO：17)和具有至少大约91.8％、95％和99％同 一性的序列；其中所述衣壳蛋白以有效产生免疫应答的量提供。9.用 于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的DNA疫苗，其包含编码FCV-26391-4衣 壳蛋白或分离的FCV-26391-4衣壳蛋白的核酸序列，其中所述DNA包 含序列(SEQ ID NO：16)和具有至少大约78.4％，即78.9％(78.4+0.5) 序列同一性的序列。10.权利要求1-3之任一项的疫苗，其中多核苷 酸选自基本上由SEQ ID NO：12、14、16组成的组。11.权利要求1-3 之任一项的疫苗，还包含以下的单独一项或任何组合：其中疫苗包含 佐剂，其中FCV成分是活的，其中FCV成分是减毒的，其中FCV成分 是灭活的，该疫苗可以包括至少一种选自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、 FCV-255和FCV-2280的其它猫杯状病毒株。12.权利要求1、4和7 的疫苗，其中疫苗包括至少一种选自猫疱疹病毒、猫白血病病毒、猫 免疫缺陷病毒、鹦鹉热衣原体和猫细小病毒、狂犬病毒和支气管败血 性鲍特菌的其它猫病原体。13.免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其 包含有效产生免疫应答的量的FCV衣壳蛋白的核苷酸序列和药学上可 接受的载体，所述衣壳蛋白选自与SEQ ID NO：13、15或17具有93％ 或更高同一性的多肽，其中所述FCV分离株不是213-95株，并且其中 所述核酸序列与异源启动子序列可操作地连接。14.权利要求13的疫 苗，其中核苷酸序列选自基本上由SEQ ID NO：12、14和16组成的组。 15.权利要求13的疫苗，其中核苷酸序列以以下任一种形式存在：质 粒、重组病毒载体。16.权利要求13的疫苗，其中重组病毒载体选自 猫疱疹病毒、浣熊痘病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒、Semliki森林病 毒、Sindbis病毒和痘苗病毒。17.包含兽医学上可接受的赋形剂载 体和分离的FCV株的免疫原性组合物，其中所述FCV株可以与选自本 文描述为23、26、41、44和56的单克隆抗体的单克隆抗体结合。18. 包含兽医学上可接受的赋形剂载体和分离的FCV株的免疫原性组合 物，其中所述FCV株选择性地与选自本文描述为23、26、41、44和 56的单克隆抗体的单克隆抗体结合。19.权利要求17和18的免疫原 性组合物，其中FCV株是灭活的，其中所述FCV株是疫苗并且其中该 组合物包含佐剂。20.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的方法，包括： 给猫施用有效剂量的权利要求1-14之任一项的疫苗，其中该疫苗还包 含佐剂。

第2部分

以下部分提供有关免疫动物以抵抗病毒，尤其是免疫猫以抵抗杯 状病毒的方法的详细信息

除非另行指明，否则以下的公开使用上面和下面给出的定义。

此处描述使用疫苗治疗和免疫动物，尤其是猫以抵抗猫杯状病毒 (FCV)的方法和材料。该方法包括给猫施用治疗有效量的第一和第二疫 苗，所述疫苗能够诱导免疫应答，尤其是在猫中诱导抗FCV的免疫应 答。第一疫苗典型地通过胃肠外途径施用，但在一些情况下可以通过 口服施用，而第二疫苗通过口服或者口鼻途径于第一疫苗施用后N天 施用。这些疫苗典型地首先通过胃肠外途径施用，因为如果最初通过 口服途径施用，它们典型地将造成口腔损伤。令人惊奇的是，在此我 们公开了FCV-21、FCV-49和FCV 26391-4株，这些病毒株十分安全和 有效以致可以按照第一次口服施用之后第二次口服施用的方式进行施 用。在此，N为3至120(包括3和120)的整数，但典型地是7至42(包 括7和42)的整数，或者14至28(包括14和28)的整数，优选是大 约3周以及大约2-4周。备选地，第二疫苗可以在猫出现大约1∶6、 1∶9、1∶12、1∶15、1∶18或更高的FCV血清中和滴度后施用。

该方法也可以包括在第一疫苗或第二疫苗施用后M天再进行一次 或多次胃肠外、口服或口鼻FCV疫苗施用，其中M是1至120(包括1 和120)的整数。因此，代表性的免疫接种方案包括(1)皮下施用第一 FCV疫苗，之后口服施用第二FCV疫苗；(2)相继皮下施用第一和第 三FCV疫苗，之后口服施用第二FCV疫苗；和(3)皮下施用第一FCV 疫苗，之后相继口服施用第二和第三FCV疫苗。

如上所述，第一疫苗通过胃肠外途径(例如皮下)施用，第二疫苗 通过口服或口鼻施用，并且任选的第三疫苗可以通过胃肠外途径、口 服或口鼻施用。可以使用任何装置施用这些疫苗，包括注射器、滴管、 无针头注射装置等等。对于口鼻施用，装有套管的注射器可用于将疫 苗滴入猫的鼻子和嘴。

该方法可以使用能够在猫中诱导抗FCV的免疫应答的任何疫苗， 只要可以使第一疫苗适应于胃肠外施用而使第二疫苗适应于口服或口 鼻施用即可。如上所述，使任选的第三疫苗适应于胃肠外、经口或口 鼻途径施用。第一、第二和任选的第三疫苗可以是相同或不同的并且 各自可以独立地包含来源于一种或多种FCV株的一种或多种抗原。因 此有用的疫苗包括活的病毒疫苗、修饰的活病毒疫苗、和灭活的病毒 疫苗。活的和修饰的活的FCV疫苗包含在猫中不造成疾病并且已经以 非毒性形式分离或者已经使用熟知方法(包括在适宜的细胞系中连续 传代或者暴露于紫外线或者化学诱变剂)而减毒的FCV株。灭活的或死 的FCV疫苗包含已经通过已知方法，包括利用福尔马林、β-丙内酯 (BPL)或者BEI等进行处理而灭活的FCV株。示例性疫苗包括含有选自 FCV-F9、FCV-M8、FCV-255、FCV-2280、FCV-21、FCV-49、FCV-26391-4 等的单独的或任何组合的非毒性株的那些疫苗。

