β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法、系统及其应用

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体而言，涉及β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法、系统及其应用。 

背景技术

β-内酰胺类抗生素包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂等，由于其具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点，在临床上得到了广泛的使用。 

耐药性（Resistanceto Drug）又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。 

微生物对抗生素产生耐药的机制包括:(1)细胞膜通透性的改变,使抗生素不能,或很少透入微生物体内到达作用靶位;(2)灭活酶或钝化酶的产生,如产生β-内酰胺酶,使抗生素失效;(3)与抗生素结合靶位(亲和力)的改变,使抗生素的作用下降;(4)其他,如主动外排系统(泵出机制)等。其中由β-内酰胺酶介导的抗生素耐药性发展迅速。对由该机制引起的β-内酰胺类抗生素耐药性的检测受到广泛的关注。 

相关技术中，由于β-内酰胺酶的分解作用导致β-内酰胺类抗生素产生的耐药性，体外检测的方法包括手工方法和自动化仪器法， 在手工方法中普遍采用纸片扩散法，在自动化仪器法中常采用比浊法。 

纸片扩散法是将含有定量β-内酰胺类抗生素的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，β-内酰胺类抗生素的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。 

比浊法是将抗生素干燥固化在样本板上，板子有64-100个孔，可以放置20-50个不同浓度的抗生物底物。将含有细菌的肉汤加载在板子上，在自动化仪器上进行浊度的读取。透明为敏感，有浊度为耐药（有细菌生长）。时间为6-24小时，个别需48小时。 

上述纸片扩散法和比浊法均存在以下问题：检测过程中受到微生物浓度、纯度和操作者操作技术高低等多种因素的影响，检测准确度低，检测时间长。 

发明内容

本发明的目的在于提供微生物对β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法、系统及其应用，以解决上述的问题。 

在本发明的实施例中第一方面提供了一种β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法，包括： 

制备浓度为0.5-0.6麦氏单位的待测微生物的悬浊液； 

将所述待测微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液按照体积比1:1-1:2的比例混合均匀，静置20-30分钟，得到混合液； 

从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液； 

获取所述待测液的液相色谱图； 

若液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药； 

若液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

具体地，所述β-内酰胺类抗生素的标准液包括： 

浓度为敏感标准浓度的β-内酰胺类抗生素标准液、浓度为中介耐药浓度的β-内酰胺类抗生素标准液和耐药标准浓度的β-内酰胺类抗生素标准液； 

所述混合液包括：所述待测微生物的悬浊液分别与所述敏感标准浓度、所述中介耐药浓度和所述耐药标准浓度的β-内酰胺类抗生素标准液混合得到的三种混合液； 

所述待测液包括：将上述三种混合液分别除去所述待测微生物，得到对应敏感标准浓度的敏感待测液、对应中介耐药浓度的中介待测液、对应耐药标准浓度的耐药待测液； 

获取所述待测液的液相色谱图包括：分别获取上述三种待测液的液相色谱图； 

所述判定包括： 

若所述三种待测液的液相色谱图中，均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药； 

若所述三种待测液的液相色谱图中，均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰但均不包含β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

进一步地，判定还包括： 

若所述三种待测液的液相色谱图中，所述敏感待测液的液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，而所述中介待测液和耐药待测液的液相色谱图中，均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰但均不包含β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素中度敏感。 

更进一步地，所述判定还包括： 

若所述三种待测液的液相色谱图中，所述敏感待测液和所述中介待测液的液相色谱图中，均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，而所述耐药待测液的液相色谱图中，包含β-内酰胺类抗生素的标志峰但不包含β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素中介耐药。 

进一步地，所述判定步骤之后，还包括： 

将液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片进行质谱检测，得到β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数或β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数； 

将所述β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素即为β-内酰胺类抗生素，按照权利要求1所述的检测方法得到的判定结果正确；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素非β-内酰胺类抗生素，按照权利要求1所述的检测方法得到的判定结果错误，需重新判定； 

将β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数分别与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片即为β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片，按照权利要求1所述的检测方法得到的判定结果正确；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片非β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片，按照权利要求1所述的检测方法得到的判定结果错误，需重新判定。 

