环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法

技术领域

本发明涉及一种生物纳米检测技术，尤其涉及一种环介导等温扩增技术和核酸杂 交同步反应的方法，将环介导等温扩增过程、核酸杂交过程这两个分子生物学反应环节 合二为一，缩短为一个反应步骤。

背景技术

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是2000年由日本 科学家Notomi,T.首次在Nucleic Acids Research杂志上报道的一种新颖的恒温核酸扩增 方法，之后又不断改进并于2008年在杂志Nature Protocols上对其技术要点进行了系统 的归纳总结。环介导等温扩增技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物， 利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30－60分钟，即可完成核 酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等 过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特 点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖 任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

经过十几年的发展，环介导等温扩增技术已成熟完备，并被广泛应用于病原微生 物检测、食品安全、转基因物种检测、肿瘤诊断、胎儿性别鉴定、进出口快速诊断等多 个领域，其检测结果的可靠性得到了普遍认可。

核酸杂交技术是一种分子生物学的成熟标准技术，用于检测核酸分子（DNA或 RNA）的特定序列（靶序列）。先将核酸杂交探针（寡核苷酸序列）转移并固定到硝酸 纤维素膜、尼龙膜、或基因芯片上，核酸样本靶序列在聚合酶链式反应（PCR）的过程 中用放射性或非放射性物质标记，然后将核酸扩增产物与探针杂交。在杂交时，探针通 过碱基互补配对原则与靶序列结合，洗去未结合的游离核酸片段后，经放射自显影或显 色反应检测特异结合的核酸片段。

无论是硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上的核酸杂交反应，还是基因芯片上核酸杂交 过程，都是先将核酸样品在PCR反应体系下扩增一个小时左右，再将PCR产物与核酸 探针在杂交缓冲液中进行6小时或更长时间的杂交反应。很明显，这样的反应时间（≥ 7小时）比较长，不太适合于快速诊断的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，将环介导 等温扩增过程和核酸杂交过程合并的新方案，以解决传统的PCR扩增和核酸杂交时间过长 的缺陷。

本发明的目的在于提供一种环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法在HBV检 测的应用，将环介导等温扩增过程和核酸杂交过程合并的新方案，已解决传统的PCR扩增 和核酸杂交时间过长的缺陷。

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，包括

第一步：将核酸杂交探针标记在芯片的表面，

用无水甲苯稀释到1%（v/v）浓度的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）在室温条件下 处理芯片的表面（二氧化硅或玻璃）2小时，然后用无水甲苯清洗芯片洗表面3次；接着在 预定的杂交探针修饰区域滴加1%（v/v）浓度的戊二醛水溶液，室温放置1小时后用水洗涤 3次；随后将1μL浓度为14μM核酸杂交探针滴加在修饰区域，封闭后放置室温1小时；接 着在其表面滴加20mM甘氨酸水溶液，以封闭表面未与杂交探针发生反应的多余醛基，室 温放置1小时，最后用超纯水清洗表面3次，晾干残余水分即得。

第二步：环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应，

将25μL如下LAMP反应体系液滴加在基因芯片的探针修饰区域，封闭后，将芯片放 置在63℃的恒温箱中进行核酸扩增和核酸杂交，反应1小时之后用水清洗三次，去除未与 探针杂交结合的LAMP产物。

LAMP反应体系液由如下成分组成：

10×LAMP缓冲液（pH=8.8，25℃）由以下成分组成：200mM Tris-HCl、100mM KCl、 100mM(NH₄)₂SO₄、80mM MgSO₄和1%Triton X-100。

第三步：检测，

进行后续的放射性信号检测或是非放射性信号的化学显色检测。

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，应用于HBV的检测， 其所用的核酸杂交探针为Probe T，具有SEQ ID No.1所示的序列或其同源序列，并在 该序列的5’端连接5’-NH₂-(T)₁₅-的核酸序列。

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其所用的B3为SEQ ID  No.2所示的序列或其同源序列。

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其所用的F3为SEQ ID  No.3所示的序列或其同源序列。

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其所用的BIP为SEQ  ID No.4所示的序列或其同源序列。

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其所用的FIP为在SEQ  ID No.5所示的序列或其同源序列的5’端连接生物素的核酸。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，具有操作简单、反应时 间短、灵敏度高、试剂种类减少的特点，适合于基因芯片法对核酸样本的快速高灵敏诊断。

附图说明

图1为本发明技术方案的原理示意图；

图2为LAMP产物电泳图，其中“1”表示阴性对照，“2”表示阳性样本；

图3A为LAMP产物与核酸探针的阴性对照杂交结果扫描电镜图；

图3B为LAMP产物与核酸探针的阳性对照杂交结果扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方 案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和 范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明涉及分子生物学实验，若没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书（J.萨姆布 鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994）。该书及其后续出版版本是本领域 技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。此外， 根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒（Kit）所附带的操作手册的指导 下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如：基因测序、质粒测序和确定分子量等。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）。

使用LAMP引物设计程序PrimerExplorer V4针对HBV DNA的高度保守区域设计了如下 一套LAMP引物，包含了B3、F3、BIP(B1c-B2)和FIP(F1c-F2)，其中的FIP的5’修饰上了生 物素标记物。同时，针对LAMP核酸范围内高保守序列区设计一条核酸杂交探针Probe T。

本实施例的同步反应方法中所涉及的各个过程和分子如图1所示。图中“1”表示B3； “2”表示F3；“3”表示BIP；“4”表示FIP；“5”表示生物素；“6”表示磁性纳米颗粒； “7”表示链霉亲和素；“8”表示3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）；“9”表示戊二醛； “10”表示核酸杂交探针；“11”表示芯片表面；“12”表示LAMP反应过程；“13”表示 核酸杂交过程

B3:5'-cggggtttttcttgttgac-3'

F3:5'-tgaggcatagcagcaggat-3'

BIP:5'-tccccctagaaaattgagagaagtaatcctcacaataccacagag-3'

FIP:5'-生物素-tggccaaaattcgcagtcccaaaacgccgcagacacatc-3'

ProbeT:5'-NH₂-(T)₁₅-atcgctggatgtgtctgcggcgtttt-3'

按照本发明技术方案中的“第一步”所描述的方法将探针ProbeT固定在芯片的表面， 同时设置一个阴性对照，阴性对照区不固定任何探针。25μL的LAMP反应体系由如下成分 组成：

10×LAMP缓冲液（pH=8.8，25℃）由以下成分组成：200mM Tris-HCl、100mM KCl、 100mM(NH₄)₂SO₄、80mM MgSO₄和1%Triton X-100。

将以上反应液混合均匀后滴加在基因芯片的探针修饰区域，封闭后，将芯片放置在63 ℃的恒温箱中进行核酸扩增和核酸杂交，反应1小时之后用超纯水清洗三次，去除未与探 针杂交结合的LAMP产物（图2所示），然后再滴加表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米颗 粒（5μg·μL^-1），室温（～25℃）下静置作用15分钟，最后使用清洗液（5mM Tris-HCl(pH=7.5)， 0.5mM EDTA，1M NaCl）冲洗3次，晾干水分后，借助扫描电子显微镜观察到芯片表面（对 照组和实验组）的磁性纳米颗粒的结合情况（图3A和图3B所示）。

如图3A所示，阴性对照视野中未出现影像。如图3B所示，阳性对照视野中出现大量 的影像（图中箭头方向），表明检测到了HBV DNA。