甘露葡萄糖醛酸寡糖在制备治疗或预防帕金森病和/或老年痴呆药物和/或保健品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及甘露葡萄糖醛酸寡糖在治疗帕金森病和老年痴呆药物中的应用。 

背景技术

随着人类平均寿命的逐年增加，世界正步入全球老龄化时代。与年龄有关的神经退化性疾病也随之增加，在中枢神经系统方面，主要表现为兴奋与抑制过程减弱，大脑功能降低，记忆力减退和丧失，随后出现识别功能的进行性减退和情绪紊乱的加重等。帕金森病又称震颤麻痹，是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病，帕金森病的主要病理特征是是因位于中脑部位"黑质"中的细胞发生病理性改变后，多巴胺的合成减少，抑制乙酰胆碱的功能降低，则乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了“震颤麻痹”。最新资料表明，中国有170万帕金森病患者，其中55岁以上的人群中每100人就有1个帕金森病人，估计每年新增帕金森病人约10万人。帕金森病对患者、家庭和社会都带来巨大的压力，使得全世界对其给予众多的关注，帕金森病的治疗药物研究成为老年医学领域中的一个重要课题。 

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease）即所谓的老年痴呆症，又称阿兹海默病。是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。据中国阿尔茨海默病协会2011年的公布调查结果显示，全球有约3650万人患有痴呆症，每7秒就有一个人患上此病，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的“四大杀手”之一。 

近年来，糖类药物从其药效和安全性方面考虑，其发展趋势逐渐从对多糖的研究转到对低聚糖和寡糖的研究。寡糖在医疗保健领域具有巨大的需求空间。寡糖类药物结构均一，质量可控，作用机制明确，已经成为糖类药物的主攻方向之一。中国海洋大学已报道还原端为羧基的寡聚甘露糖醛酸HS971具有显著的改善记忆和抗老年痴呆效果，临床上拟用于老年痴呆症的预防和治疗。 

