棉花GhMATE1基因及其在改良棉花棕色纤维色泽中的应用

技术领域

本发明涉及一种改良棉花纤维色泽基因技术，尤其涉及一种棉花基因及其构建的植物表达双元载体并在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。

背景技术

天然彩色棉是一种棉纤维具有自然色彩的特殊类型棉花，因其具有独特的自然色彩，在纺织及加工过程中无需漂染，对人类和环境无污染、穿着舒适，特别适合制作贴身衣物，是真正的“生态”、“环保”棉，从而引起国内外棉花育种家和纺织、服装工业界的广泛关注，被誉为21世纪国际市场最具潜力的生态纺织品。中国彩色棉的研究与开发虽起步较迟，但发展很快。从1998年到2010年，中国天然彩色棉种植面积从每年1万亩扩大到每年20多万亩，皮棉产量从每年800吨增加到每年2万多吨，10年间，彩棉种植面积和皮棉产量分别增长了20倍和25倍。

彩色棉主要有棕色和绿色两大系列色彩，在彩色棉新品种选育方面，借助于常规育种技术，世界各国和我国一些育种单位纷纷开展研究并选育出一批彩色棉新品种，在一定程度上改善了彩色棉的品质和性状。国内各研究单位选育出的彩色棉品种有：新彩棉系列品种（1号至20号）、中棉所51、浙彩棉2号、苏彩杂1号等品种。在这些选育的品种中，主要是棕色棉系列品种在纺织、服装工业上得到了一定程度的应用。与白棉花相比，彩色棉品种依然存在着以下突出问题：纤维比强度不高，纤维长度偏短、衣分偏低，色素稳定性差，色彩单一，从而限制了棕色棉在纺织工业中的应用。因此，创新彩色棉的纤维色泽并提高棕色棉的纤维强度、纤维长度是关系到我国纺织工业和彩色棉产业发展兴衰成败的两个关键因素，也是广大棉花育种科研工作者面临的一个重要课题。

在自然界中，植物色素可分为光合色素（如叶绿素）和非光合色素（如类黄酮和类胡萝卜素)。研究表明，天然彩色棉纤维色素属于非光合色素，并且与棉纤维发育的特定时期有关。国内外学者通过对棕色棉纤维色素形成过程及生化特征本质的研究，初步认为存在以下2种推测：（1）Ryser、Xiao和詹等推测认为天然棕色棉纤维色素最初来源是位于液泡里的儿茶素衍化形成的原花色素（Proanthocyanidins），也称为缩合单宁（Condensed Tannins），并由缩合单宁接触空气氧化而形成具有棕色的醌类化合物；（2）赵等认为棕色棉纤维色素属于类黄酮化合物。而且，Xiao和詹的实验都证实棕色棉纤维色素的前体物质属于原花色素（缩合单宁）。詹等对棕色棉、白棉纤维和种皮中分布的色素含量进行了分析，研究认为：决定纤维颜色的主要原因是色素在纤维和种皮之间的分配比例。棉纤维是由种皮细胞分化而来，棉纤维的形成过程与种皮细胞的发育关系密切。拟南芥、棉花同属于双子叶植物，了解拟南芥种皮色素的合成代谢及调控途径对于揭示棉花种皮棕色素、棉纤维棕色素发育、纤维与色素的共沉积分子机理具有重要理论意义。

拟南芥种皮色素的合成代谢途径受到多种基因的调控，属于植物次生代谢。通过对拟南芥种皮Transparent testa系列突变体的研究表明：苯丙氨酸（Phenylpropanoid）是形成缩合单宁的最初氨基酸，它在一系列酶的催化作用下，最终形成无色的缩合单宁，再经空气氧化而呈现出种皮的棕色特征。其中，TT4编码查尔酮合酶（CHS，chalcone synthase），TT5编码查尔酮异构酶(CHI，chalcone isomerase)等作为结构基因编码类黄酮代谢途径中的酶，TT1，TT2，TTG1，TTG2，TT8等作为转录因子对结构基因的转录进行调控，TT12和TT19则编码色素转运蛋白参与类黄酮物质的转运与积累。在棕色棉纤维色素发育的相关研究中，国内外学者采用不同的分子生物学手段，从棉花中克隆了多个与拟南芥种皮色素合成代谢途径相关的同源基因，如GhCHS,GhCHI,GhF3H,GhDFR,GhANS,GhANR等，这些基因参与色素合成的蛋白质功能推测均基于同源序列分析及生物信息学的功能推测，究竟是否同时参与棉花种皮色素、纤维的色素合成代谢有待进一步证实。针对棉花棕色素研究中存在的上述重要理论课题，迫切需要以拟南芥种皮棕色素合成途径相关基因为参照，在棉花中克隆相关同源基因，并通过分子生物学和转基因技术加以功能验证，以明确这些相关基因是否同时参与棉花纤维棕色素的合成。上述问题的研究证实，将为我们进一步开展棕色棉纤维色素合成代谢途径的研究提供理论支持，并通过分子生物学手段改良棕色棉纤维品质、突破棉纤维色泽多样性研究具有重要的理论和实践意义。