其它有用的来源于一种或多种FCV株的疫苗包括重组疫苗和DNA 疫苗(即，亚单位疫苗)。重组疫苗包括重组病毒载体，每一个均含有 编码来源于FCV株的抗原的核酸。此类载体可以通过将编码源于FCV 株的抗原(例如衣壳蛋白)的cDNA插入非毒性病毒(包括疱疹病毒、痘 病毒、腺病毒等的株系)的基因组中而制备。对于病毒载体，该cDNA 在抗原编码序列5’末端与真核转录启动子可操作地连接，并在抗原 编码序列的3’末端与真核终止信号和poly(A)信号可操作地连接，由 此该转录启动子和终止序列可以调节该抗原的表达。有用的转录启动 子包括Rous肉瘤病毒长末端重复启动子(RSV-LTR)、巨细胞病毒(CMV) 主要立即早期启动子、猿猴空泡病毒40(SV40)T抗原启动子，和诱 导型启动子，例如金属硫蛋白启动子。对于重组FCV疫苗的讨论，参 见Wardley等的美国专利号5,716,822，在此完整地并入作为参考。

DNA疫苗包括具有编码FCV抗原例如FCV衣壳蛋白或其特异的免 疫原性片段的核酸序列的DNA分子(例如质粒)，其中所述抗原在猫中 引起抗FCV的免疫应答。该核酸编码序列与使得该DNA能够在其接种 入猫细胞中时实现表达的转录启动子可操作地连接。有用的启动子包 括RSV-LTR启动子、CMV主要立即早期启动子、和SV40 T抗原启动子。 此外，该核酸还可以在编码该FCV抗原的序列的终止密码子位置或附 近位置与包含转录终止信号和poly(A)识别信号的核酸片段可操作地 连接。对于DNA疫苗的讨论，参见美国专利号5,580,859、美国专利 号5,589,466和美国专利号5,703,055(Felgner等)。

其它有用的疫苗包括含有一种或多种亚单位抗原，例如FCV衣壳 蛋白或该衣壳蛋白的免疫原性片段的疫苗，其中所述抗原已经得以分 离和纯化。该亚单位抗原可以在能够通过上述方法体外产生该抗原的 重组表达载体中产生。所得抗原随后进行分离和纯化。有用的表达载 体包括各种微生物，包括细菌、酵母和真菌，以及真核生物，例如哺 乳动物和昆虫细胞。其它有用的表达载体包括病毒，例如腺病毒、痘 病毒、疱疹病毒、Semliki森林病毒、杆状病毒、噬菌体、Sindbis 病毒、Sendai病毒等。FCV亚单位抗原在微生物中的表达使得可以使 用商业规模的发酵技术生产该抗原性蛋白。可以使用各种方法分离和 纯化该抗原，包括凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析、离心等。

这些疫苗中的一种或多种还可以含有用于免疫猫以抵抗一种或多 种FCV之外的病原体的抗原，其中所述病原体包括猫疱疹病毒、猫白 血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫全白细胞减少症病毒和猫衣原体。

疫苗的其它成分可以包括药学上可接受的赋形剂，包括载体、溶 剂和稀释剂、等渗剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、免疫调节剂(例如， 白介素、干扰素和其它细胞因子)、血管收缩剂、抗细菌剂、抗真菌剂 等。典型的载体、溶剂和稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油 等。代表性等渗剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖 等。有用的稳定剂包括明胶、白蛋白等。

疫苗还可以包括一种或多种增强对抗原的免疫应答的佐剂。代表 性佐剂包括基于油的佐剂，例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、基 于霉菌酸(mycolate)的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)，细菌脂多 糖、肽聚糖(即，胞壁质、粘肽或糖蛋白例如N-Opaca、胞壁酰二肽或 其类似物)、蛋白聚糖(例如，提取自肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella  pneumoniae))、链球菌制品(例如OK432)、(例如，01K2)、 Iscoms(例如，见欧洲专利申请号EP 109 942、EP 180 564和EP 231  039)、氢氧化铝、皂苷、二乙基氨基乙基-葡聚糖、中性油(例如， miglyol)、植物油(例如花生油)、脂质体、多元醇类。其它 佐剂包括RI BI佐剂系统、明矾、氢氧化铝凝胶、胆固醇、水包油乳剂、 油包水乳剂、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron， Emeryvi1le CA)、佐剂、皂苷、Quil A、QS-21(Cambridge  Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals， Inc.，Birmingham，AL)或其它皂苷级分、单磷酰脂A、Avridine脂- 胺佐剂、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的热不稳定性肠毒素(重组 的或者其它形式)、霍乱毒素、或胞壁酰二肽等等。

FCV疫苗剂量的大小范围典型为大约1mL至大约2mL，包括1mL 和2mL。每一剂均含有治疗有效量的所述FCV抗原(一种或多种)，其 中该有效量可以随着猫的年龄和总体状况、施用途径、FCV抗原的性 质及其它因素而变。对于含有修饰的活病毒或减毒的病毒的疫苗，治 疗有效剂量一般为大约10⁶ TCID₅₀至大约10⁸ TCID₅₀(包括10⁶ TCID₅₀和10⁸ TCID₅₀在内)。对于含有亚单位抗原，例如FCV衣壳蛋白的疫苗， 治疗有效剂量一般为大约10μg至大约100μg(包括10μg和100μg 在内)。可以对疫苗的其它成分进行调整以修饰疫苗的物理和化学性 质。例如，佐剂典型地包含1mL剂量大约25μg至大约1000μg(包括 25μg和1000μg在内)。类似地，抗生素典型地包含1mL剂量大约1 μg至大约60μg(包括1μg和60μg在内)。