具体地，所述从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液，包括： 

在所述混合液中加入缓冲液，杀灭所述微生物，过滤除掉微生物后，向滤液中加入电离液，获得β-内酰胺类抗生素的离子溶液，将所述β-内酰胺类抗生素的离子溶液作为待测液。 

本发明实施例第二方面提供了β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法在临床治疗选择β-内酰胺类抗生素中的应用。 

本发明实施例第三方面提供了β-内酰胺类抗生素耐药性的检测系统，包括： 

液相色谱仪和处理器； 

所述液相色谱仪用于获取待测液的液相色谱图；所述待测液按照如下方法制备： 

制备待测微生物的悬浊液； 

将所述待测微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液按照体积比1:1-1:2的比例混合均匀，静置20-30分钟，得到混合液； 

从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液； 

所述处理器用于对所述待测液的液相色谱图进行分析， 

若液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药； 

若液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

进一步地，所述检测系统还包括：质谱仪； 

所述质谱仪用于获取所述液相色谱仪分离得到的β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数或β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数； 

所述处理器进一步用于： 

将所述β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素即为β-内酰胺类抗生素；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素非β-内酰胺类抗生素； 

将β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数分别与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片即为β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片非β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片。 

本发明实施例第四方面提供了β-内酰胺类抗生素耐药性的检测系统在临床治疗选择β-内酰胺类抗生素中的应用。 

本发明实施例提供的微生物对β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法、系统及其应用，与现有技术中的纸片扩散法和比浊法测定β-内酰胺类抗生素的耐药性的方法相比，其通过使用液相色谱技术，定性的检测β-内酰胺类抗生素在β-内酰胺作用下的抗生素的分解产物，从而判断微生物对β-内酰胺类抗生素耐药性。由于使用液相色谱仪，因此检测过程中不受微生物浓度、纯度和操作者操作技术高低等的影响，而且由于液相色谱仪的选择性高，因此本发明提供的检测方法灵敏度高，准确度高；同时，由于液相色谱仪的自动化程度高，可同时检测多种抗生素的耐药性，因此，检测速度快；此外，由于液相色谱仪的高灵敏性、高特异性、可数据传输等特点，使检测时间短，仅需2小时即可完成，而且相对于相关技术的检测方法，本发明实施例提供的检测方法使用的微生物量少，不需多次传代培养，整个实验的时间大大减少，从而能够对临床尽早快速用药提供及时的依 据，尤其是重症感染病人，而且由于检测时间大大减少，耗材成本低廉。 

附图说明

图1示出了实施例1提供的头孢噻肟及其碎片的液相色谱图； 

图2示出了实施例1提供的头孢噻肟及其碎片的质谱图； 

图3示出了实施例2提供的头孢他啶及其碎片的液相色谱图； 

图4示出了实施例2提供的头孢他啶及其碎片的质谱图。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。 

本发明实施例提供了一种β-内酰胺类抗生素耐药性的检测方法，包括： 

制备浓度为0.5-0.6麦氏单位的待测微生物的悬浊液； 

将所述待测微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液按照体积比1:1-1:2的比例混合均匀，静置20-30分钟，得到混合液； 

从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液； 

获取所述待测液的液相色谱图； 

若所述液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药； 

若所述液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

本发明实施例中，待测微生物可以按照如下方法获取：首先按照常规方法选择被感染的样品，并对样品进行处理，然后将处理后 的样品放入培养基中培养，培养后长出来的微生物即为待检测的微生物。 

如本领技术人员可以理解的，还可以采用本领域的常规方法获取待测微生物。 

本发明实施例中，获取待测微生物之后，将待测微生物悬于生理盐水中，制成浓度为0.5-0.6麦氏单位的待测微生物的悬浊液。使该浓度范围内的待测微生物的悬浊液，得到的结果准确，不会出现误判。 

如本领域技术人员可以理解的，在抗生素耐药性或敏感性检测中，还可以选择本领域的常规的待测微生物的悬浊液的浓度。 

本发明实施例中，将所述待测微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液按照体积比1:1-1:2的比例混合均匀，静置20-30分钟，得到混合液。微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液的体积比太小或静置的时间太短，则可能导致没有足够多的β-内酰胺类抗生素分解碎片产生，影响液相色谱检测的灵敏度，进而影响抗生素耐药性的判读结果；微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液的体积比太大或混合后静置的时间太长，则可能导致其中的β-内酰胺类抗生素完全被β-内酰胺酶分解，使液相色谱图中无法得到抗生素的标志峰，从而影响判读。 