近年来，随着基因克隆技术的快速进展，在差异显示（differential display）技术的基础上，发展了引物退火控制技术（Annealing Control Primer，ACP），也称为Gene Fishing技术。本发明利用Gene Fishing技术，在陆地棉棕色纤维浙彩棉2号和白色纤维棉浙棉11号纤维发育的特定阶段，筛选参与棉纤维棕色素代谢的特异表达基因，从而克隆了GhTT12a基因，依据于生物信息学分析，初步明确了GhTT12a基因与其它物种TT12基因的同源性和进化性关系。同进，利用荧光定量PCR方法分析了GaTT12a基因在亚洲棉纤维及种皮发育中的表达特征，为进一步研究该基因在棉纤维棕色素代谢中参与的生物学功能奠定了一定研究基础。

在植物基因功能研究中，转基因功能互补和基因沉默是揭示基因功能的有效技术手段。功能互补通过构建目的基因的正义表达载体转化该基因缺失突变体，从而验证该基因在植物体内执行的功能。对于同源基因功能的验证，也可以采用转化近似物种的突变体，从而快速完成同源基因的功能验证。对于棉花转基因周期较长、单一性状突变体库缺乏，采用转化拟南芥突变体进行同源基因或相似基因结构域的功能验证是一种比较快捷的方法。基因沉默是生物体的一种古老机制，它在生长和发育过程中通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。近年来，该技术作为一个重要的遗传操作工具在植物分子生物学研究和遗传改良方面得到广泛应用，多种植物基因沉默技术相继建立,包括反义RNA、dsRNAi(双链RNA干涉)和人工microRNA，特别是dsRNAi和microRNA在基因沉默的精确性和高效性等方面有了新突破。dsRNAi和microRNA在降解目标基因mRNA的效率上比反义RNA技术更高，能在低于反义RNA几个数量级的浓度下使目标基因表达降到极低的水平甚至功能完全丧失；而且，在转基因过程中，不存在插入位点随机性的问题，理论上任何基因都可被针对性的dsRNAi或microRNA特异性沉默。

发明内容

为了克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因并进而对棕色棉纤维品质进行改良，利用生物技术等手段实现棉花纤维色泽多样化，本发明的第一个目的是提供棉花GhMATE1基因和由该基因编码的蛋白质，并通过实验证明该基因既参与种皮棕色素的形成，又参与纤维棕色素的形成，有望在棕色棉育种上得以应用。本发明的第二个目的是提供含有上述的基因的表达载体和宿主细胞。本发明的第三个目的是提供上述的基因在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

棉花GhMATE1基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID：NO.1所示。

一种由上述的基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID：NO.2所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

棉花GhMATE1基因的植物正义互补双元表达载体，该表达载体以植物表达双元载体pFGC5941为骨架载体，选取含有GhMATE1基因完整蛋白质编码框的一段序列作为该基因的正义表达结构，并分别引入BamHI和XhoI酶切位点，从而构建了含有GhMATE1基因的正义表达载体。

一种宿主细胞，该宿主细胞采用所述的棉花GhMATE1基因的植物正义互补双元表达载体转化。作为优选，所述的转化用的菌株采用农杆菌EHA105。进一步，所述的宿主细胞采用渗透法转化拟南芥突变体tt12。

棉花GhMATE1基因的双链RNA干涉表达载体，该表达载体以植物表达双元载体pCAMBia2301为骨架载体，选取植物表达双元载体pBI121的表达核结构，酶切、连接构建成载体pCAMBIA2301-121，再以SEQ ID：NO.1所示的棉花基因组中一段序列作为构建双元干涉载体的中间Loop环状结构，Loop环状结构的序列SEQ ID：NO.3所示，引物为上游引物：AGAAGCGAGATGAGGGATGT，下游引物：CATTT TCATGCGAAGGATTC。

一种宿主细胞，该宿主细胞采用所述的棉花GhMATE1基因的双链RNA干涉表达载体转化。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