FCV疫苗可以根据施用途径、储存要求等因素以各种形式提供。 例如，可以将疫苗制备成适于在注射器、滴管等中使用的无菌水溶液 或分散体，或者可以制备成可以在用前于盐水、HEPES缓冲液等中复 水的冻干的粉末。

第2部分实施例和表

以下实施例旨在举例说明而非限制，并代表本发明的几个特定的 实施方案。

实施例2-1.使用4和的皮下/口服疫苗 接种方案

4-5月龄的家养短毛猫用4(Pfizer Inc.；修饰的活 猫鼻气管炎病毒[FHV]、杯状病毒[FCV]、全白细胞减少症病毒[FP]和 鹦鹉热衣原体)、用(Fort Dodge；死的FHV、FCV、FP 和鹦鹉热衣原体)、或用无菌稀释剂(对照组)免疫接种。所评价的免疫 接种方案包括：最初的皮下接种之后于第21天和第42天皮下加强 (SQ/SQ/SQ)；最初的皮下接种之后于第21天和第42天两次口服加强 免疫(SQ/口服/口服)；或者最初皮下接种之后于第21天第二次皮下接 种及第42天口服加强。所有剂量均为1ml。口服接种通过将疫苗施用 至口中而实现。于第99天，用大约3.5ml强毒性系统性FCV-33585(4.8 log的TCID₅₀/ml)攻击所有的猫。该攻击通过在罐状猫粮中施用该剂量 的大约3ml并通过鼻滴注0.05ml而进行。攻击后持续14天监测所有 猫的疾病临床征候。将攻击后表现出与杯状病毒发病相一致的严重临 床征候的猫处安乐死。

如表2-1所示，通过该SQ/口服/口服方案接种的组具有仅10％的 死亡率，而对照组具有90％死亡率。通过该SQ/SQ/SQ方案接种的组 具有50％死亡率，而通过SQ/SQ/口服方案接种的组具有20％死亡率。 这些结果提示，SQ接种后进行口服加强显著地增强4免疫 接种抗毒性FCV攻击的效力。当口服接种作为接种方案的一部分时不 仅死亡率从50％(SQ/SQ/SQ)降低至10％(SQ/口服/口服)或20％ (SQ/SQ/口服)，而且如表2-2所示，临床征候例如皮肤损伤(SL)、食 欲不振(I A)、抑郁(DP)、口腔溃疡(OU)、跛足(LN)、打喷嚏(SZ)、鼻 排出物(ND)、和泪汪汪的眼(WE)的严重程度也降低。

表2-1.在免疫接种后被强毒性FCV-33585攻击的猫的死亡率(实 施例2-1)

表2-2.免疫接种和随后FCV-33585攻击后的临床症状(％动物) (实施例2-1)

实施例2-2.SQ/口服免疫接种后平均FCV血清中和滴度

在第0、21、42、63、98和113研究日自实施例2-1的猫收集血 液样品，并在血清中和(SN)试验中评价它们中和FCV的能力。血清样 品1∶8稀释，之后在600μl体积中2倍系列稀释至1：16384(总共12 次稀释)。将600μl中具有50-50 0TCID₅₀/ml滴度的猫杯状病毒与稀 释的血清样品混合，室温温育45分钟。然后，按一式四份将每种稀释 的样品各200μl转移至接种有Crandel猫肾(CrFK)细胞的96孔板的 各孔中。板子在37℃、5％CO₂下温育6天，在此时间测定终点中和滴 度。施用Spearman-Karber的方法计算血清中和(SN)滴度和攻击病毒 的返回滴定滴度。见C.Spearman，Brit.J.Psychol.2：227-242 (1908)和G.Karber，Arch.Exp.Path.Pharmak.162：480-487 (1931)。如表2-3所示，通过SQ/口服/口服或SQ/SQ/口服接种方案施 用的4具有显著更高的FCV SN滴度。这些数据与实施例 2-1中所述的死亡率显著降低相关。

表2-3.在不同研究日的平均FCV SN(血清中和)滴度(实施例 2-2)

*免疫接种后第0天、第21天、第42天、第63天、第98天和第 133天测量的。

实施例2-3.4和的SQ/口服施用的抗猫 全白细胞减少症病毒的效力

还分析来自实施例2-1的猫的血清样品的平均FP滴度。如表2-4 所示，所有的猫均在研究开始时为血清反应阴性。随后，在取样间隔 期间(第21和42天)，对照组的平均滴度保持在1。然而，其它4个 接种组的平均滴度显著地增加。

表2-4.针对猫全白细胞减少症病毒的平均血清抗体滴度(实施 例2-3)

*免疫接种后第0天、第21天和第42天测量的。

实施例2-4.通过各种施用途径免疫接种4的猫的临 床症状

通过将液滴滴注入动物鼻孔，进行4的口鼻(ON)施用。 如表2-5所示，6-7月龄的猫，每组10只(T1，T2，T3)，按照表2-5 所示方案接种并于第21天进行加强：皮下接种和加强(SQ/SQ)；皮下 接种和口鼻加强(SQ/ON)；或者口鼻接种和加强(ON/ON)。疫苗于颈右 侧皮下施用(1mL)；口鼻施用通过将0.5ml疫苗递送入每个鼻孔进行。 于第1天开始，观察所有猫每日的总体健康情况。

表2-5.通过不同施用途径接种4的猫的临床症状(实 施例2-4)