本专利报道了由甘露糖和葡萄糖醛酸组成的甘露葡萄糖醛酸寡糖在细胞和动物实验中对帕金森病和老年痴呆症具有显著的治疗作 用，可以应用于帕金森病和老年痴呆的预防和治疗。 

发明内容

甘露葡萄糖醛酸寡糖在制备预防和治疗帕金森病药物或老年痴呆药物和保健品中的应用。所述的甘露葡糖醛酸寡糖具有如下特征： 

（1）组成糖：甘露糖和葡糖糖醛酸或其盐； 

（2）2-连接的甘露糖和4-连接的葡萄糖醛酸或其盐交替连接； 

（3）其结构式为下述一般式（I）或（II） 

式中，R为H或Na，K等无机盐，n为0-8之间的整数 

式中，R为H或Na，K等无机盐，n为0-8之间的整数 

（II） 

所述药物为含有甘露葡萄糖醛酸寡糖和药学可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。 

载体包括海藻酸钠微球、脂质体等。 

赋形剂：如甘露醇、硬脂酸镁、淀粉、环糊精等。 

所述药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。 

本发明具有如下优点： 

甘露葡萄糖醛酸寡糖对帕金森病和老年痴呆具有预防和治疗作用，毒副作用小，安全有效，可以用于制备治疗帕金森病和老年痴呆的药物和保健品。 

附图说明

图1寡糖的制备过程中酒精洗脱液的凝胶色谱图； 

图2甘露葡萄糖醛酸寡糖G1-G4的ESI-MS和HPLC图；a为G4；b为G3；c为G2；d为G1； 

图3G2的氢谱； 

图4G2的碳谱； 

图5G2的二维HMBC谱图； 

图6G2的二维HSQC谱图； 

图7G2的二维TOCSY谱图； 

图8G3的氢谱； 

图9G3的碳谱； 

图10G4的氢谱； 

图11G4的碳谱； 

图12甘露葡萄糖醛酸寡糖G2对痴呆小鼠避暗实验的错误次数和潜伏期的影响； 

图13甘露葡萄糖醛酸寡糖G2对痴呆小鼠水迷宫避暗实验的错误次数和潜伏期的影响； 

图14甘露葡萄糖醛酸寡糖G2对痴呆小鼠海马乙酰胆碱转移酶活性的影响； 

图15甘露葡萄糖醛酸寡糖G2对痴呆小鼠海马乙酰胆碱酯酶活性的影响。 

具体实施方式

下面用实施例对本发明进行具体说明，不过本发明并不只限于以下实施案例范围。 

实施例1甘露葡萄糖醛酸寡糖的制备 

将干海带采用30倍质量的蒸馏水100℃下提取3小时，提取液经过过滤，浓缩后，加乙醇至终浓度为75%沉淀，静置12小时后收集沉淀，沉到经真空干燥得到海带多糖。将海带多糖样品溶于质量浓度为4%的硫酸溶液中（料液比为60mg/mL）加热回流5小时，用氢氧化钡中和至PH=6-7，离心，上清液浓缩至原始体积的五分之一，浓缩液上活性炭柱层析，首先用蒸馏水平衡，然后用50%-90%乙醇梯度洗脱，将50%-90%乙醇洗脱液浓缩至原始体积的五分之一，蒸去乙醇，直接上Bio-gel P4柱层析，分离得到六个组分(图1)，对上面收集得到的样品进行ESI-MS和HPLC分析（图2）。NMR（图3-11） 结果进一步确认寡糖的结构。结果显示，G1-G4分别为甘露葡萄糖醛酸八糖，六糖，四糖和二糖。其结构均符合下图所示的结构式： 

其中G1为甘露葡萄糖醛酸八糖，式中n=3 

G2为甘露葡萄糖醛酸六糖，式中n=2 

G3为甘露葡萄糖醛酸四糖，式中n=1 

G4为甘露葡萄糖醛酸二糖，式中n=0 

实施例2：甘露葡萄糖醛酸寡糖对MPP⁺损伤的神经细胞的保护作用 

神经毒素MPTP在帕金森病（PD）的研究中被广泛应用，进人体内的MPTP被单胺氧化酶B转化成MPP^＋，抑制线粒体电子传递链的NADH CoQ还原酶(复合物I)，从而使细胞内ATP减少，氧自由基形成，启动凋亡，最终导致细胞死亡。PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，广泛用于神经系统疾病的体外研究，在帕金森病的研究中被广泛应用。由于培养的细胞株不存在单胺氧化酶，所以直接加入MPP ^＋，模拟MPTP造成帕金森病的细胞模型。本发明以细胞存活率为指标，研究了甘露糖醛酸寡糖对MPP⁺损伤的神经细胞PC12细胞的保护作用，以探讨甘露糖醛酸寡糖治疗帕金森病的可能性。 

材料：人成神经细胞瘤细胞株PC12细胞购自中科院上海生物化学和细胞生物学研究所。采用含10％胎牛血清、100U／mL青霉素和100U／mL链霉素的DMEM高糖培养液(Invitrogen)，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养。甘露糖醛酸寡糖采用实施例1所制备样品。 

方法：试验分为对照组、MPP⁺损伤组、各寡糖样品对正常细胞处理组和各寡糖样品对MPP⁺损伤PC12细胞作用组，寡糖样品处理浓度分别采用10、100和1000μg/ml，每组8孔，37℃、含5％CO₂培养箱中孵育24h和48h后更换新鲜培养液180μL，加入20mL MTT(5mg／mL，Sigma)，4h后加入200μL二甲基亚砜(DMSO，Sigma)， 振摇10分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定550nm处光密度值(OD)。 

表1为各寡糖对MPP+损伤的神经细胞的保护作用的结果。上述MTT测定结果提示，MPP+对细胞的损伤率为(49.50±5.48)%。测试的四个甘露葡萄糖醛酸寡糖均对MPP+诱导的神经细胞损伤具有明显的修复作用，细胞活力有均有明显改善，体系出良好的神经保护作用。PC12细胞是DA能的成神经细胞瘤细胞株，能很好地代表中脑黑质区DA能神经元的各种生理特点，因此在帕金森病的研究中被广泛应用。各甘露糖醛酸寡糖能够保护PC12细胞免于MPP⁺损伤，说明其具有神经细胞保护作用，可以用于帕金森病的预防和治疗。 