核苷酸序列如SEQ ID：NO.1所示的基因在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。

本发明在前期克隆棉花GhTT12a基因（中国发明专利申请号：2013103802705，申请日：2013-8-27）基础上，利用生物信息学分析及电子克隆的方法，克隆了一个新的含有MATE保守结构域的基因，但基因结构、剪切方式与GhTT12a基因完全不同，该基因与拟南芥种皮棕色素合成TT12基因核苷酸序列存在78%的序列同源性。随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因，命名为GhMATE1，该基因编码497个氨基酸残基，分子量约53.6KD，属于MATE超基因家族中的一个成员。利用荧光定量PCR分析了GhMATE1基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征，结果表明：GhMATE1基因在二倍体棉和四倍体棉的棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达，在白色棉纤维中几乎不表达，说明该基因既参与种皮棕色素的形成，又参与纤维棕色素的形成。针对棉花GhMATE1基因的功能分析，构建植物正义双元表达载体启动子35S：：GhTT12a：：Nos终止子表达核结构互补拟南芥突变体tt12，分子鉴定及转基因生理学分析均表明该基因能使拟南芥突变体tt12恢复野生型表型，从而证明该基因参与种皮棕色素的合成；根据该基因的分子结构及保守结构域特征，构建2种不同类型的双链RNA干涉载体（dsRNAi，载体序列见附件），通过损伤的花粉管通道法转化棕色棉花，对棕色棉30个转基因株系T₀代及T₁代的分子鉴定及转基因棉花生理学指标分析均表明该基因均能不同程度降低棉花棕色纤维的色泽，从而证明该基因参与棉花纤维棕色素的代谢。在研究过程中，利用GhTT12a基因并通过生物技术方法获得不同深浅程度的棕色纤维棉种质资源10份，创新的这些种质材料有望在棕色棉纤维品质改良上得以应用。

附图说明

图1为棉花GhMATE1基因的内含子和外显子示意图。

图2为棉花GhMATE1基因与其他物种TT12同源基因的氨基酸序列比较图。

图3为棉花GhMATE1基因的核苷酸序列系统进化分析图。

图4为GhMATE1基因在二倍体、四倍体棕色、白色棉纤维不同发育时期的表达水平图。

图5为含有GhMATE1基因植物正义表达载体的构建图。

图6、图7为含有GhMATE1基因2个不同结构双元干涉载体的构建流程图。

图8为棉花GhMATE1基因转拟南芥tt12突变体所获得的阳性株的PCR扩增鉴定图；M：DNAmarker DL2000,1：含有棉花GhMATE1基因的阳性质粒pFGC5941-GhMATE1；2、3、4、5、6：喷洒Basta具有抗性的拟南芥单株；7：野生型拟南芥植株。

图9为转棉花GhMATE1基因在互补拟南芥tt12突变体阳性株根、茎、叶、角果和花中的表达水平图。

图10为转棉花GhMATE1基因在互补拟南芥tt12突变体阳性株中的含量图。

图11为棉花GhMATE1基因干涉载体中部分片段在转深棕色纤维棉中的PCR扩增鉴定图；M：DNAmarker DL2000,1：含有棉花GhMATE1基因干涉载体的阳性质粒pFGC5941-GhMATE1RA；2、3、4、5、6、7：喷洒千分之四卡钠霉素具有抗性的转基因棉单株；8：野生型棉T586单株。图12为棉花GhMATE1干涉深棕色棉纤维的应用图；ZM11：未转基因白色棉浙棉11；T586：深棕色棉T586品系（转基因亲本株）；T0-1：深棕色棉干涉株1；T0-2：深棕色棉干涉株2；T0-3：深棕色棉干涉株3；T0-4：深棕色棉干涉株4；T0-5：深棕色棉干涉株5；T0-6：深棕色棉干涉株6。

具体实施方式

1.材料与方法

1.1植物材料和生长条件

陆地棉棕色纤维浙彩棉2号、白色纤维棉花浙棉11、二倍体棕色纤维棉慈溪紫棉和白色纤维棉余姚中棉均由浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所经济作物研究室提供并于2011年5月初直播播种于本院杭州院本部实验田。在棉花开花后的第9d（开花后，DPA,DayPost Anthesis）、12d、15d、18d、21d和24d，分别选取正在发育的棉纤维组织和种皮组织开展相关研究。

1.2实验方法

1.2.1棉花基因组DNA和棉纤维、种皮组织总RNA的提取

棉花基因组DNA提取采用CTAB法（Li et al.,2001)。采用多酚、多糖类植物RNA提取试剂盒提供的方法提取棉花纤维组织、种皮组织总RNA，试剂盒购自北京百泰克Bioteck生物技术有限公司。

1.2.2利用生物信息学分析筛选并克隆棉花GhMATE1基因

根据已经克隆的棉花棕色纤维色素GhTT12a基因和拟南芥种皮棕色素AtTT12基因的蛋白质保守结构域序列，搜索棉花ESTs数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），共选出3条序列(GenBank登录号为DT563323.1，DT568479.1，ES823453.1)。再以这3条EST序列搜索ESTs数据库并拼接，最终获得一条序列，该序列含有一个完整开放阅读框（ORF，OpeningReading Frame），根据该序列ORF预测的蛋白质与拟南芥TT12蛋白存在约82%的同源性。依据与ORF的序列特征，设计1对PCR扩增的特异引物(P1:TGTAAAGCATGGGTTCAGAGG和P2:ACATCTCAAGTGCCATCTACCT)。