本发明实施例中，为了能够为后续的检测结果提供对照，本发明提供对照试验的方法，具体为： 

在上述微生物悬浊液中加入克拉维酸，由于克拉维酸是β-内酰胺酶的抑制剂，能够抑制该酶的活性，使β-内酰胺类抗生素不会被β-内酰胺酶分解，产生抗生素的分解碎片，因此，当待测微生物的悬浊液中加入克拉维酸时，液相色谱图中不会出现抗生素分解碎片 峰。将其作为不含有克拉维酸的对照，从而增加检测的准确度和可信度。 

本发明实施例中，得到混合液之后，从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液；由于待测液需要进入液相色谱仪，获取待测液的液相色谱图，因此，得到混合液之后，需要去除其中的固体微生物，同时，待测液在进入液相色谱仪之前还需要进行液相色谱样品的常规处理。 

本发明实施例中，将待测液进入液相色谱仪中，获取液相色谱图。具体可以按照本领域的常规方法进行操作。 

通过液相色谱检测，获得液相色谱图，可以定性的得知是否有碎片峰，进而得知抗生素是否被分解，进一步判断待测微生物是否对抗生素有耐药性。 

当通过上述液相色谱定性检测分析，得到的分离物质包含β-内酰胺类抗生素，而不包含β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺作用的碎片时，则微生物对β-内酰胺类抗生素敏感；当得到的分离物质即包含β-内酰胺类抗生素，又包含β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺作用的碎片时，则微生物对β-内酰胺类抗生素耐药。 

因为当微生物产生β-内酰胺酶且与β-内酰胺类抗生素接触时，由于β-内酰胺酶会分解β-内酰胺类抗生素，得到β-内酰胺类抗生素的分解片段，但是，由于微生物产生的β-内酰胺酶不能完全将抗生素分解，所以，在液相色谱检测过程中，当得到的色谱图存在抗生素的分解片段以及抗生素本身的标志峰时，说明微生物产生了β-内酰胺酶，且对该抗生素具有β-内酰胺作用，抗生素分解产生了碎片，进而，可以得到结论，微生物对该抗生素耐药；而当得到的色谱图只存在抗生素本身的标志峰时，说明微生物未产生β- 内酰胺酶，未对该抗生素进行分解，进而，可以得到结论，微生物对该抗生素敏感。 

本发明实施例中，通过分析所述液相色谱图进行判断。 

液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药； 

液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰，所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

本发明实施例中所提到的β-内酰胺类抗生素包括青霉素（阿莫西林、氨苄西林、羧苄西林）、头孢菌素、碳青霉烯类抗生素、头霉素、单内酰环类抗生素、β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类抗生素。 

本发明实施例中，通过采用液相色谱技术，通过检测β-内酰胺类抗生素的分解产物，判断微生物对β-内酰胺类抗生素的敏感性或耐药性。 

相关技术中，本领域技术人员致力于从微生物本身的变化或微生物的代谢物等检测抗生素的耐药性，还没有与本发明实施例提供的检测方法相关的报道。本发明实施例提供的β-内酰胺类抗生素耐药性的检测系统，提供了一种检测β-内酰胺类抗生素耐药性的全新的思路及技术方案，本发明不再从微生物本身的变化或微生物的代谢物等方面考虑或解决问题，而是从β-内酰胺类抗生素是否产生分解产物，通过检测该分解产物的角度，检测β-内酰胺类抗生素的耐药性。 

采用本发明实施例提供的思路和技术方案，利用液相色谱技术，使β-内酰胺类抗生素耐药性的检测过程中不再受到微生物浓度、纯度和操作者操作技术高低等的影响，而且由于液相色谱仪的选择性高，因此本发明提供的检测方法灵敏度高，准 确度高；同时，由于液相色谱仪的自动化程度高，可同时检测多种抗生素的耐药性，因此，检测速度快；此外，由于液相色谱仪的高灵敏性、高特异性、可数据传输等特点，使检测时间短，仅需2小时即可完成，而且相对于相关技术的检测方法，本发明实施例提供的检测方法使用的微生物量少，不需多次传代培养，整个实验的时间大大减少，从而能够对临床尽早快速用药提供及时的依据，尤其是重症感染病人，而且由于检测时间大大减少，耗材成本低廉。 

