检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条及方法

技术领域

本发明涉及一种检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条及方法。 

背景技术

大观霉素又称壮观霉素、奇放线菌素、壮观菌素等，为大观链霉菌所产生的一种氨基环醇类抗生素，对革兰氏阴性菌(如布鲁氏菌、克雷伯菌属、变形杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰氏阳性菌(链球菌、葡萄球菌等)作用较弱，对支原体亦有一定作用，是一新型特效专治淋病的抗生素，对淋病奈瑟菌有较强的抗菌作用。能促进动物生长，是良好的动物饲料添加剂，作为兽药广泛应用于畜牧业中。一些不法商贩受经济利益的驱使滥用抗生素，使大量抗生素残留在畜产品中，如果长期食用含有抗生素残留的动物源性食品，也就相当于长期低剂量吸收抗生素，使人体内菌株产生抗生素抗性，给患病时使用抗生素治疗带来不良影响，会破坏机体内环境平衡，造成菌群失调，抗生素过敏体质的人会出现过敏反应，引起免疫性溶血，同时造成食品和环境中药物残留污染的一系列问题。 

链霉素是氨基糖苷类抗生素，在奶牛及奶羊养殖中应用普遍，但由于使用管理不规范，常造成鲜奶及奶粉中链霉素残留。由于链霉素、对人体具有较大的毒副作用，严重时可造成过敏性休克和耳聋，特别是对小孩的危害较大，可透过胎盘进入羊水和胎儿循环，危害胎儿健康。各国对乳制品中的链霉素、双氢链霉素均制定了严格的残留限量，如日本规定奶中链霉素与双氢链霉素的总限量为0.2 mg/kg，美国规定乳及牛奶中双氢链霉素的限量为0.125 mg/kg，中国规定奶中链霉素与双氢链霉素的限量均为0.2 mg/kg，所以对奶粉中的链霉素、双氢链霉素残留量进行检测对于控制奶粉质量，维护人类的饮食健康有重要意义。 

庆大霉素是由小单胞菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌都具有显著的抗菌效果，作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重。许多国家和国际组织均明确规定了食品中该药物残留的最大残留限量。欧盟规定，牛奶中的最大残留量为100μg/kg，肌肉、脂肪中的最大残留量为50μg/kg。 

新霉素属氨基糖苷类抗生素，抗菌谱广，在兽医临床上应用广泛，是重要的抗感染药物，还被普遍用于治疗乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染、足腐烂等疾病。我国和其它一些国家还将新霉素作为饲料抗生素添加剂使用，用于预防畜禽感染引起的早期损失和肠炎，提高饲料利用率，促进生长。虽然新霉素在兽医和畜牧上使用取得了巨大的成功，但其对人和动物存在潜在的耳毒性和肾毒性，为此，我 国和欧盟等国家均制定了动物源性食品中新霉素最高残留限量。 

目前免疫分析领域缺乏能够同时检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素这四种药物的技术及其应用。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大规模推广的检测方法。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条。 

本发明所提供的试纸条包括微孔条、微孔试剂、微孔塞和试纸，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂为冻干的大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物；大观霉素特异性抗体为大观霉素单克隆抗体，链霉素特异性抗体为链霉素单克隆抗体，庆大霉素特异性抗体为庆大霉素单克隆抗体，新霉素特异性抗体为新霉素单克隆抗体；反应膜上包被有四条检测线和一条质控线；微孔试剂中包含大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物，链霉素单克隆抗体-胶体金标记物，庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物，新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，大观霉素检测线包被大观霉素-载体蛋白偶联物，链霉素检测线包被链霉素-载体蛋白偶联物，庆大霉素检测线包被庆大霉素-载体蛋白偶联物，新霉素检测线包被新霉素-载体蛋白偶联物，质控线包被羊抗鼠抗抗体。   

所述保护膜粘贴在样品吸收垫上的检测端，上面有MAX标记线。 

所述的大观霉素检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一端，链霉素检测线、庆大霉素检测线、新霉素检测线在大观霉素检测线和质控线之间。其中大观霉素检测线用检测线（T1）表示，链霉素检测线用检测线（T2）表示，庆大霉素检测线用检测线（T3）表示，新霉素检测线用检测线（T4）表示，质控线用质控线（C）表示。以试纸的样品吸收垫一端为始端，以试纸的吸水垫一端为末端，质控线（C）距离反应膜与吸水垫始端相连的一端为5-8mm，检测线（T4）距离质控线（C）4-6mm，检测线（T3）距离检测线（T4）4-6mm，检测线（T2）距离检测线（T3）4-6mm，检测线（T1）距离检测线（T2）4-6mm。 