分别以浙彩棉2号发育15DPA的棉纤维组织总RNA反转录获得的cDNA第一链为模板，结合PCR技术，扩增条件为:94℃预变性4min；94℃变性30s,56℃退火30s,68℃延伸2min；30个PCR循环，最后68℃延伸10min，15℃保温。扩增体系为50ul：2X KOD扩增反应液，10ul dNTP，2ul P1引物，2ul P2引物，1ul KOD FX，5ul转录后产物，5ul超纯水；再将PCR产物加A，加A反应体系为10ul：5ul连接缓冲液，1ul pTA2载体，1ul连接酶，1ul加A连接液，2ul KOD扩增产物。转化大肠杆菌感受态TG1，筛选阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。采用MBI公司的反转录试剂盒合成cDNA第一链，利用KOD FX酶扩增获得推测的GhMATE1基因（TOYOBO，上海，东洋纺生物科技有限公司）。本实验所涉及到的引物均合成自上海生工生物技术工程服务有限公司。

1.2.3引物设计和生物信息学分析

研究中涉及到的引物设计利用Primer Premier5.0

（http://www.premierbiosoft.com/index.html）完成，利用DNAman6.0软件

（http://www.lynnon.com）对氨基酸序列进行同源性比较和核酸系统进化树分析，蛋白质保守结构域的推测采用Genbank数据库中的Blast在线分析系统

（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov），具体的结构域位置分析利用SMART在线软件分析

（http://smart.embl-heidelberg.de）。

1.2.4棉花GhMATE1基因的结构特征分析

连接后的阳性克隆经测序后，分4段设计引物，扩增其对应的基因组DNA片段，经加A，切胶回收，克隆至pTA2载体，经测序拼接获得该基因的DNA序列。实验中所用的酶和载体同上。

1.2.5利用荧光定量PCR分析二倍体棉和四倍棉中GhMATE1基因的表达特征

根据棉花不同发育时期的纤维组织、种皮组织的cDNA，用实时荧光定量RT-PCR技术检测GhTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮组织中的相对表达水平。棉花GBQ7基因用作荧光定量PCR的内参基因（扩增引物）（Tu et al.,2007)，GhTT12a基因的特异性扩增引物见表2。实验操作均参考试剂盒说明书（TOYOBO SYBR Green Supermixture，上海，东洋纺生物科技有限公司），荧光定量PCR的温度循环：50℃，1min；94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸45s；共计30个PCR循环。

表2荧光定量PCR中所用的引物及序列

1.2.6棉花GhMATE1基因正义表达载体的构建及拟南芥突变体tt12的互补实验

依据测序获得的GhTT12a基因cDNA序列并确定该基因的完整蛋白质编码序列。由于拟南芥tt12突变体由T-DNA插入而产生，因此，我们选择植物表达双无载体pFGC5941做为该基因的正义互补载体，在起始端引入酶切位点XhoI，在终止端引入酶切位点BamHI（GhMATE1P1：CCGCTCGAGTGTAAAGCATGGGTTCAGAGG；GhMATE1P2：CGCGGATCCACATCTCAAGTGCCATCTACCT），从而构建完整的正义基因表达结构。

采用渗透法转化拟南芥突变体tt12。将含重组质粒农杆菌在28℃摇菌过夜至OD600值为1.0－2.0之间，8000rpm离心8min，弃上清收集菌体。沉淀用含质量浓度为50g/L的蔗糖、pH值5.7的MS培养基重悬至OD600值约为0.5,并加入0.02%Silwet70,充分混匀后将拟南芥花序浸入其中，每隔2min搅拌菌液，10min后取出平放并保湿12--24小时，4周后收集转化后拟南芥tt12的种子。

1.2.7棉花GhMATE1基因双链RNA干涉载体的构建

根据棉花基因组中的一段序列做为干涉载体设计的发夹环结构，该段序列见附件4，扩增引物INA、INB，在发夹Loop环设计中引入酶切位点BamHI，SacI和KpnI。棉花GhMATE1基因的2种不同干涉结构的正义端引物酶切位点XbaI，BamHI；反义端引入酶切位点SacI和KpnI，从而构建完整的发夹环结构，涉及到的引物序列信息见表2。Loop环结构的扩增以棉花基因组DNA为模板，干涉载体结构中基因片段的扩增以反转录获得的GhTT12a基因PCR产物为模板，均采用KOD FX酶扩增获得目的片段（TOYOBO，上海，东洋纺生物科技有限公司）。

表2荧光定量PCR中所用的引物及序列

1.2.8改良法花粉管通道法转化棉花

含有目的干涉载体农杆菌LBA4404新鲜菌液的处理：将含重组质粒农杆菌在28℃摇菌过夜至OD600值为1.0－2.0之间，8000rpm离心8min，弃上清收集菌体。沉淀用含质量浓度为50g/L的蔗糖、pH值5.7的MS培养基重悬至OD600值约为0.5，并加入0.02%Silwet70，充分混匀后立即使用，每隔2min搅拌菌液。

改良法花粉管通道法转化棉花的操作：即在棉花开花授粉当天下午3--6点之间，用刀片将棉花柱头劈开，用非常小的棉花团蘸取并浸湿经过处理并含有目的载体的农杆菌LBA4404的新鲜菌液，然后用镊子夹取含有菌液的棉花团夹在劈开的柱头中，随后用麦管（塑料夹子）夹住劈开的棉花柱头并保湿。转化处理过的棉花铃用不同颜色的线扎棉铃基部以示不同，便于收种时区别开来。