表1甘露葡萄糖醛酸寡糖对MPP⁺损伤的PC12细胞的神经保护作用 

注：MPP⁺对PC细胞的损伤率为(49.50±5.48)% 

实施例3甘露葡萄糖醛酸寡糖对β-淀粉样肽损伤的神经母细胞瘤株SH－SY5Y的保护作用 

材料：SH-SY5Y细胞株；Aβ_25－35片断由首都医科大学合成，高效液相色谱法纯化，纯度98％以上，无血清MEM配成溶液，0.22μm虑膜抽滤，－20℃保存。甘露糖醛酸寡糖采用实施例1所制备样品。 

试验方法：细胞培养条件为MEM(Gibco BRL，41500-067)培养基中加入10％胎牛血清(Hyclone，SH30070.03)、15mmol.L^-1HEPES(DNN company)、青霉素1x10⁵IU.L^-1、链霉素1x10⁵IU.L^-1，5％CO₂，37℃，每周换液两次，传代一次。 

MTT代谢率测定：将SY5Y细胞以密度为1×10³个细胞接种于96孔板(Costar产品)，3天后分为对照组、Aβ_25－35组和Aβ_25－35+P2组（10、40、80μg/ml）、Aβ_25－35+各寡糖（10、100、1000μg/ml）药物组，每组8孔。接种后24小时每孔加MTT(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，吸出培养液，每孔加入DMSO200μl，振摇10分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定550nm处光密度值(OD)。 

结果：如表1所示，甘露糖醛酸寡糖G1-G4在三个浓度时均能显著对抗20μM Aβ_25－35毒性，提高培养细胞MTT代谢率，而且随着样品浓度增加其活性逐渐增强，结果表明甘露糖醛酸寡糖能够保护神经细胞SY5Y对抗Aβ_25－35毒性，具有显著的神经保护作用。神经细胞凋亡在神经细胞损伤中起十分重要的作用，药物可通过干预凋亡过程阻止其进一步发展，对神经细胞起到保护作用。SH-SY5Y细胞来源于人的神经母细胞瘤，其形态和生理功能与正常神经元相似，呈锥形，且具有明显的轴突，是目前国际上研究神经细胞功能较好的一种细胞。甘露糖醛酸寡糖对SY5Y细胞具有神经保护作用，表明甘露糖醛酸寡糖可以用于神经系统疾病如帕金森病和老年性痴呆的治疗。 

表2甘露葡萄糖醛酸寡糖对Aβ损伤的SH-SY5Y细胞的神经保护作用 

注：Aβ对细胞的损伤率为(62.45±6.58)% 

实施例4：甘露糖醛酸寡糖G2对老年痴呆的作用 

实验动物：昆明种小鼠。在试验前，使平均体重约为22g的雄性KM小鼠自由获取饲料和水一周以适应实验室环境。 

材料：甘露葡萄糖醛酸寡糖G2，实施例1中制备。 

Aβ_1－40购自Sigma公司，将其溶于无菌生理盐水，配成1mg/ml浓度，密封后置于37℃培养箱中7天使之凝聚。 

试验方法：小鼠适应一周后，将其称重并随机分为5组，即对照组、模型组、甘露葡萄糖醛酸寡糖G2低、中、高（25、50、100mg/kg）三个剂量组，阳性对照药盐酸多纳哌齐(2.5mg/kg）组。除对照组外，向小鼠单侧脑室内注射Aβ_1－40。参照Maurice方法，以水合氯醛麻醉后，右侧脑室定位（A：－2mm；L：2mm；H：－4mm），垂直颅骨进针3mm，缓慢注射3μl/只的Aβ_1－40，对照组为等量的灭菌生理盐水。 