所述大观霉素-载体蛋白偶联物是由大观霉素与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。 

所述链霉素-载体蛋白偶联物是由链霉素与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。 

所述庆大霉素-载体蛋白偶联物是由庆大霉素与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。 

所述新霉素-载体蛋白偶联物是由新霉素与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。 

所述大观霉素特异性抗体-胶体金标记物中的大观霉素特异性抗体是以大观霉素-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。 

所述链霉素特异性抗体-胶体金标记物中的链霉素特异性抗体是以链霉素-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。 

所述庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物中的庆大霉素特异性抗体是以庆大霉素-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。 

所述新霉素特异性抗体-胶体金标记物中的新霉素特异性抗体是以新霉素-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。 

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸水垫为吸水纸；保护膜为PE材质保护膜。 

本发明的另一个目的是提供了一种制备上述试纸条的方法，其步骤包括： 

1）在微孔条上制备冻干的大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂，并用微孔塞盖在微孔条上； 

2）制备四条分别具有包被，大观霉素-载体蛋白偶联物，链霉素-载体蛋白偶联物，庆大霉素-载体蛋白偶联物和新霉素-载体蛋白偶联物的检测线和一条包被抗抗体的质控线的反应膜； 

3）将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸； 

4）将1）和3）制备好的冻干有大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸、微孔条以及微孔塞组装成试纸条。 

具体的说，步骤包括： 

1、大观霉素抗原的合成及其抗体的制备 

1）将大观霉素与载体蛋白偶联，形成大观霉素-载体蛋白偶联物； 

2）用大观霉素-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌大观霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

2、链霉素抗原的合成及其抗体的制备 

1）将链霉素与载体蛋白偶联，形成链霉素-载体蛋白偶联物； 

2）用链霉素-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

3、庆大霉素抗原的合成及其抗体的制备 

1）将庆大霉素与载体蛋白偶联，形成庆大霉素-载体蛋白偶联物； 

2）用庆大霉素-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌庆大霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

4、新霉素抗原的合成及其抗体的制备 

1）将新霉素与载体蛋白偶联，形成新霉素-载体蛋白偶联物； 

2）用新霉素-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌新霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

5、提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体。 

6、用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金。 

7、将制备的大观霉素特异性抗体、链霉素特异性抗体、庆大霉素特异性抗体和新霉素特异性抗体分别加入到制备的胶体金中，得到大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂。 

8、将大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂冻干在微孔条中后，将微孔条上盖上微孔塞。 

9、将样品吸收垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%（体积百分含量））、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，在37℃下烘干2h。 

10、在底板上按顺序贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜。 

11、将制备好的微孔试剂、试纸、微孔条和微孔塞组装成试纸条，2-8℃条件下保存12个月。 

本发明的另一个目的提供了一种牛奶样本中大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素残留的检测方法。 

用本发明上述任一所述试纸条进行检测。 

本发明试纸条的检测原理：将待检牛奶样本滴加于包含有微孔试剂的微孔条中，混匀后，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，插入包含有孵育后的微孔试剂微孔条中，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素的含量高，则扩散过程中待测样品液中的大观霉 素或链霉素或庆大霉素或新霉素可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上大观霉素-载体蛋白偶联物结合或链霉素-载体蛋白偶联物结合或庆大霉素-载体蛋白偶联物结合或新霉素-载体蛋白偶联物的结合，相对应的大观霉素检测线或链霉素检测线或庆大霉素检测线或新霉素检测线不能显色，而抗抗体则可与大观霉素金标抗体或链霉素金标抗体或庆大霉素金标抗体或新霉素金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素的含量低或者无，则对应的大观霉素金标抗体或链霉素金标抗体或庆大霉素金标抗体或新霉素金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而大观霉素金标抗体会与反应膜上大观霉素-载体蛋白偶联抗原结合或链霉素金标抗体会与反应膜上链霉素-载体蛋白偶联抗原结合或庆大霉素金标抗体会与反应膜上庆大霉素-载体蛋白偶联抗原结合或新霉素金标抗体会与反应膜上新霉素-载体蛋白偶联抗原结合，对应的大观霉素检测线显色或链霉素检测线显色或庆大霉素检测线显色或新霉素检测线显色，同时抗抗体也可与大观霉素金标抗体或链霉素金标抗体或庆大霉素金标抗体或新霉素金标抗体结合，质控线显色；如果质控线不显色，则试纸条失效。 