1.2.9转基因拟南芥、棉花植株田间鉴定及分子鉴定

将转基因收集的拟南芥种子晒干后,用75%乙醇（含0.2%吐温20）消毒10min后，弃上清，然后用无水乙醇漂洗10s后,置于无菌滤纸上吹干30min，播种于MS培养基中，于光照8h、黑暗16h的光照培养箱培养14d后，喷洒千分之三浓度的Basta溶液进行阳性株的初步鉴定。

转基因棉花阳性株的鉴定采用子叶期卡钠霉素快速鉴定法。

选择对Basta鉴定和卡钠霉素鉴定均具有抗性的T0、T1代拟南芥和棉花植株进行PCR检测。目的基因扩增和干涉载体片段扩增及鉴定序列参见表2和表4，PCR循环反应条件如下94℃，30s；64℃，30s；68℃，90s。

1.2.10转基因拟南芥、棉花种皮棕色素和纤维棕色素含量的测定

转基因阳性株及后代棕色素的提取及检测先采p-Dimethylaminocinnamaldehyde(DMACA)分析，分别将种子、纤维浸泡在2%DMACA和3M盐酸（体积比）溶液中4天，再用70%的乙醇清洗干净在光学显微下观察；第二，用高效液相色谱法(HPLC)测定物质的类黄酮含量，具体操作步骤参见文献^[11,16]。

2.结果与分析

2.1棉花GhTT12a基因克隆、序列信息和基因结构特征

根据EST序列拼接得到的推测序列信息，分别设计引物覆盖该基因的编码框区域，再结合RT-PCR方法获得目的序列，测序得到的结果与EST拼接得到的数据相一致，证明该序列正是GhMATE1基因。自GhMATE1基因开放阅读框的46bp到1516bp，共编码497个氨基酸，分子量大小为53.6KD，结合SMART在线分析程序（http://smart.embl-heidelberg.de/），表明在第27位至469位氨基酸之间存在着连续10个跨膜结构域（见下表中划线的氨基酸序列）。利用Blast分析表明，该氨基酸序列属于MATE（multidrug and toxic compound extrusion）超基因家族。

下划线氨基酸部分为连续的10个跨膜结构域，=表示该基因的起始密码子位置，*表示终止密码子的位置。

利用扩增GhMATE1基因的相同引物，分段扩增亚洲棉棕色棉基因组DNA，获得约2.9Kb的PCR产物，经测序并拼接为完整的序列后，分析表明该扩增片段确实为该基因对于的DNA序列，结果也显示GhMATE1基因有5个外显子和4个内含子构成，见图1所示。E1—E5代表外显子，单线条代表内含子。

2.2棉花GhTT12a基因的系统进化与同源性分析

对棉花GhMATE1基因编码的氨基酸序列和其他物种TT12蛋白质进行BlastP和多重序列比对（mutiple alignment）分析，结果表明，棉花GhMATE1基因与其它物种TT12基因一样，均含有MATE保守结构域，而且与可可树的TcTT12-2、亚洲棉的GaTT12a、大豆的GmTT12，油菜的BnTT12基因和拟南芥的AtTT12所编码的蛋白均具有一定的氨基酸序列相似性，尤其在氨基酸序列45--480之间含有MATE结构域部分的序列更为一致，表明TT12基因在进化上较为保守，如图2所示。

选取其它7种物种的TT12同源性基因与棉花GhMATE1基因一起进行多重序列比对，同时构建8个物种TT12同源性基因的遗传进化树。如图3所示，棉花GhMATE1基因与可可树的TcTT12在进化关系上最为接近，氨基酸序列同源性达到90%，与亚洲棉的GaTT12a基因在进化关系上也存在着82%的序列同源性，与大豆中的GmTT12基因之间存在约81%的同源性。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtTT12（NM_115765.3），油菜（Brassica napus）BnTT12（EU818785.1），苹果（Malus x domestica）MdTT12-1（GU064954.1），大豆（Glycinemax）GmTT12（XM_003553118.1），苜蓿（Medicago truncatula）MtTT12-1（FJ858726.1）、MtTT12-2（GU064955），可可树（Theobroma cacao）TcTT12-2（EOX93053）和拟南芥（Arabidopsisthaliana）AtTT12（NP_191462）的TT12同源基因。