当判断出抗生素的耐药性与否后，就可以利用其在临床治疗选择β-内酰胺类抗生素。 

例如，当待测微生物对抗生素有耐药性，则临床上的诊断建议为不选择该抗生素；当待测微生物对抗生素敏感，则临床上的诊断建议为选择该抗生素。 

为了能够更准确的判读待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药性，本发明实施例提供的方法，优选当所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为敏感标准浓度、中介耐药浓度和耐药标准浓度时，判断待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药性的方法。其中，β-内酰胺类抗生素标准液的浓度是按照2010CLSI标准的规定，选择敏感标准浓度、中介耐药浓度和耐药标准浓度。 

当所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为敏感标准浓度、中介耐药浓度和耐药标准浓度时，得到的所述液相色谱图均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，则所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药。 

当所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为敏感标准浓度、中介耐药浓度和耐药标准浓度时，得到的所述液相色谱图均包含β- 内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺作用的碎片峰，则所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

当所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为敏感标准浓度，得到的所述液相色谱图包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰；所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为中介耐药浓度和耐药标准浓度，得到的所述液相色谱图均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰时，所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素中度敏感； 

当所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为敏感标准浓度和中介耐药浓度，得到的所述液相色谱图均包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰；所述β-内酰胺类抗生素的标准液的浓度为耐药标准浓度，得到的所述液相色谱图包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰时，所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素中介耐药。 

通过利用上述详细的判读待测微生物对β-内酰胺类抗生素的耐药性的结果，可以给出更加明确的、更加具有针对性的临床诊断建议： 

例如，当判读结果为中度敏感时，诊断建议可以为：可以选用该抗生素，但需要加大使用量。 

液相色谱仪检测β-内酰胺类抗生素的分解产物，是一种定性方法，为了进一步确认通过液相色谱检测判读的抗生素或抗生素及其分解产物即为该抗生素或抗生素及其分解产物，本发明实施例提供的检测方法，优选在获取所述液相色谱图，判断所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素的耐药性的步骤之后，还包括： 

质谱分析，验证液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片。 

利用质谱分析计算物质的质量数，定量的判断物质的种类。从而使抗生素耐药性的判读结果更加准确，可信度更高。 

其中，本发明实施例提供的质谱分析，采用如下方法： 

将液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素进行质谱检测，得到β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数；或将液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片进行质谱检测，得到β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数； 

将上述得到的质量数与抗生素标准谱图进行比对，验证液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素，或，β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片。 

其中，抗生素的标准谱图是人们通过大量的实验获得的，可以作为比对的标准。在抗生素的标准谱图中，显示抗生素的标志峰的出峰时间和峰强度等，以及抗生素在β-内酰胺作用下得到的碎片峰的出峰时间和峰强度等。具体可以按照如下方法进行判定： 

将所述β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素即为β-内酰胺类抗生素；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素非β-内酰胺类抗生素； 

将β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数分别与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰 胺作用的碎片即为β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片非β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片。 

如本领域技术人员可以理解的，该比对过程可以人工进行，也可以通过仪器自动进行。 

通过将质谱得到的物质的质量数与抗生素标准谱图中的质量数进行比对，验证液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片。使抗生素耐药性的判读结果更加准确。 

本发明实施例中，质谱分析可以采用离子源质谱仪，将待测液中的抗生素电离成阴阳离子，质谱仪通过分析计算阳离子的质量数判断抗生素或抗生素和分解碎片的种类。采用离子源质谱仪时，所述从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液，可以采用如下方法： 

在上一步骤中得到的混合液中加入缓冲液，杀灭待测微生物，过滤除掉该微生物后，向滤液中加入电离液，获得β-内酰胺类抗生素的离子溶液，将所述β-内酰胺类抗生素的离子溶液作为待测液。 