阴性（-）：C线显色，四条T线均显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样本中大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素浓度均低于检测限，如图8.a所示。 

阳性（+）：C线显色，T1线不显色，表示牛奶样本中大观霉素浓度等于或高于检测限；C线显色，T2线不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限； C线显色，T3线不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限； C线显色，T4线不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限，如图8.a-8.f所示。 

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，如图8.g-8.k所示。 

本发明试纸条可检测药物包括：大观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、新霉素。 

本发明的试纸条具有如下有益效果： 

1、灵敏度高：传统的试纸卡均具有固定试纸的卡壳固定装置，卡壳固定装置紧紧地将试纸固定其中，在对样品检测时，由于卡壳与试纸结合的比较紧密，致使检测样品溶液不能够充分渗透到样品吸收垫一段，并在试纸上进行层析的速度十分缓慢，导致检测样品中的药物不能够与检测线上包被的包被原充分接触，致使试纸卡的灵敏度下降。本发明试纸条比传统试纸卡的检测灵敏度高，由于本发明试纸条的试纸为裸条状，无需壳体紧固装置，检测样品可以直接接触试纸的样品吸收垫一端，并且样品在试纸上的层析速度比较快，使样品中的待检药物能够充分的与检测线上包被的包被原结合，从而提高了试纸条的检测灵敏度。大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记 物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本发明试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对各种药物检测灵敏度分别为：大观霉素 20μg/L、链霉素80μg/L、双氢链霉素80μg/L、庆大霉素20μg/L、新霉素500μg/L。 

2.操作简便快速：对于以往的试纸卡检测原料奶必须要将原料奶加入稀释液进行稀释才能够点样检测，原因是由于固定试纸的塑料壳体紧紧地把试纸固定在壳体内，而原料奶比较粘稠，所以直接将原料奶在试纸卡的加样孔进行点样检测的话，由于壳体与试纸结合紧密以及奶液粘稠所致，原料奶样品无法完全渗透到样品吸收垫和结合物释放垫中，并且在试纸上的层析速度比较缓慢，以至于无法检测，故要将原料奶加入稀释液进行稀释后方可检测。使用本发明试纸条检测时无需任何其它试剂，检测原料奶时，也不需要对原料奶进行稀释，原因由于本发明试纸条中的试纸为裸条状，即无需用壳体对其进行固定，只要将待检样品溶液直接滴加于冻干有大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔中，混匀后，孵育5min，再将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂中，试纸可以与样品溶液充分接触，5min后观察结果。对于牛奶样品的检测，本发明试纸条比传统试纸卡检测时间短，由于本发明试纸条无需对样品进行稀释，可直接对样品进行检测。 

本发明试纸条敏感度高、检测药物种类多、成本低、操作简单、便于携带、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的大观霉素单克隆抗体、链霉素单克隆抗体、庆大霉素单克隆抗体和新霉素单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。本发明试纸条能够同时检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素四种药物，实现了一个试纸条对多种药物的检测，满足了市场上对大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素同时检测的需求。用本发明试纸条检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广使用。 

附图说明

图1  冻干有金标抗体的微孔条图。 

图2  微孔塞俯视图。 

图3  微孔塞剖面结构示意图。 

图4  试纸剖面结构示意图。 

图5  试纸的俯视图。 

图6  四环素类药物半抗原合成路线图。 

图7  试纸条检测方法示意图。 

图8  试纸条检测结果判定图。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

实施例1、检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条的构成 

一、冻干有金标抗体的微孔条 

所述微孔条中装有微孔试剂，其中1为微孔条， 2为冻干的大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂； 