2.3棉花GhMATE1基因在棉花不同发育阶段纤维、种皮组织中的表达分析

为了研究GhMATE1基因在二倍体和四倍体棉纤维不同阶段中的表达模式，我们采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测该基因的表达。分别选择棉铃发育至开花后9d、12d、15d、18d、21d、24d的纤维组织和种皮组织，提取总RNA，利用反转录合成的cDNA第一链作为荧光定量PCR检测的模板，荧光定量检测结果如图4所示。在所有样品中均能够检测到GhMATE1的表达。在棕色纤维棉慈溪紫棉和浙彩棉2号中，随着种皮和纤维发育时间的增长，GhMATE1的表达量均有不同程度的增高，特别在15DPA后，表达量有迅速的提高；但在白色棉余姚中棉和浙棉11中棉纤维中，随着发育时间的增长，该基因的的表达量未来呈现大幅度提高，而且一直维持在相对比你低的水平。在18DPA和21DPA时期，GhMATE1在棕色纤维中的表达量分别是白色纤维中表达量的8倍和10倍。以上结果初步表明：GhMATE1基因在棕色纤维中优势表达。

2.4棉花GhMATE1基因植物正义互补双元表达载体的构建

为了验证棉花GhMATE1基因是否参与棉花种皮棕色素的合成代谢，实验以植物表达双元载体pFGC5941为骨架载体，选取含有GhMATE1基因完整蛋白质编码框的一段序列作为该基因的正义表达结构，并分别引入BamHI和XhoI酶切位点，构建过程见下图5、图6。最后经双酶切、PCR鉴定和测序，表明目的片段已连接至双元表达载体中，从而构建了含有GhMATE1基因的正义表达载体，命名pFGC-GhMATE1。

2.5棉花GhTT12a基因植物干涉表达载体的构建

以植物表达双元载体pCAMBia2301为骨架载体，选取植物表达双元载体pBI121的表达核结构，酶切、连接构建成载体pCAMBIA2301-121，再以棉花基因组中一段序列作为构建双元干涉载体的中间Loop环状结构，Loop环状结构的序列及引物位置见下表。

下划线序列为发夹环状结构的引物序列。

根据棉花GhMATE1基因蛋白质序列的MATE结构域区域，分别选择2段不同的序列做为该基因的干涉表达结构的正义链，其对应的反义链做为构建的反向互补结构，正义链端引入XbaI和BamHI酶切位点，反义互补链引入KpnI和SacI酶切位点。构建过程见图7。最后经不完全双酶切、PCR鉴定和测序，表明目的片段已连接至双元表达载体中，从而构建了含有2个不同干涉结构的干涉表达载体，分别命名为pGhMATE1RI-A和pGhMATERI-B。

2.6棉花GhMATE1基因互补拟南芥突变体tt12的鉴定

将构建的含有棉花GhMATE1基因的正义表达载体pFGC-GhMATE1转入农杆菌EHA105，通过农杆菌介导的花絮浸染法转化拟南芥tt12突变体，并获得了种子。为了检测棉花GhMATE1基因是否成功转化tt12突变体，在获得的转化拟南芥T0单株生长至3----4片叶子时，用千分之三的Basta溶液喷洒正在生长的拟南芥植株，2周后，选取4株对Basta具有抗性的拟南芥单株，以拟南芥突变体tt12（N5740，http://www.arabidopsis.org/）株系的基因组DNA作为模板，通过PCR反应进行检测。结果表明，4个转基因拟南芥株系皆扩增出目的条带（图8）。表明棉花GhMATE1基因已成功转入拟南芥突变体，且Bar基因正常表达。

为了验证转入的棉花GhMATE1基因是否正常表达，我们采用荧光定量PCR的方法来检测该基因的表达。以野生型拟南芥TT12基因的表达为对照，选择以上4个株系的T1代Basta阳性株，按株系分别检测。拟南芥tt12突变体中棉花GhMATE1基因的表达强度见图9。从图9表中可以看出，野生型拟南芥TT12基因在根、茎、叶和花中的表达量都比较低，然后在角果中的表达量异常高，表明TT12基因主要在种子发育过程中发挥作用，与前人的研究基本一致。以棉花GhMATE1基因成功互补拟南芥突变体tt12的5株T1代阳性株系中，根、茎、叶和花中的表达量差异不是非常明显，但株系之间的表达量有明显差异，可能是与组成型表达启动子CaMV35S的原因。

为进一步确定GhMATE1是否执行与拟南芥TT12相同的功能，我们从互补tt12突变体的阳性单株收获的种子里提取黄酮类化合物PAs聚合物，结合酸催化水解和液相色谱质谱（LC-MS）分析测定其含量。在强酸性和氧化裂解条件，PAS粉红色花色素的单体产量可以很容易地量化分析。拟南芥tt12突变体种子中不溶性PAs是野生型种子中含量的5倍，且可溶性PAs与不溶性PAs含量相差不大。互补后的阳性单株测定结果表明，可溶性PAs较突变体tt12中的含量已大大减少，减少比例分别为69%、63%、74%、70%和68%，阳性株中不溶性PAs是可溶性PAs的4.81、4.17、3.79、4.57、4.35倍，以上结果见图10所示（数据略）。以上实验结果表明：棉花GhMATE1基因在棉花种皮棕色素形成执行重要功能，与AtTT12基因功能类似。