如表2-5所示，接受2次口鼻免疫接种的猫具有高水平的临床症 状，包括鼻溃疡(NU)、口腔溃疡(OU)、持续打喷嚏(SZ)、鼻排出物(ND)、 泪汪汪的眼(WE)和短暂的食欲不振(IA)。然而，通过SQ/ON方案免疫 接种的猫比ON/ON免疫接种的猫表现出较少的临床症状，没有鼻溃疡、 口腔溃疡、鼻排出物(ND)或泪汪汪的眼的迹象。而且，SQ/ON组的个 体比ON/ON组的猫表现出较少的喷嚏。SQ/ON组的安全谱与SQ/SQ组 的相似。

实施例2-5.不同免疫接种途径对4抗原的血清学应 答的影响

分析在实施例2-4所述研究中入选的猫的血清样品对于 4疫苗中存在的各种病毒抗原的血清学反应性。在研究的 第0、21和42天测定对FCV、FHV和FP的平均血清中和抗体滴度。如 表2-6所示，所有三种免疫接种方案均导致对FP的强免疫应答。对于 FHV的免疫应答由于该试验的困难而几乎检测不到。然而，抗FCV的 血清中和滴度在ON/ON和SQ/ON组比SQ/SQ组显著高。这些结果提示 ON/ON和SQ/ON组的猫将获得抵抗毒性FCV攻击的保护作用，而SQ/SQ 组则可能不能获得该保护作用。

表2-6.通过不同途径免疫接种4的猫的血清学应答 (实施例2-5)

*于接种后第0天、第21天和第42天测量。

实施例2-6.对通过SQ或ON途径施用的FCV-F9的血清中和滴度

通过SQ或ON，使用4中存在的FCV-F9抗原免疫接种 猫，每组6只猫。最初免疫接种后3周，所有猫使用相同抗原通过与 之前相同的途径进行加强免疫。所有剂量均为1ml。加强免疫后3周 收集血清样品。如表2-7所示，测定这些样品针对一组26种FCV株的 血清中和滴度。选用于该组的FCV株是基于遗传多样性(按照它们的衣 壳高变区的序列所确定的)以及地理分布而选择的。此外，还考虑每株 的毒性表型。来自ON免疫接种F9的猫的血清样品，与来自SQ免疫接 种的猫相比，在该组26个成员中中和更多的FCV株。使用23作为中 和滴度的截断值，ON免疫接种导致该组26％的成员具有等于或高于该 截断值的滴度，而SQ免疫接种导致仅16％符合该标准。对于15的滴 度截断值，ON免疫接种产生32％的组成员等于或高于该截断值；SQ 产生仅17％。

表2-7.对于FCV-F9的SQ与ON产生的血清抗一组26种FCV病 毒的血清交叉中和滴度(实施例2-6)

*≥23的中和滴度作为截断值；或者≥15的中和滴度作为截断值

实施例2-7.免疫接种两剂4或3成分以 及修饰的活FCV-21的猫的死亡率和临床得分

给约8周龄的家养短毛猫施用含有修饰的活猫鼻气管炎病毒 (FHV)、全白细胞减少症病毒(FP)、鹦鹉热衣原体，以及(1)FCV-F9 (4或3)、(2)FCV-F9和FCV-21(4加FCV-21或3加FCV-21)或(3)FCV-21(4A或3A)的疫苗。免疫接种方案包括：初次皮下免疫接种， 之后在第21天皮下加强(SQ/SQ)；初次皮下免疫接种，之后在第21 天一次口服加强免疫(SQ/口服)；或初次口服免疫接种，之后在第 21天进行第2次口服免疫接种(口服/口服)。不同给药方案中的每 只猫(T1至T10组，每组10只猫)各接受1ml疫苗。口服免疫接种通 过将疫苗施用于口中而实现。在第42天，所有猫施用大约1ml强毒性 系统性FCV-33585(3log的TCID₅₀/ml)进行攻击。攻击后持续14天， 监测所有猫的疾病临床征候，包括升高的温度、结膜炎浆液状排出物、 结膜炎含粘液脓性排出物、鼻炎浆液状排出物、鼻炎含粘液脓性排出 物、打喷嚏、可听见的罗音、咳嗽、张嘴呼吸、厌食、脱水、＜4mm的 一个口腔溃疡、多个口腔溃疡、＞4mm的口腔溃疡、过量分泌唾液、非 流血性表面溃疡、流血性表面溃疡。攻击后表现出与杯状病毒发病一 致的严重临床征候的猫被处安乐死。

如表2-8所示，当与SQ/SQ免疫接种相比时，对于4 接种的猫，SQ/口服免疫接种方案将死亡率由44％降低至10％并且将 平均临床得分由12改善至5.5。而且，向3和向 4添加FCV-21株导致攻击后无死亡。用FCV-21株置换 3及4中的FCV-F9株导致与含有FCV-F9及 FCV-21两者的疫苗相似的效力，甚至是在口服/口服免疫接种方案中 也是如此。

表2-8.免疫接种2剂带有或不带有FCV-F9和/或FCV-21的 FELOCELL 3或4后以毒性FCV-33585攻击的猫的死亡率(实施例2-7)

FELOCELL 4A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 4

FELOCELL 3A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 3

实施例2-8.以4成分和修饰的活FCV-21进行3剂 免疫接种的猫的死亡率和临床得分

给大约8周龄的家养短毛猫施用含有修饰的活猫鼻气管炎病毒 (FHV)、全白细胞减少症病毒(FP)、鹦鹉热衣原体，以及(1)FCV-F9 (4)、(2)FCV-F9和FCV-21(4A)或(3)FCV-21 (4B)的疫苗。在每一种情况下，给猫进行最初的皮下免 疫接种并随后于第21天和第42天进行相继的口服施用(SQ/口服/口 服)。不同给药方案中的每只猫(T1至T4组，每组10只猫)接受1mL 疫苗。口服接种通过将疫苗施用于口中而实现。第63天，所有猫施用 大约1ml的毒性系统性FCV-33585(3log的TCID₅₀/ml)攻击。攻击后 持续14天，监测所有猫的如实施例2-7所述的疾病临床征候。将攻击 后表现出与杯状病毒发病相一致的严重临床征候的猫处于安乐死。如 表2-9所示，按照攻击后死亡率和临床得分测量的，此三剂量方案的 效力与实施例2-7中所述的2剂量方案的效力相当。