所述包含有微孔试剂的微孔条上具有微孔塞3（图2和图3）； 

所述微孔条中冻干的大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，大观霉素特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.20-0.25μg/ml；链霉素特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.30-0.40μg/ml；庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.20-0.25μg/ml；新霉素特异性抗体-胶体金标记物的冻干量为0.20-0.25μg/ml。 

二、试纸（图4和图5） 

所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成； 

所述样品吸收垫4、反应膜5、吸水垫6和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板8上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐； 

保护膜7覆盖在样品吸收垫上的检测端，在检测端保护膜上应有MAX字样。 

所述反应膜上有四条检测线分别为检测线（T1）9-1、检测线（T2）9-2、检测线（T3）9-3和检测线（T4）9-4以及一条质控线（C）10，四条检测线和一条质控线均为与所述试纸的长相垂直的条带状，四条检测线位于近于有MAX标记线的保护膜的一侧，质控线（C）位于远离有MAX标记的保护膜的一侧。质控线（C）距离反应膜的末端与吸水垫相连的一端为5-8mm，检测线（T4）距离质控线（C）4-6mm，检测线（T3）距离检测线（T4）4-6mm，检测线（T2）距离检测线（T3）4-6mm，检测线（T1）距离检测线（T2）4-6mm。检测线（T1）包被有大观霉素-载体蛋白偶联物（大观霉素-卵清白蛋白），检测线（T2）包被有链霉素-载体蛋白偶联物（链霉素-卵清白蛋白），检测线（T3）包被有庆大霉素-载体蛋白偶联物（庆大霉素-卵清白蛋白），检 测线（T4）包被有新霉素-载体蛋白偶联物（新霉素-卵清白蛋白），质控线（C）包被有羊抗鼠抗抗体。 

底板为PVC底板；样品吸收垫为吸滤纸；吸水垫为吸水纸；反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。 

将上述试纸与微孔试剂、微孔条以及微孔塞组装成试纸条，在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。 

实施例2、实施例1中所述试纸条的制备方法 

一、试纸条的制备 

该试纸条的制备方法主要包括如下步骤： 

1)在微孔条中制备冻干的大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，并用微孔塞盖在微孔条上。 

2)制备具有包被大观霉素-载体蛋白偶联物的检测线（T1）、包被链霉素-载体蛋白偶联物的检测线（T2）、包被庆大霉素-载体蛋白偶联物的检测线（T3）、包被新霉素-载体蛋白偶联物的检测线（T4）和包被羊抗鼠抗抗体的质控线（C）的反应膜； 

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸； 

4)将1）和3）制备好的冻干有大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸、微孔条以及微孔塞组装成试纸条。 

下面分步详细叙述： 

（一）各部件的制备 

1、抗原的制备 

1）、大观霉素-载体蛋白偶联物的合成与鉴定 

a.大观霉素半抗原合成：取大观霉素0.66 g、羧甲基羟胺0.27 g和吡啶1 ml于20 ml DMSO中的混合液，在室温下搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到大观霉素与羧甲基羟胺的缩合物，分子结构如下： 

（式Ⅰ） 

b.免疫原的制备-大观霉素半抗原与BSA偶联物合成 

取大观霉素半抗原38mg用5ml水溶解；取牛血清白蛋白（BSA）100mg用5ml水溶解；将大观霉素半抗原水溶液加入BSA水溶液中，用磁力搅拌器搅拌反应24h；用0.01mol/L PBS透析3天，每天换液3次，以除去未反应的小分子物质。以12000r/min离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。 

c.包被原的制备-大观霉素半抗原与OVA偶联物合成 

将大观霉素半抗原22mg、15mg N,N'-羰基二咪唑（CDI）用1.5ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，室温搅拌反应1h，即可得到反应液A；称取卵清蛋白（OVA）36mg，使之充分溶解在3.5ml 50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中；室温反应24h，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换液3次，以除去未反应的小分子物质。以12000r/min离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。 

d.大观霉素半抗原-载体偶联物的鉴定 

将大观霉素、牛血清白蛋白、大观霉素-牛血清白蛋白偶联物及大观霉素、卵清蛋白、大观霉素-卵清蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到大观霉素、牛血清白蛋白、大观霉素-牛血清白蛋白偶联物的吸收曲线和大观霉素、卵清蛋白、大观霉素-卵清蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明大观霉素及大观霉素与载体蛋白偶联成功。 