2.7棉花GhMATE1基因dsRNAi载体在表达过程中，不同程度降低了深棕色棉纤维的色泽

根据棉花GhMATE1的基因结构，我们分别设计了2种不同的双链RNA干涉载体结构，利用改良法花粉管通道法转化深棕色纤维棉P158，并对T0代阳性株进行了分子鉴定，确认目的基因已转进深棕色彩色棉（图11），并且转基因T0代一些单株呈现深浅程度不一的棕色棉（图12）。以上实验结果表明棉花GhMATE1基因同时也参与棉花纤维棕色素的合成代谢，在纤维棕色素发育中起重要功能。

3.讨论

本发明利用生物信息学分析再结合同源克隆及功能推测。依据NCBI数据库中棉花庞大的EST数据，对相似性较高的EST序列拼接、整合从而获得初步推测的目的序列，再结合分子生物学相关技术获得目的基因的真实序列，从而较快的克隆到目的基因。这种方法尤其适用于在已研究比较深入研究建立了EST库的物种。到目前为止，在NCBI数据库中，仅棉花不同组织的EST序列已超过31万条，而且新的棉花EST序列依然在不断增加中，充分利用这些数据信息，是快速获得棉花新基因的一种有效方法。

棉花GhMATE1蛋白序列中含有典型的跨膜结构域。序列比对分析显示,GhMATE1基因与GaTT12a基因与其他物种上的基因在序列上存在着一定的一致性，但整个编码区蛋白质的同源性达82%，并且含有MATE保守结构域，但这2个基因的剪切方式完全不同，核苷酸序列同源性仅有76%，可能与在不同物种中该基因的进化有关。而且这2个基因在二倍体与四倍体棉中均存在。

棉花是我国重要的经济作物、纤维作物。天然棕色棉中棕色素含量的高低又影响到棉纤维色泽的深浅，棕色素的前体物质为原花色素。本研究从棉花GhMATE1基因入手，利用不同品种色泽纤维材料对种皮、纤维棕色素生物合成进行了初步研究，了解到GhMATE1基因在棉花原花色素合成中的重要作用.在已经克隆的棕色棉纤维色素合成代谢相关基因中，如GhCHS1，GhCHI，GhF3H，GhDFR，GhANS，GhANR等，这些基因均与拟南芥种皮棕色素合成代谢途径相关基因具有比较高的同源性，但参与棉花种皮棕色素功能的研究一直未见报道。拟南芥TT12蛋白质编码跨膜运输蛋白，在棕色素合成代谢中负责矢车菊素-3-氧-糖苷/氢逆向运输，从而造成原花色苷前导物在液泡中的积累，在种皮棕色素合成代谢途径中执行重要功能。因此，推测在棉花中的以上同源基因也同时参与种皮棕色素的合成。

对GhMATE1基因在2倍体亚洲棉棕色、白色棉及四倍体棉纤维中的初步分析表明：该基因在棕色棉纤维中表达量最高，而在白色棉纤维中的最低。本研究证明了棉花基因GhMATE1既参与棉花种皮棕色素的合成代谢又参与纤维棕色素的合成代谢，从而从分子生物学水平佐证了以上结论，也为研究棉花纤维棕色素的合成代谢提供了一种研究思路。同时也暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素的合成可能分享相似的代谢途径。根据以上研究结果，可筛选出纤维颜色深浅不一的棕色棉单株，有望在育种上得以应用。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所；浙江省农业科学院