表2-9.在使用FCV-F9和/或FCV-F21进行3剂量免疫接种后被 毒性FCV-33585攻击的猫的死亡率(实施例2-8)

FELOCELL 4A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 4

实施例2-9.来自以带有和不带有FCV-21的FELOCELL 4成分免 疫接种的猫的血清的交叉中和分析

对在实施例2-7所述研究中的每只猫，在第二次免疫接种后但在 攻击之前，收集其血清样品。样品56℃ 30分钟热处理，并且如之前 实施例1-10中所述针对26种FCV株(表1-6)之每一种的血清中和试 验之每一种的血清中和试验中进行评价。

使用＞23和＞15的截断滴度分析血清中和数据，并计算两个截断滴 度的平均值(Ave)。结果显示在表2-10中。该数据说明，无论施用途 径是SQ/SQ还是SQ/口服，FELOCELL 4(含有FCV-F9)的交叉中和谱保 持不变。然而，添加FCV-21后，当疫苗以SQ/SQ或SQ/口服方式施用 时，该交叉中和谱显著增强。而且，对于FELOCELL 4A(含有FCV-21 但不含有FCV-F9)，对于SQ/SQ、SQ/口服以及甚至口服/口服免疫接种 途径，该交叉中和谱均得以增强。

*FELOCELL 4A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL 4

**FELOCELL 3A：无FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL3

在表2-11中，所评价的免疫接种方案包括最初的皮下接种以及之 后于第21天和第42天的两次口服加强免疫(SQ/口服/口服)。结果说 明，在FELOCELL 4中添加FCV-21，无论有或无FCV-F9，都导致显著 更宽的交叉中和谱(增加大约40％)。

*FELOCELL 4A：无FCV-F9但有FCV-21的FELOCELL 4

我们还公开了我们的如下发现：对于本文描述的与FCV株FCV-21、 FCV-49和FCV 26391-4相关的肽、蛋白和DNA形式的疫苗，可以首先 进行口服或口鼻(ON)施用之后，进行第二次口服或口鼻施用，而没有 以上在实施例2-4和表2-5中提及的先前公开的副作用。

应当注意，在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文中清楚 地另行说明，否则单数形式的冠词例如“a”、“an”和“the”，可 以指一个对象或者多个对象。因此，例如，提及含有“化合物”的组 合物可以包括单一一种化合物或者两种或更多种化合物。

应当理解，上述实施例和描述旨在举例说明而非限制。许多实施 方案对于本领域技术人员而言在阅读以上描述后将是明显的。因此， 本发明范围应当参考所附权利要求以及这些权利要求有权要求的整个 等同范围来确定。所有文章和参考文献，包括专利、专利申请及出版 物，的公开为了所有的目的均完整地并入此处作为参考。

在表2-1至表2-9中，4、Felocell 4或FELOCELL 4 或后面有数字“3”的这些词是Felocell的变体疫苗，Pfizer拥有名 称Felocell的任何变体。提及Felocell 4A指无FCV-F9的Felocell 4，提及Felocell 3A指无FCV-F9的Felocell 3。注意，这些研究中 使用的实际抗原并非来自该商业产品，相反地这些抗原仅为研究目的 而小批地制备，但是制备方法和该商业产品的制备方法相同。

鉴于本公开，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以无需 过度实验即可制备和实施。尽管本发明组合物和方法以优选实施方案的 形式已经进行描述，但是对于本领域技术人员而言明显地可以对这些组 合物和/或方法以及本文描述的该方法的步骤或者步骤的顺序进行改变 而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显地，可以将本文 描述的药剂替代为化学及生理学上相关的某些药剂而仍获得相同或相似 的结果。本领域技术人员明了的所有这些相似的替代物和修饰被认为落 入所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。

编号的本发明描述。其它描述和实施例。1.免疫猫以抵抗猫杯状 病毒(FCV)的方法，该方法包括给猫施用治疗有效量的第一和第二疫 苗，其中第一和第二疫苗适应于在猫中诱导抗FCV免疫应答，第一疫 苗通过胃肠外途径施用而第二疫苗通过口服或者口鼻途径施用，并且 第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是3至120天(包括3 和120天)的整数，也描述N为大约3周和大约2-4周。2.权利要求 1的方法，其中所述疫苗独立地包含活病毒疫苗、修饰的活病毒疫苗、 灭活病毒疫苗、重组疫苗、DNA疫苗或亚单位抗原疫苗中的任一种或 其组合。3.权利要求1的方法，其中至少一种疫苗包括一种或多种 FCV株。4.权利要求3的方法，其中所述一种或多种FCV株包括F9 或FCV-21或F9和FCV-21。5.权利要求1的方法，其中所述疫苗是 相同的。6.权利要求1的方法，其中至少一种疫苗也适应于诱导抗一 种或多种选自疱疹病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫全白细 胞减少症病毒和猫衣原体的病原体的免疫应答。7.权利要求1的方 法，其中第一疫苗通过皮下施用。8.权利要求1的方法，其中第二疫 苗经口或口鼻施用。9.权利要求1的方法，其中第二疫苗或随后的疫 苗在猫出现大约1∶6或更高的FCV血清中和滴度之后施用。10.权利要 求1至9之任一项的方法，还包括给猫施用治疗有效量的第三疫苗， 其中该第三疫苗适应于在猫中诱导抗FCV的免疫应答并通过胃肠外、 口服或口鼻途径在第一或第二疫苗施用后M天施用，其中M是1至 120(包括1和120)的整数。11.权利要求10的方法，其中第三疫苗 通过皮下途径施用。12.免疫猫以抵抗猫杯状病毒(FCV)的方法，该方 法包括给猫施用治疗有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗 适应于在猫中诱导抗FCV免疫应答，其中第一疫苗通过口服或口鼻施 用而第二疫苗通过口服或口鼻施用，并且第二疫苗在第一疫苗施用后 N天施用，其中N是3至120(包括3和120)的整数，也规定N是大约 3周和大约2-4周。13.权利要求12的方法，其中FCV株选自FCV-21、 FCV-49、FCV 26391-4。14.免疫动物的方法，包括给动物施用治疗 有效量的第一和第二疫苗以及任选的第三疫苗，其中第一和第二疫苗 以及任何的第三疫苗适应于诱导免疫应答，并且第一疫苗通过胃肠外 或口服施用，第二疫苗通过口服或口鼻施用，第二和任何的第三疫苗 在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在内的3至120 的整数，也规定N是大约3周和大约2-4周，并且该方法可以包括任 选的该疫苗的每年一次加强施用，包括大约1年的M期。