2）、链霉素-载体蛋白偶联物的合成与鉴定 

a.链霉素半抗原合成：1.0 g链霉素、0.30 g邻苯二甲酸酐和1 ml吡啶在20 ml DMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应24小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中多次重结晶得到邻苯二甲酸单链霉素酯，分子结构如下： 

（式Ⅱ） 

b.免疫原的制备-链霉素半抗原与BSA偶联物合成 

取半抗原40mg用2mlDMF溶解完全，制成I液，取BSA80mg用7ml0.1MPBS（PH7.5 )溶解完全，制成II液，将I液加入II液中，制成III液，取EDC100mg用1ml水溶解后缓冲加入III液中，室温搅拌2小时，用0.01MPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原，于-20℃保存备用。 

c.包被原的制备-链霉素半抗原与OVA偶联物合成 

取半抗原40mg用2mlDMF溶解完全，制成I液，取OVA80mg用7ml0.1M PBS（PH7.5 )溶解完全，制成II液，将I液加入II液中，制成III液，取EDC100mg用1ml水溶解后缓冲加入III液中，室温搅拌2小时，用0.01M PBS透析三天，每天换液三次，得免疫原，于-20℃保存备用。 

d.链霉素半抗原-载体偶联物的鉴定 

将链霉素、牛血清白蛋白、链霉素-牛血清白蛋白偶联物及链霉素、卵清蛋白、链霉素-卵清蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到链霉素、牛血清白蛋白、链霉素-牛血清白蛋白偶联物的吸收曲线和链霉素、卵清蛋白、链霉素-卵清蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明链霉素及链霉素与载体蛋白偶联成功。 

3）、庆大霉素-载体蛋白偶联物的合成与鉴定 

a.庆大霉素半抗原合成：0.39 g溴乙酸叔丁酯在5 ml DMSO中的溶液，40℃下缓慢滴加入0.90 g庆大霉素和1 ml 吡啶在10 ml DMSO中的混合物中。滴加完毕后，继续反应6小时后，蒸除溶剂。简单柱层析分离后，除去溶剂，加入20 ml DMSO和5 ml 甲酸，室温反应20小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到羧甲基庆大霉素，分子结构如下： 

（式Ⅲ） 

b.免疫原的制备-庆大霉素半抗原与BSA偶联物合成 

取半抗原35mg用2mlDMF溶解完全，制成I液，取BSA100mg用7ml0.1MPBS（PH7.5 )溶解完全，制成II液，将I液加入II液中，制成III液，取EDC100mg用1ml水溶解后缓冲加入III液中，室温搅拌2小时，用0.01MPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原，于-20℃保存备用。 

c.包被原的制备-庆大霉素半抗原与OVA偶联物合成 

取半抗原35mg用2mlDMF溶解完全，制成I液，取OVA100mg用7ml0.1MPBS（PH7.5 )溶解完全，制成II液，将I液加入II液中，制成III液，取EDC100mg用1ml水溶解后缓冲加入III液中，室温搅拌2小时，用0.01MPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原，于-20℃保存备用。 

d.庆大霉素半抗原-载体偶联物的鉴定 

将庆大霉素、牛血清白蛋白、庆大霉素-牛血清白蛋白偶联物及庆大霉素、卵清蛋白、庆大霉素-卵清蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到庆大霉素、牛血清白蛋白、庆大霉素-牛血清白蛋白偶联物的吸收曲线和庆大霉素、卵清蛋白、庆大霉素-卵清蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明庆大霉素及庆大霉素与载体蛋白偶联成功。 

4）、新霉素-载体蛋白偶联物的合成与鉴定 

a.新霉素半抗原合成：0.61 g 新霉素和10ml DMSO的混合液，室温下缓慢滴加入到0.14 g对苯二甲醛的10 ml DMSO溶液中，滴加完毕后室温至60℃反应2-4小时，除去溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到新霉素对苯二甲醛单缩合物，分子结构如下： 

