测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法

技术领域

本发明属于药物质量控制领域，特别涉及一种测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法。

背景技术

荔枝核（Lychee Seed,Litchi Seed），为无患子科植物荔枝（Litchi Chinensis Sonn） 的干燥成熟种子，别名荔仁、荔核、大荔核，收载于《中国药典》2010版一部，性温，味甘、 微苦，具有行气散结，祛寒止痛功效。《本草纲目》记载，荔枝核“止渴、益人颜色、食之止 烦渴”（烦渴病，现代医学称为糖尿病）。研究表明，荔枝核有降低血糖、调节血脂、提高抗 氧化、抑制乙肝病毒表面抗原的作用。荔枝核所含成分研究较为充分，主要成分有皂苷、黄 酮及花色素类、植物甾醇类、鞣质及多酚类、脂肪酸、氨基酸、蛋白质和多糖等。实验研究 和临床治疗显示荔枝核提取物能够显著降低血糖和血脂，有效治疗糖尿病及代谢综合征。充 分利用本地丰富的荔枝核资源，开发成安全有效、质量可控的治疗糖尿病的药物供临床应用， 对改变因生活方式改变而引起的糖尿病患病率居高不下的趋势，具有重要的社会意义和市场 价值。

中国专利CN102048885公开了一种制备荔枝核提取物的提取工艺，通过该工艺获得的提 取物主要成分为荔枝核皂苷，含量达85%以上，其制备工艺为：将荔枝核粉碎为20目大小， 取适量，加入3倍量的水浸润10分钟，称取1%重量（以药材计）的纤维素酶、1%重量（以 药材计）的果胶酶和1%重量（以药材计）的葡聚糖酶加入其中，混匀，控温50℃酶解3小时 后加入3倍量的70%乙醇，超声提取40分钟，滤过，滤液减压回收乙醇及浓缩，浓缩液经大 孔树脂吸附，再用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇及浓缩得浸膏，将浸膏 真空低温干燥即得荔枝核提取物。该提取物可作为中间体加入适量制药辅料后制成用于治疗 糖尿病的药物。为保证药物的安全、有效、稳定，有必要对作为中间体的提取物的质量进行 监控。

目前，作为原料药材的荔枝核为《中国药典》收载的法定药材，其中仅通过鉴别、浸出 物等指标进行简单的质量控制，并无有效成分的含量测定项。荔枝核制剂仅有文献报道采用 高效液相色谱法,以原儿茶酸为对照测定荔枝核复方制剂“降糖片”中的原儿茶酸含量作为质 控指标（郭宇洁等，降糖片中荔枝核提取工艺优选和定量测定，《中国实验方剂学杂志》，2009 年，第15卷,第8期：50-52），原儿茶酸为黄酮类成分而非皂苷类成分，因此不具参考性。 从现有文献对荔枝核皂苷成分的含量测定方法分析，普遍是采用皂苷与香草醛-浓酸（高氯酸、 硫酸、冰醋酸等）显色后进行紫外分光光度法进行测定，其原理是强酸使皂苷的酚羟基脱水， 再与香草醛缩合形成共轭体系而显色（方欢乐等，荔枝核皂苷含量测定及提取工艺优选研究， 《亚太传统医药》，2010年，第6卷（第3期）：17-19.）。该方法原先用于测定人参皂苷等 成分。但荔枝核提取物中除含有皂苷成分外，也含有多酚、原花青素等成分，这类成分也具 有酚羟基结构，因此也能与香草醛-浓酸反应显色，也有文献报道采用该法测定荔枝核中原花 青素的含量（丁丽，荔枝核化学成分的研究（天津科技大学硕士学位论文，2006年），《中国 优秀硕士论文全文数据库》）。因此采用该方法测定荔枝核提取物的皂苷含量，将会使测定值 偏高，不能反映提取物中皂苷的真实含量，不利于提取物的质量控制。因此，建立一种能准 确检测荔枝核提取物皂苷含量的质量检测方法具有现实的意义。

发明内容

本发明的目的是针对以上技术问题，提供一种专属性好，重现性好，稳定性强的测定中 药荔枝核提取物中皂苷含量的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

一种测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步骤如下：

（1）制备对照品溶液：取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇 匀，制成对照品溶液；

（2）制备供试品溶液：取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50mL甲醇超声提取 30min，滤过，滤液回收甲醇至净，残渣加水10mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的 正丁醇萃取3次,每次10mL，合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，残渣以色谱纯甲醇溶解， 转移至10mL量瓶中，并以色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液 作为供试品溶液；