第3部分

该部分提供免疫动物以抵抗猫细小病毒(FPV)和猫疱疹病毒(FHV) 的方法和组合物

此处描述使用疫苗治疗和免疫动物，尤其是猫以抵抗由猫杯状病 毒(FCV)引起的猫呼吸道疾病、由猫细小病毒(FPV)引起的猫全白细胞 减少症、由猫疱疹病毒(FHV)(也称作猫鼻气管炎病毒)引起的猫病毒 性鼻气管炎的方法和材料。以下描述新的疫苗组合，该组合当以描述 的方式给予猫时允许有效的单次口服和口服/口服及皮下/口服递送 FPV和/或FHV疫苗。

单次口服意味着可以赋予被免疫接种的动物有效的保护作用的单次 口服递送。口服/口服指给予两次口服递送，类似于以上第2部分中的描 述，即，口服后一段时间然后通过口服途径再给一剂，而皮下/口服是通 过皮下给予第一剂之后一段时间然后通过口服途径再给一剂。

此处描述修饰的活FPV和/或修饰的活FHV与修饰的活衣原体疫 苗、或修饰的活衣原体疫苗的任何成分，例如生长培养基、细胞裂解 物或整个细胞，衣原体本身的任何成分的联合的递送。衣原体也称作 猫衣原体或者猫鹦鹉热衣原体或FCp。

当修饰的活FPV独自或者与修饰的活FCV或修饰的活FHV疫苗联 合给予时，该FPV在以口服/口服方式递送时是无效的，并且在使用 SQ/口服施用途径时表现出降低的SN滴度。类似地，当修饰的活FHV 独自或者与修饰的活FCV或者与修饰的活FPV疫苗联合给予时，该FHV 在以口服/口服方式递送时是无效的，并且在使用SQ/口服施用途径时 表现出降低的效力。只有当FPV和/或FHV与修饰的活衣原体疫苗联合 给予时，通过皮下/口服或口服/口服途径递送该联合疫苗才可以提供 充足的抗FPV和/或FHV的保护作用。

根据上述提供以下实施例。以下实施例旨在举例说明而非限制， 并代表本发明的几个具体的实施方案。

实施例3-1(纯理论的).使用FPV和衣原体的皮下/口服免疫接 种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV和衣原体(或 修饰的活衣原体疫苗的任何成分)。该修饰的活疫苗可以通过皮下/口 服递送。

实施例3-2(纯理论的).使用FPV和衣原体的口服/口服免疫接 种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV和衣原体(或 修饰的活衣原体疫苗的任何成分)。该修饰的活疫苗可以通过口服/口 服递送。

实施例3-3(纯理论的).使用FPV、FHV和衣原体的皮下/口服免 疫接种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV、FHV 和衣原体(或修饰的活衣原体疫苗的任何成分)。该修饰的活疫苗可以 通过皮下/口服递送。

实施例3-4(纯理论的).使用FPV、FHV和衣原体的口服/口服免 疫接种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV、FHV 和衣原体(或修饰的活衣原体疫苗的任何成分)。该修饰的活疫苗可以 通过口服/口服递送。

实施例3-5(纯理论的).使用FPV、FHV、FCV和衣原体的皮下/ 口服免疫接种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV、 FHV、FCV和衣原体(或修饰的活衣原体疫苗的任何成分)。该修饰的活 疫苗可以通过口服/口服递送(表3-1)。

实施例3-6(实际的).使用FPV、FHV、FCV和衣原体的口服/口 服免疫接种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV、 FHV、FCV和衣原体(或修饰的活衣原体疫苗的任何成分)。该修饰的活 疫苗可以通过口服/口服递送。见表3-1。

约8周龄家养短毛猫用FELOCELL 4A和3A成分(含有修饰的活猫 鼻气管炎病毒[FHV]、杯状病毒[FCV-21]、全白细胞减少症病毒[FPV] 和鹦鹉热衣原体[FCp])免疫接种。所评价的接种方案包括：最初皮下 接种之后于第21天皮下加强免疫(SQ/SQ)；最初皮下接种之后于第21 天一次口服加强免疫(SQ/口服)；或者最初口服接种之后于第21天第 二次口服接种。口服接种通过将疫苗施用于口中来实现。第二次免疫 接种后从每只猫收集血清样品，并56℃热处理30分钟。样品在针对 FPV的血清中和试验中评价。

FELOCELL 4A：FPV/FHV/FCV-21/FCp

FELOCELL 3A：FPV/FHV/FCV-21

表3-1的结果提示，如以前文献中报道的，猫对FPV抗原产生极 微弱的应答。(口服施用减毒的猫全白细胞减少症病毒后无免疫应答。 Schults RD，Scott FW，Infect Immun.1973，Apr 7(4)：547-9)。 然而，存在衣原体或者与衣原体疫苗有关的任何成分时，该FPV SN 滴度高得多，说明体内抗FPV攻击的效力。而且，我们观察到不仅 SQ/SQ、SQ/口服而且口服/口服组均具有增强的FPV免疫原性。