其中，缓冲液和电离液均使用本领域的常规选择。 

本发明实施例提供的β-内酰胺类抗生素耐药性的检测系统，包括： 

液相色谱仪和处理器； 

所述液相色谱仪用于获取待测液的液相色谱图；所述待测液按照如下方法制备： 

制备待测微生物的悬浊液； 

将所述待测微生物的悬浊液与β-内酰胺类抗生素的标准液按照体积比1:1-1:2的比例混合均匀，静置20-30分钟，得到混合液； 

从所述混合液中除去所述待测微生物，得到待测液； 

所述处理器用于对所述待测液的液相色谱图进行分析， 

若液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰及其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素耐药； 

若液相色谱图中包含β-内酰胺类抗生素的标志峰，但不包含其β-内酰胺作用的碎片峰，则判定所述待测微生物对β-内酰胺类抗生素敏感。 

为了能够定量的判断液相色谱分离得到的抗生素或抗生素及其分解碎片的种类。从而使抗生素耐药性的判读结果更加准确，可信度更高。本发明实施例提供的β-内酰胺类抗生素耐药性的检测系统，进一步包括：质谱仪； 

所述质谱仪用于获取所述液相色谱仪分离得到的β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数；或，所述质谱仪用于获取所述液相色谱仪分离得到的β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数； 

所述处理器进一步用于： 

将所述β-内酰胺类抗生素的标志峰的质量数与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素即为β-内酰胺类抗生素；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素非β-内酰胺类抗生素； 

将β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数分别与所述抗生素标准谱图中的β-内酰胺类抗生素的标志峰质量数及其β-内酰胺作用的碎片峰的质量数进行比对，相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片即为β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片；不相同时，则判定液相色谱分离得到的β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片非β-内酰胺类抗生素及其β-内酰胺作用的碎片。 

通过质谱对物质的质量数进行分析，对液相色谱得到的抗生素或抗生素及其分解碎片的种类进行了定量的验证。 

本发明实施例提供的上述β-内酰胺类抗生素耐药性的检测系统能够判断出微生物对抗生素的耐药或敏感性，根据该耐药或敏感结果，医生可以做出是否选择该抗生素治疗被该微生物感染的疾病。当根据本发明实施例提供的检测系统，得到的结果如果是：被检测的微生物对抗生素耐药，则不能选择该抗生素治疗被该微生物感染的疾病；得到的结果如果是：被检测的微生物对抗生素敏感，则可以选择该抗生素治疗被该微生物感染的疾病。 

实施例1，大肠杆菌对头孢噻肟耐药性的检测 

头孢噻肟参考分子量455.46，结构式如下： 

1、制备大肠杆菌的悬浊液 

将临床感染的血液稀释处理后，接种在普通营养琼脂培养平板上，培养分离处大肠杆菌后，挑取纯培养菌落，悬于生理盐水中，制成0.6麦氏单位的大肠杆菌悬浊液。 

2、制备待测液 

本发明实施例进行6个实验，具体按照表1中所示试剂制备混合液： 

表1混合液中试剂的配制比例 

在6个洁净的试管中分别按照表1加入试剂，静置20min后，向每个试管中分别加入缓冲液杀灭其中的大肠杆菌。将上述混合物离心后取上清液，作为待测液。 

3、液相色谱分离 

将上述得到的待测液作为样品，采用下述液相色谱条件，获取待测液的液相色谱图。色谱条件：C18色谱柱；流动相：A：10mmol/L甲酸铵、B：乙腈；洗脱梯度：0分钟时A、B的体积比为95:5；8分钟时A、B的体积比为9：1，20分钟时A、B的体积比为8:2；流量：0.4ml/min；检测器：DAD及MSD检测器；检测波长：265nm；进样量20ul。 

实验1-3的液相色谱图均如图1所示。从图1中可以看出，除了峰1外还出现了一个峰2，说明被待测液中含有抗生素的分解片段，进一步说明待检测的微生物大肠杆菌产生了β-内酰胺酶，大肠杆菌的悬浊液与头孢噻肟的标准液混合后，发生了头孢噻肟的分解反应。 

实验4-6得到的液相色谱图中只包含峰1，无峰2出现（未给出色谱图）。 

4、质谱分析计算分子量 

将试验1-3中液相色谱分离得到的抗生素分解产物和抗生素作为样品，采用自动进样系统将上述样品加入质谱仪中，质谱采用下述条件对样品的质量进行精确的计算：离子源为电喷雾离子源，扫描方式：正离子扫描；喷雾器压力：30PSI；目标离子：456m/z，目标碎片：m/z285碎片，检测离子对：m/z456.1/285.1，且为定性离子对。结果均如图2所示。从图2可以看出，峰1的质量数为456.1，峰2的质量数为285.1。 