（3）精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积；以不 同的进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程： A=1.8152C-1.3038，R²=0.9918；

（4）精密吸取供试品溶液10μL，进样，测定峰面积，根据上述标准曲线计算样品皂苷 含量。

根据本发明的方法，所述步骤（1）中的对照品溶液每毫升含人参皂苷Rg₁0.10mg。

根据本发明的方法，，所述色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格 为：4.6mm×250mm,5μm；流动相为甲醇-水（70:30），流速为1.0mL/min，柱温为30℃；检 测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为90℃，氮气流速为2.0L/min。

经本法测定，专利CN102048885中所公开的荔枝核提取物所含皂苷以浸膏干重计不少于 0.8g/g。

与现有技术相比，本发明基于高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)，提供一种新 的荔枝核皂苷的含量测定方法，该法专属性好，重现性好，稳定性强，从而使得对产品的质 量控制和用药安全得到保证。

具体实施方式

实施例1

1、仪器：

Agilent1100高效液相色谱仪(Agilent公司,美国)，包括脱气机，四元梯度泵，自动进 样器，柱温箱和HP Chemstation工作站；Allteeh ELSD2000检测器(Allteeh公司，美国)； AE240型电子分析天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；Buchi旋转蒸发仪(Buchi公司,瑞士); KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2、试药：

荔枝核提取物（按照专利CN102048885方法自制）；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品 检定研究院）；正丁醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）。

3、色谱条件：

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C₁₈柱，规格为：4.6mm×250mm,5μm;流动相为甲 醇-水（70:30），流速为1.0mL/min，柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，检测参数： 漂移管温度90℃，氮气流速为2.0L/min。

4、试验方法：

4.1对照品溶液的制备：

精密称取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇匀，制成每毫升 含人参皂苷Rg₁0.10mg的对照品溶液。

4.2供试品溶液的制备：

取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50mL甲醇超声提取30min，滤过，滤液回收甲 醇至净，残渣加水10mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10 mL合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，残渣以色谱纯甲醇溶解,转移至10mL量瓶中,并以色 谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

4.3标准曲线制备：

精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积。以不同的 进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程：A=1.7835C-1.3736， R²=0.9918。

4.4精密度研究：

精密吸取4.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪中，测定峰面积，重复进样6次， 测得人参皂苷Rg1峰面积RSD为1.87%，表明仪器精密度良好。

4.5回收率实验：

在已知皂苷含量的提取物溶液中定量加入对照品溶液，混匀，吸取10μL，按以上条件测 定峰面积，根据标准曲线计算皂苷对照品的量，计算回收率，回收率为99.3%。

4.6稳定性研究：

分别在0,1,2,4,8小时精密吸取4.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪中，测定峰 面积，峰面积RSD为2.13%，表明供试品溶液在8小时内稳定。

实施例2

1、仪器：

Agilent1100高效液相色谱仪(Agilent公司,美国)，包括脱气机，四元梯度泵，自动进 样器，柱温箱和HP Chemstation工作站；Allteeh ELSD2000检测器(Allteeh公司，美国)； AE240型电子分析天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；Buchi旋转蒸发仪(Buchi公司,瑞士); KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2、试药：

荔枝核提取物（按照专利CN102048885方法自制）；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品 检定研究院）；正丁醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）。

3、色谱条件：

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C₁₈柱，规格为：4.6mm×250mm,5μm;流动相为甲 醇-水（70:30），流速为1.0mL/min，柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，检测参数：漂 移管温度90℃，氮气流速为2.0L/min。

4、试验方法：

4.1对照品溶液的制备：

精密称取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇匀，制成每毫升 含人参皂苷Rg₁0.10mg的对照品溶液。

4.2供试品溶液的制备：

取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50mL甲醇超声提取30min，滤过，滤液回收甲 醇至净，残渣加水10mL使溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇萃取3次,每次10mL 合并正丁醇萃取液,于水浴上蒸干,残渣以色谱纯甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,并以色谱纯 甲醇稀释至刻度,摇匀,以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

4.3标准曲线制备：

精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积。以不同的 进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程：A=1.8152C-1.3038， R²=0.9918。

4.4样品皂苷含量测定：

精密吸取4.2项下的供试品溶液10μL，进样，测定峰面积，根据标准曲线计算样品皂苷 含量。经计算，提取物皂苷含量为0.809g/g。