实施例3-7(实际的).使用FPV、FHV、FCV的口服/口服免疫接 种方案。在带有或不带有其它成分的联合疫苗中提供FPV、FHV和FCV。 该修饰的活疫苗可以口服/口服递送。见表3-2。

约8周龄家养短毛猫用FELOCELL3A(含有修饰的活猫鼻气管炎病 毒[FHV]、杯状病毒[FCV-21]和全白细胞减少症病毒[FPV])免疫接种。 所评价的接种方案包括：最初皮下接种之后于第21天皮下加强 (SQ/SQ)；最初皮下接种之后于第21天一次口服加强免疫(SQ/口服)； 或者最初口服接种之后于第21天第二次口服接种。口服免疫接种通过 将疫苗施用于口中来实现。第一次和第二次免疫接种后从每只猫收集 血清样品，并56℃热处理30分钟。在针对FPV的血清中和试验中分 析这些样品。

表3-2的结果说明，存在于FELOCELL 3A疫苗中的FPV抗原当通 过口服/口服给予时诱导了极小的免疫应答(与表3-1的结果一致)。然 而，当这些疫苗以SQ/SQ或SQ/口服给予时，观察到高FPV SN滴度， 说明了体内效力。

编号的本发明描述。其它描述和实施例。以下注意，FCV是猫杯 状病毒，FPV是猫细小病毒(也称作全白细胞减少症或FPL)，以及最后 FHV是猫疱疹病毒。1.免疫原性组合物，包含在一个施用剂量中施用 的修饰的活FPV和修饰的活衣原体两者。2.疫苗，包含在两个分开的 单施用剂量中递送给猫的修饰的活FPV和修饰的活衣原体，所述的两 个单施用剂量通过口服或口鼻途径递送并且在时间上间隔3至120天， 或者大约3周或大约2周。3.免疫猫以抵抗FPV的方法，该方法包括 给猫施用治疗有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于 在猫中诱导抗FPV的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用而第二 疫苗通过口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其 中N是包括3和120在内的3至120的整数，或者其中N是大约3周 或其中N是大约2周，其中所述第一和第二疫苗由修饰的活FPV和修 饰的活衣原体组成。4.免疫原性组合物，包含在单个施用剂量中施用 的修饰的活FHV和修饰的活衣原体。5.疫苗，包含在两个分开的单施 用剂量中递送给猫的修饰的活FHV和修饰的活衣原体，所述两个单施 用剂量通过口服或口鼻途径施用，并且在时间上间隔3至120天，或 者大约3周或大约2周。6.免疫猫以抵抗FHV的方法，该方法包括给 猫施用治疗有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于在 猫中诱导抗FHV的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用并且第二 疫苗通过口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其 中N是包括3和120在内的3至120的整数，或者其中N是大约3周 或其中N是大约2周，其中所述第一和第二疫苗由修饰的活FHV和修 饰的活衣原体组成。7.免疫原性组合物，包含在单个施用剂量中施用 的修饰的活FCV和修饰的活衣原体。8.疫苗，包含在两个分开的单施 用剂量中递送给猫的修饰的活FCV和修饰的活衣原体，所述两个单施 用剂量通过口服或口鼻途径施用，并且在时间上间隔3至120天，或 者大约3周或大约2周。9.免疫猫以抵抗FCV的方法，该方法包括给 猫施用治疗有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于在 猫中诱导抗FCV的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用并且第二 疫苗通过口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其 中N是包括3和120在内的3至120的整数，或者其中N是大约3周 或其中N是大约2周，其中所述第一和第二疫苗由修饰的活FCV和修 饰的活衣原体组成。10.免疫原性组合物，包含在单个施用剂量中施 用的修饰的活FPV、修饰的活FHV和修饰的活衣原体。11.疫苗，包 含在两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的活FPV、修饰的活FHV 和修饰的活衣原体，所述两个单施用剂量通过口服或口鼻途径施用， 并且在时间上间隔3至120天，或者大约3周或大约2周。12.同时 免疫猫以抵抗FPV和FHV的方法，该方法包括给猫施用治疗有效量的 第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于在猫中诱导抗FPV和FHV 的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用并且第二疫苗通过口服或 口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和 120在内的3至120的整数，或者其中N是大约3周或其中N是大约2 周，其中所述第一和第二疫苗包含修饰的活FPV、修饰的活FHV和修 饰的活衣原体。13.免疫原性组合物，包含在单个施用剂量中施用的 修饰的活FPV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体。14.疫苗，包含在 两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的活FPV、修饰的活FCV和 修饰的活衣原体，所述两个单施用剂量通过口服或口鼻途径施用，并 且在时间上间隔3至120天，或者大约3周或大约2周。15.同时免 疫猫以抵抗FPV和FCV的方法，该方法包括给猫施用治疗有效量的第 一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于在猫中诱导抗FPV和FHV 的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用并且第二疫苗通过口服或 口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和 120在内的3至120的整数，或者其中N是大约3周或其中N是大约2 周，其中所述第一和第二疫苗包含修饰的活FPV、修饰的活FHV和修 饰的活衣原体。16.免疫原性组合物，包含在单个施用剂量中施用的 修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体。17.疫苗，包含在 两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的活FHV、修饰的活FCV和 修饰的活衣原体，所述两个单施用剂量通过口服或口鼻途径施用，并 且在时间上间隔3至120天，或者大约3周或大约2周。18.同时免 疫猫以抵抗FHV和FCV的方法，该方法包括给猫施用治疗有效量的第 一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于在猫中诱导抗FHV和FCV 的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用并且第二疫苗通过口服或 口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和 120在内的3至120的整数，或者其中N是大约3周或其中N是大约2 周，其中所述第一和第二疫苗包含修饰的活FHV、修饰的活FCV和修 饰的活衣原体。19.免疫原性组合物，包含在单个施用剂量中施用的 修饰的活FPV、修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体。20.疫 苗，包含在两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的活FPV、修饰 的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体，所述两个单施用剂量通 过口服或口鼻途径施用，并且在时间上间隔3至120天，或者大约3 周或大约2周。21.同时免疫猫以抵抗FPV、FHV和FCV的方法，该方 法包括给猫施用治疗有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗 适应于在猫中诱导抗FPV的免疫应答，第一疫苗通过口服或口鼻施用 并且第二疫苗通过口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天 施用，其中N是包括1和120在内的1至120的整数，或者其中N是 大约3周或其中N是大约2周，其中所述第一和第二疫苗包含修饰的 活FPV、修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体。