<120>棉花GhMATE1基因及其表达载体、宿主细胞和在改良棉花棕色纤维色泽中的应用

<160>6

<210> 1

<211> 1654

<212> DNA

<213> 棉花

<400> 1

   1 ATAGAAGTCA TTTGCCTAAC GTAAATACTA GAAAGCTGTA AAGCATGGGT TCAGAGGAAC

  61 AGCGGCCATT GCTACGAATA TCGGAATTAT CATCGGATGC GATCGAAGAG GTTTTTGAAA

 121 GTGGCGACGG CGGCGGAGGA GTAGGGTGGT GGGTGAGGCT TGTTGCGTGG GAATCGAGGA

 181 TTTTGTGGTT GTTATCAGGG GCATCCATAA TTGTCTCTGT TTTTAATTAT ATGCTCACTT

 241 TTGTCACTTT AATGTTCACT GGTCATCTTA ATGCATTGGA ATTGGCTGGT GCTTCTATTG

 301 CTAGTGTTGG AATTCAAGGT CTTGCTTATG GGATTATGTT GGGCATGGCG AGTGCGGTAC

 361 AGACCGTGTG TGGCCAAGCA TACGGTGCCA AGAAATACGC AGCCATGGGG ATCATTTGCC

 421 AAAGAGCAAT TGTATTACAC ATAGGAGCCT CAGTTATCCT AACATTCCTC TATTGGTATT

 481 CGGACACCGT CCTTCAAGCA ATAGGTCAAT CGGCAAGTAT AGCAGAGCAA GGCCAAGTTT

 541 TCGCCCGTGG TTTAATCCCT CAACTTTACG CATTCGCCAT AAGTTGCCCC ATGCAAAGGT

 601 TCCTTCAAGC TCAAAACATA GTGAATCCTT TGGCTTATAT CTCCGTTGGG GTATTTTTGC

 661 TCCACATTCT TCTTACTTGG CTTGCCGTTG ATGTATTGGG ATATGGTCTT CTTGGGGCAT

 721 CTTTGACATT AAGTCTTTCA TGGTGGATTC TTACTATTCT TAATGGACTT TACATTGTTT

 781 TAAGTCCTTC CTGTAAAGAG ACTTGGACTG GTTTGTCTAC TAAAGCTCTT AAAGGGATTT

 841 GGCCTTATTT CAAGATTACT GCTGCTTCTG CTGTTATGCT TTGCTTGGAG ATATGGTATA

 901 ACCAAGGACT GGTGCTTATA TCTGGTCTTC TTCCTAATGC AGCAATTGCA CTAGACTCCA

 961 TTTCTATTTG CATGAACTAC TGGAACTGGG ATATCAACTT TGTTTTAGGC TTTAGTGCAG

1021 CAGCCAGTGT GCGAGTGAGT AATGAGCTAG GGGCAGGGCA TCCCAAGCTG ACCAAATTTT

1081 CAGTCATAGT AGTGAATGCT ACCAGCATTT TCATTAGTAC AGTTTTCACT GCCATTGTTA

1141 TCATATGTCG ATCCCTATTA ATCAAAGCTT TCTCAACCGA CGCTGAAGTT ATACAAGCTG

1201 GTTCCAGTTT GATTCCATTG CTTGCCATCT CCATTTTCTT GAATGGAATC CAGCCCATTC

1261 TCTCAGGAGT GGCCATTGGG AGTGGATGGC AACATATAGT AGCATATGTC AACCTCACTA

1321 CATATTACAT TATTGGTCTT CCAATTGGAT GTGTTCTTGG ATTCAAATTA GGCTTAGGAG

1381 TAGAAGGTAT ATGGTGGGGG ATGGTAGTTG GGGTTCTTCT ACAAACAATA ACTCTAATCA

1441 TTCTCACTGC CAGAACAAAC TGGGACTTGG AGGTTGAAAA AGCTGCGGAT CGGTTGAGGA

1501 AATCAGCCAA TGAAGAGACA TTACATTTGA TTACTGATTA GAGGTAGATG GCACTTGAGA

1561 TGTAGTCAAA TAAACATTAC ATACATTTAG TTCTCTCTTT TCTTAGTTTT ATTTTTTTTA

1621 ATATAAATCT GTTTGCCAAA AAAAAAAAAA AAAA 

<210> 2

<211> 499

<212> 氨基酸

<213> 棉花

<400> 2

  1 MGSEEQRPLL RISELSSDAI EEVFESGDGG GGVGWWVRLV AWESRILWLL SGASIIVSVF

 61 NYMLTFVTLM FTGHLNALEL AGASIASVGI QGLAYGIMLG MASAVQTVCG QAYGAKKYAA

121 MGIICQRAIV LHIGASVILT FLYWYSDTVL QAIGQSASIA EQGQVFARGL IPQLYAFAIS

181 CPMQRFLQAQ NIVNPLAYIS VGVFLLHILL TWLAVDVLGY GLLGASLTLS LSWWILTILN

241 GLYIVLSPSC KETWTGLSTK ALKGIWPYFK ITAASAVMLC LEIWYNQGLV LISGLLPNAA

301 IALDSISICM NYWNWDINFV LGFSAAASVR VSNELGAGHP KLTKFSVIVV NATSIFISTV

361 FTAIVIICRS LLIKAFSTDA EVIQAGSSLI PLLAISIFLN GIQPILSGVA IGSGWQHIVA

421 YVNLTTYYII GLPIGCVLGF KLGLGVEGIW WGMVVGVLLQ TITLIILTAR TNWDLEVEKA

481 ADRLRKSANE ETLHLITD

<210> 3

<211> 420

<212> DNA

<213> 棉花

<400> 3

  1 TGAAAAGTAG AAGCGAGATG AGGGATGTGC ATCGCTAAAA TTTCATCACA CAAATTTAAA

 61 CAATGTTAAA TAAATATACT GAACATTATA TGGATTATTA TTAGTTATAG TGGTAGTTGA

121 CAGTTGGTTT TTGAAAGCTA TCATGTGCTT TTAATTAGTT TTTTTATATA TTTAAAAAAA

181 ATAATATAAG AATACTTGAT AATTTCTGAA ATTTGCTTGT GCAGTTTTTT TAATTTCATT

241 CTTAATATGC AACTTAATTA TCCTATGTTT AAATACAATT AAATATATTT AATGTATGTT

301 TTGAATGTTG ACATATTTAA TTATATTTAT GAAATTGATA TGAAAATAAT ACGAGACATA

361 GAACACAGTT ACAAATCGTC GAATCTGGGT AATATCATTT TCATGCGAAG GATTCAAACA