（式Ⅳ） 

b.免疫原的制备-新霉素半抗原与BSA偶联物合成 

取半抗原30mg用3mlDMF溶解完全，制成I液，取BSA100mg用7ml0.1MPBS（PH7.0 )溶解完全，制成II液，将I液加入II液中，制成III液，室温反应24小时，用0.01MPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原，于-20℃保存备用。 

c.包被原的制备-新霉素半抗原与OVA偶联物合成 

取半抗原30mg用3mlDMF溶解完全，制成I液，取OVA100mg用7ml0.1MPBS（PH7.0 )溶解完全，制成II液，将I液加入II液中，制成III液，室温反应24小时，用0.01MPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原，于-20℃保存备用。 

d.新霉素半抗原-载体偶联物的鉴定 

将新霉素、牛血清白蛋白、新霉素-牛血清白蛋白偶联物及新霉素、卵清蛋白、新霉素-卵清蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到新霉素、牛血清白蛋白、新霉素-牛血清白蛋白偶联物的吸收曲线和新霉素、卵清蛋白、新霉素-卵清蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明新霉素及新霉素与载体蛋白偶联成功。 

2、大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的单克隆抗体的制备 

（1）制备单抗 

a. 动物免疫 

将步骤1得到的四种免疫原分别注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。 

b. 细胞融合和克隆化 

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，分别筛选得到稳定分泌大观霉素单克隆抗体的大观霉素单克隆杂交瘤细胞株、稳定分泌链霉素单克隆抗体的链霉素单克隆杂交瘤细胞株、稳定分泌庆大霉素单克隆抗体的庆大霉素单克隆杂交瘤细胞株和稳定分泌新霉素单克隆抗体的新霉素单克隆杂交瘤细胞株。 

c. 细胞冻存和复苏  

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。 

d. 单克隆抗体的制备与纯化 

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。 

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量百分含量），使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量百分含量）；所述细胞培养基的pH为7.4。 

3、羊抗鼠抗抗体的制备 

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。 

4、单克隆抗体-胶体金标记物的制备 

（1）胶体金的制备 

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01%氯金酸加入2.5 ml 1%柠檬酸三钠，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。 

（2）单克隆抗体-胶体金标记物的制备 

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按100-150mg抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中分别加入上述大观霉素单克隆抗体、链霉素单克隆抗体、庆大霉素单克隆抗体和新霉素单克隆抗体，继续搅拌混匀30min, 加入10%BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置30min。12000rpm、4℃离心30min, 弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，分别得到的大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物溶液、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物溶液、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物溶液和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50μg/ml溶液，置4℃备用。 

复溶缓冲液：含酪蛋白、吐温-80 的0.02mol/L、 pH7.2 的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05%-0.1％（体积百分含量），吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05%-0.15％（质量百分含量）。 

5、单克隆抗体-胶体金标记物微孔试剂冻干到微孔条中 

向微孔条的微孔中加入50μl大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、50μl链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、50μl庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和50μl新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到的微孔条中冻干有大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。 

6、样品吸收垫的准备 

将样品吸收垫置于含BSA（BSA 在缓冲液中的终浓度为0.5%（体积百分含量））、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用。 

7、反应膜的制备 

包被过程：用磷酸缓冲液将大观霉素-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot 点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T1）包被量为1.0mg/cm2；用磷酸缓冲液将链霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T2），包被量为1.5mg/cm2；用磷酸缓冲液将庆大霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T3），包被量为1.5mg/cm2；用磷酸缓冲液将新霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T4），包被量为1.5mg/cm2；用0.01mol/L、pH 7.4 PBS 缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200mg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0mg/cm2。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。 

（二）各部件的组装 

1、试纸的组装 

将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序黏贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好试纸的吸收垫一端黏贴保护膜。 

2、试纸条组装 

将上述步骤1得到试纸、微孔试剂、微孔条及微孔塞组装成试纸条，在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。 

二、试纸条的灵敏度和特异性检验 

本发明试纸条可检测药物包括：大观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、新霉素。 

（一）灵敏度试验  

将大观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、新霉素标准品（购自德国Dr和中国兽医药品监察所）稀释成如下不同浓度： 10、20、40μg/L大观霉素；40、80、160μg/L链霉素；40、80、160μg/L双氢链霉素；10、20、40μg/L庆大霉素；250、500、1000μg/L新霉素。所用的稀释液为pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。 