本申请还包括如下按顺序编号的内容：

1.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-21衣壳蛋 白或分离的FCV-21衣壳蛋白。

2.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-21衣壳蛋 白或分离的FCV-21衣壳蛋白和药学上可接受的载体，其中所述衣壳蛋 白包含蛋白质序列(SEQ ID NO：13)和具有至少大约91.2％、95％和 99％同一性的序列；其中所述衣壳蛋白以有效产生免疫应答的量提供。

3.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的DNA疫苗，其包含编码FCV-21 衣壳蛋白或分离的FCV-21衣壳蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序 列(SEQ ID NO：12)和具有至少大约78.7％和79.2％的序列同一性和 允许保守替代的序列。

4.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-49衣壳蛋 白或分离的FCV-49衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包含来自FCV-49株 的蛋白质序列。

5.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的疫苗，其包含FCV-49衣壳蛋白 或分离的FCV-49衣壳蛋白和药学上可接受的载体，其中所述衣壳蛋白 包含蛋白质序列(SEQ ID NO：15)和具有至少大约92.7％、95％和99％ 同一性的序列；其中所述衣壳蛋白以有效产生免疫应答的量提供。

6.用于免疫猫以抵抗猫杯状病毒的DNA疫苗，其包含编码FCV-49 衣壳蛋白或分离的FCV-49衣壳蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序 列(SEQ ID NO：14)和具有至少大约78.9％，即，79.4％(78.9+0.5) 的序列同一性和允许保守替代的序列。

7.项目1-6之任一项的疫苗，其还包含以下的单独一项或任何组 合：其中该疫苗含有佐剂，其中该FCV成分是活的，其中该FCV成分 是减毒的，其中该FCV成分是灭活的，其中该疫苗可以包括至少一种 选自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280的其它猫杯状 病毒株。

8.免疫猫以抵抗猫杯状病毒(FCV)的方法，该方法包括给猫施用 治疗有效量的第一和第二疫苗，其中该第一和第二疫苗适应于在猫中 诱导抗FCV的免疫应答，该第一疫苗通过胃肠外施用且第二疫苗通过 口服或口鼻施用，该第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是 包括3和120在内的3至120的整数。

9.项目8的方法，其中所述疫苗独立地包含活病毒疫苗、修饰的 活病毒疫苗、灭活病毒疫苗、重组疫苗、DNA疫苗或亚单位抗原疫苗 中的任一种或其组合。

10.项目9的方法，其中所述疫苗中的至少一种包括一种或多种 FCV株。

11.项目10的方法，其中所述一种或多种FCV株包括F9或FCV-21 或F9和FCV-21。

12.免疫原性组合物，其包含在单个施用剂量中施用的修饰的活 FPV和修饰的活衣原体，和/或包含在单个施用剂量中施用的修饰的活 FHV和修饰的活衣原体，和/或包含在单个施用剂量中施用的修饰的活 FCV和修饰的活衣原体，和/或包含在单个施用剂量中施用的修饰的活 FPV、修饰的活FHV和修饰的活衣原体，和/或包含在单个施用剂量中 施用的修饰的活FPV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体，和/或包含在 单个施用剂量中施用的修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原 体，和/或包含在单个施用剂量中施用的修饰的活FPV、修饰的活FHV、 修饰的活FCV和修饰的活衣原体。

13.疫苗，其包含在两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的 活FPV和修饰的活衣原体，和/或包含在两个分开的单施用剂量中递送 给猫的修饰的活FHV和修饰的活衣原体，和/或包含在两个分开的单施 用剂量中递送给猫的修饰的活FCV和修饰的活衣原体，和/或包含在两 个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的活FPV、修饰的活FHV和修 饰的活衣原体，和/或包含在两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰 的活FPV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体，和/或包含在两个分开的 单施用剂量中递送给猫的修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣 原体，和/或包含在两个分开的单施用剂量中递送给猫的修饰的活 FPV、修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体，所述两个单施 用剂量通过口服或口鼻途径施用且时间上间隔3至120天。

14.免疫猫以抵抗FPV、FCV和/或FHV的方法，该方法包括给猫 施用治疗有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗适应于在猫 中诱导抗FPV和/或FCV和/或FHV的免疫应答，第一疫苗通过口服或 口鼻施用且第二疫苗通过口服或口鼻途径施用，第二疫苗在第一疫苗 施用后N天施用，其中N是包括3和120在内的3至120的整数，其 中所述第一和第二疫苗由如下组合物组成，所述组合物：

a)包含修饰的活FPV和修饰的活衣原体；和/或

b)包含修饰的活FHV和修饰的活衣原体；和/或

c)包含修饰的活FCV和修饰的活衣原体；和/或

d)包含修饰的活FPV、修饰的活FHV和修饰的活衣原体；和/或

e)包含修饰的活FPV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体；和/或

f)包含修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活衣原体；和/或

g)包含修饰的活FPV、修饰的活FHV、修饰的活FCV和修饰的活 衣原体，或其任何组合。

15.本文所述的用于治疗动物，尤其是猫的任何免疫原性组合物、 疫苗和方法。