动物于术后第二天开始给予相应药物，给药量0.5ml/20g，对照组、模型组灌服等量生理盐水，每日1次，连续至实验结束。 

（1）小鼠避暗试验 

自Aβ_1－40造模后第9天进行避暗试验。该避暗装置分为明（25×25×16cm）暗（24×20×15cm）两个隔室，之间由一个拱门（8.9×11.4cm）相联，门可以由试验者根据需要关上或打开。隔室地板为不锈钢栅栏（3.175mm）。暗室一侧的栅栏地板与刺激器相联，并可给予电击，明室一侧则不与刺激器相联，故没有电流通过。将小鼠放入明室，10s后将明暗室之间的门打开。待小鼠（四肢）完全进入暗室后，立即将中门关上，并给予一次电击（电流为0.6mA）。让小鼠在暗室内停留10s，将小鼠放回笼内。电刺激训练24小时后，将小鼠放回明室，中门打开，记录5min内小鼠进入暗室的次数和潜伏期。 

（2）小鼠迷宫实验 

自Aβ_1－40造模后第12天进行水迷宫试验，为期五天。该迷宫共有5个盲端，试验第一天用一块黑色塑料板将迷宫分成两部分，使小鼠在只含有一个盲端的部分游泳；试验第二天，重新设置塑料板的位置，使小鼠在含有三个盲端的部分游泳；试验第三天至第五天除掉塑料板，使小鼠游完全程。分别记录其找到平台的潜伏期和到达盲端的错误次数。 

（3）皮层乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性测定 

行为学测试结束之后，小鼠断头取脑，于冰浴中迅速剥离海马组织，以预冷的生理盐水制成10％组织匀浆。按照试剂盒说明书操作，测定该组织的乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶活性。 

结果 

小鼠避暗试验 

1）由图12可以看出，Aβ模型组与对照组相比，小鼠潜伏期显著缩短，错误次数明显增多（p<0.05）。甘露葡萄糖醛酸寡糖G2的三个剂量组潜伏期和错误次数均较Aβ模型组有明显改善，其作用于阳性对照药盐酸多纳哌齐相当。 

2）小鼠迷宫试验 

由图13可以看出，模型组和对照组相比，小鼠找到平台的潜伏期及经过盲端的错误次数明显延长（p<0.05），表明Aβ_1－40单侧脑室注射致小鼠痴呆模型建立成功。随着训练时间的延长，小鼠潜伏期和错误次数逐渐缩短。从第三天开始，Aβ_1－40单侧脑室注射模型组与对照组以及甘露糖醛酸寡糖G2的三个剂量组相比，小鼠错误次数明显增多，其中甘露葡萄糖醛酸寡糖G2高浓度组小鼠潜伏期与模型组相比显著缩短。训练第四天，对照组和甘露葡萄糖醛酸寡糖G2的中、高剂量组与模型组相比潜伏期显著缩短，而阳性对照药盐酸多纳哌齐未显效，表明G2显效快。训练第五天，甘露葡萄糖醛酸寡糖G2的三个剂量组和盐酸多纳哌齐组同模型组相比，小鼠的潜伏期明显缩短和错误次数明显减少。 

3）海马乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶活性 

乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶分别是乙酰胆碱的分解酶和合成酶，两者共同调节脑内乙酰胆碱的含量。如图14所示，在海马组织中，盐酸多纳哌齐组和甘露葡萄糖醛酸寡糖G2的三个剂量组与Aβ_1－40单侧脑室注射模型组相比乙酰胆碱转移酶活性升高，但没有显著性。如图15所示对照组、盐酸多纳哌齐组和甘露葡萄糖醛酸寡糖G2三个剂量组与模型组相比，乙酰胆碱酯酶活性显著降低，而且值得说明的是前两组乙酰胆碱酯酶活性比对照组低约50％，说明中剂量的甘露葡萄 糖醛酸寡糖G2和盐酸多纳哌齐都能够显著抑制海马内乙酰胆碱的分解，从而提高海马内乙酰胆碱的含量。这可能是甘露葡萄糖醛酸寡糖G2改善Aβ_1－40单侧脑室注射造成AD症状的途径之一。 

结论：甘露葡萄糖醛酸寡糖G2能够Aβ_1－40损伤的小鼠的行为学指标，改善小鼠的记忆力，降低错误次数。提高乙酰胆碱转移酶活性，降低乙酰胆碱酯酶活性。具有显著的抗老年性痴呆作用。 

以上描述了本发明的具体实施例，然并非用以限定本发明，本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。