用试纸条进行检测。每次向包含有金标抗体微孔试剂的微孔条中滴加200μl样品，混匀，孵育5min后，将试纸条插入检测，结果为：滴试10μg/L大观霉素和庆大霉素；40μg/L链霉素和双氢链霉素；250μg/L新霉素时，试纸上显示出肉眼可见的五条红色条线，呈阴性；当滴试20、40μg/L大观霉素和庆大霉素；80、160μg/L链霉素和双氢链霉素；500、1000μg/L新霉素时，试纸质控线显色，检测线（T1）不显色，检测线（T2）不显色，检测线（T3）不显色，检测线（T4）不显色，呈阳性。表明，本试纸条检测灵敏度分别为：大观霉素20μg/L、链霉素80μg/L、双氢链霉素80μg/L、庆大霉 素20μg/L、新霉素500μg/L。 

（二）特异性试验 

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。本试纸条检测灵敏度分别为：大观霉素20μg/L、链霉素80μg/L、双氢链霉素80μg/L、庆大霉素20μg/L、新霉素500μg/L。将牛奶中常检的其他药物（林可霉素、诺氟沙星、氯霉素、四环素）用pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用实施例1中所述的试纸条进行检测，结果显示林可霉素、诺氟沙星、氯霉素、四环素在500μg/L浓度时，试纸一条质控线和四条检测线均显色，可以得出本试纸条未对这些药物发生交叉反应。 

实施例3、试纸条的应用 

一、用实施例1中所述试纸条检测牛奶中大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素 

本发明的试纸条可以检测牛奶样品。一般的检测方法如下： 

1、检测方法 

将盖在微孔条上的微孔塞揭掉，向包含有微孔试剂的微孔条中滴加需检测的样品溶液，得到微孔试剂和样品溶液的混合溶液11，混匀后，孵育5min，将试纸12有MAX线标记端朝下插入微孔条中，在5min内观看结果，如图7所示。 

2、检测结果判定 

若待检样品液中大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素的含量高，则扩散过程中待测样品液中的大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上大观霉素-载体蛋白偶联物结合或链霉素-载体蛋白偶联物结合或庆大霉素-载体蛋白偶联物结合或新霉素-载体蛋白偶联物的结合，相对应的大观霉素检测线或链霉素检测线或庆大霉素检测线或新霉素检测线不能显色，而抗抗体则可与大观霉素金标抗体或链霉素金标抗体或庆大霉素金标抗体或新霉素金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中大观霉素或链霉素或庆大霉素或新霉素的含量低或者无，则对应的大观霉素金标抗体或链霉素金标抗体或庆大霉素金标抗体或新霉素金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而大观霉素金标抗体会与反应膜上大观霉素-载体蛋白偶联抗原结合或链霉素金标抗体会与反应膜上链霉素-载体蛋白偶联抗原结合或庆大霉素金标抗体会与反应膜上庆大霉素-载体蛋白偶联抗原结合或新霉素金标抗体会与反应膜上新霉素-载体蛋白偶联抗原结合，对应的大观霉素检测线显色或链霉素检测线显色或庆大霉素检测线显色或新霉素检测线显色，同时抗抗体也可与大观霉素金标抗体或链霉素金标抗体或庆大霉素金标抗体或新霉素金标抗体结合，质控线显色；如果质控线不显色，则试纸条失效。 

阴性（-）：C线显色，四条T线均显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样本中大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素浓度均低于检测限，如图8.a所示。 

阳性（+）：C线显色，T1线不显色，表示牛奶样本中大观霉素浓度等于或高于检测限；C线显色，T2线不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限；            C线显色，T3线不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限；            C线显色，T4线不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限，如图8.a-8.f所示。 

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，如图8.g-8.k所示。 

下面具体举例：  

1、假阳性率测定 

取经过仪器方法确证的阴性牛奶样品50份，编号为1#-50#，将样品用本发明试纸条进行检测，计算其假阳性率。 

结果：在50份阴性牛奶样品测定中，试纸条检测结果为全部阴性，本发明试纸条假阳性率为0。 

2、假阴性率测定 

取经仪器方法确证的阴性牛奶样品50份，分别按规定的检测限浓度添加大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素，将样品用本发明试纸条进行检测，计算其假阴性率。 

结果：在50份阳性牛奶样品的测定中，试纸条检测出的阴性样品为0份，假阴性率为0。  

本发明的检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条可以同时对大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素残留进行快速检测。