5、将质谱计算得到的特征峰的质量数和谱图库中的相关数据均输入到自动分析系统，对其进行比对，判断质谱得到的特征峰是否为头孢噻肟的标志峰及β内酰胺作用的碎片峰。 

谱图库中头孢噻肟及β内酰胺作用特征碎片的数据如表2所示。 

表2孢噻肟及β内酰胺作用特征碎片在谱图库中的数据 

从表2可以看出，头孢噻肟谱图库中，加合物分子离子峰的质量为456.1，β内酰胺作用特征碎片峰质量为285.1。 

与图2中得到的峰的质量数相比较，可以知道，图2中，峰1为头孢噻肟的标志峰，峰2为β-内酰胺作用特征碎片峰。 

根据β-内酰胺作用的原理，可知，大肠杆菌对头孢噻肟有耐药性。则根据该耐药结果，临床上不选择头孢噻肟来抑制大肠杆菌。 

实施例2，大肠杆菌对头孢他啶耐药性的检测 

头孢他啶参考分子量546.58，结构式如下： 

1、制备大肠杆菌悬浊液 

将临床感染的血液稀释处理后，接种在普通营养琼脂培养平板上，培养分离处大肠杆菌后，挑取纯培养菌落，悬于生理盐水中，制成0.6麦氏单位的大肠杆菌悬浊液。 

2、制备检测样品 

本发明实施例进行6个实验，具体按照表3中所示试剂制备混合液： 

表3混合液中试剂的配制比例 

在6个洁净的试管中分别按照表2加入试剂，静置30min后，向每个试管中分别加入缓冲液杀灭其中的大肠杆菌。将上述混合物离心后取上清液，作为待测液。 

3、液相色谱分离 

将上述得到的待测液作为样品，采用下述液相色谱条件，获取待测液的液相色谱图。色谱条件：C18色谱柱；流动相：乙腈-乙酸铵水溶液（乙酸铵与水按照体积比为15：85进行混合）；流量：1.0ml/min；检测器：DAD检测器；检测波长：255nm；进样量40ul。检测在 

实验1-3的液相色谱图均如图3所示。从图3中可以看出，除了峰1外还出现了一个峰2，说明被检测的样品中含有抗生素的分解片段，进一步说明待检测的微生物大肠杆菌产生了β-内酰胺酶，大肠杆菌的悬浊液与头孢他啶的标准液混合后，发生了头孢他啶的分解反应。 

实验4-6得到的液相色谱图中只包含峰1，无峰2出现（未给出色谱图）。 

4、质谱仪分析计算分子量 

将试验1-3中液相色谱分离得到的抗生素分解产物和抗生素作为样品，采用自动进样系统将上述样品加入质谱仪中，质谱仪采用下述条件对样品的质量进行精确的计算：离子源为电喷雾离子源，扫描方式：正离子扫描；喷雾器压力：40PSI；目标离子：548m/z，目标碎片：m/z267碎片，检测离子对：m/z550.2/269.1。结果均如图4所示。从图4可以看出，峰1的质量数为550.2，峰2的质量数为269.1。 

5、将质谱仪计算得到的特征峰的质量数和谱图库中的相关数据均输入到自动分析系统，对其进行比对，判断质谱得到的特征峰是否为头孢他啶的标志峰及β内酰胺作用的碎片峰。 

谱图库中头孢他啶及β内酰胺作用的碎片峰的数据如表4所示。 

表4头孢他啶及β内酰胺作用特征碎片的谱图库数据 

从表4可以看出，头孢他啶谱图库中，加合物分子离子峰的质量为550.2，β内酰胺作用特征碎片峰质量为269.1。 

与图4中得到的峰的质量数相比较，可以知道，图4中，峰1为头孢他啶的标志峰，峰2为β-内酰胺作用的碎片峰。 

根据β-内酰胺作用的原理，可知，大肠杆菌对头孢他啶有耐药性。则根据该耐药结果，临床上不选择头孢他啶来抑制大肠杆菌。 

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。