海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用。

背景技术

有机磷农药具有高效、低残留和使用成本低等特点是目前品种多，产量高和应用广泛的农用药剂。有机磷农药的使用在农业增产和疾病害虫媒介防治方面产生了巨大的经济效益和社会效益，但是拟除虫菊酯具有高效、广谱、对非靶标生物毒性相对较低等原因，已经作为有机氯农药和有机磷农药的替代品被广泛应用于农业生产，目前被广泛应用于果园、茶园、农田以及渔业养殖等害虫的防治。然而，残余的氯氰菊酯和溴氰菊酯可通过地表径流或养殖海域使用等途径进入水体，给环境、食品安全和人类健康带来极大危害，对渔业生产和生态环境造成影响。

目前生物修复法被公认为是一种有效、廉价、无二次污染的方法。生物修复（Bioremediation）属于生物降解，是指利用微生物或其他生物将存在于环境中的毒、害污染物降解或转化为其他无害物质的系统。因此，筛选不同类型的拟除虫菊酯类农药高效降解菌，对拟除虫菊酯类农药残留的生物修复和应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用，该降解菌可安全、高效、快速的降解海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯，使其降解率分别达75.6%和90.9%以上。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌，该菌为HS-10菌株，分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6044，该菌株的16S rDNA的Genbank登陆号为JX087926。

该菌株的生物学特征如下：革兰氏染色阴性，为杆菌，精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、柠檬酸盐试验、鸟氨酸脱羧试验、尿素酶试验阳性，V-P反应、H₂S反应、明胶液化实验阴性，可以利用蔗糖。

该菌株海水中生长，最适生长温度25-30 ℃，最适生长pH 为7.0-7.8，在固体培养基上，菌落圆形、凸起，边缘完整，呈灰白色，半透明。

一种海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤：

（1）培养基配制

将氯氰菊酯和溴氰菊酯混合溶液加入到营养培养基中，使氯氰菊酯和溴氰菊酯终浓度均为100mg/L，得到富集培养液；

（2）降解菌分离纯化

取500mL海水样品无菌状态下过滤富集后，加入到含富集培养液的三角瓶中，于28℃、转速180 rpm的条件下，培养7d后，按10%体积接种量转移到新配制的富集培养液中，再在温度28 ℃、转速180 rpm的条件下，培养7d，重复上述步骤连续富集培养3次，取培养基发酵液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯化后的各菌落分别接至富集培养液中振荡培养，在温度28℃、转速180 rpm的条件下，培养7 d，通过气相色谱-电子捕获器检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，最后筛选获得一株对氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药具有高效降解能力的菌株，即氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌HS-10菌株。

所述的营养培养基配制方法如下：精确称取磷酸高铁0.01g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g，加入过滤海水1000mL，混合均匀后，调节pH 为7.0-7.8，于121℃高压蒸汽灭菌20min后制得。

一种海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌的应用，该菌株对氯氰菊酯和/或溴氰菊酯具有较高的生物降解能力，可用于氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药污染的海水及沉积物环境的生物修复。

该菌株在温度25-30℃、pH 7.0-7.8、氯氰菊酯和溴氰菊酯农药浓度均为100mg/L 的条件下，7d 后对海水中氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率分别达到75.6%和90.9% 以上。

该菌株在温度25-30℃、pH 7.0-7.8、氯氰菊酯农药浓度为100mg/L 的条件下，7d 后对海水中氯氰菊酯的降解率达到75.6% 以上。

该菌株在温度25-30℃、pH 7.0-7.8、溴氰菊酯农药浓度为100mg/L 的条件下，7d 后对海水中溴氰菊酯的降解率达到90.9% 以上。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌，可安全、高效、快速的降解海水环境中残留的氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药，在温度25-30 ℃、pH 7.0-7.8、农药浓度100mg/L 的条件下，7d 后对海水中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯的降解率分别达到75.6%和90.9%，进一步采用发光细菌法研究了微生物降解前后，海水中氯氰菊酯和溴氰菊酯污染的生物毒性，结果表明，该菌株对海水中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯具有较好的降解效果，极大的消除了氯氰菊酯和溴氰菊酯及其降解产物的生物毒性。

综上所述，本发明从海水中分离出氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌，对海水中氯氰菊酯和溴氰菊酯具有较好的降解效果，对保护海洋生态环境、水产品安全及人类健康具有重要的意义，同时为拟除虫菊酯类农药农残降解研究提供了基础，开发前景广阔。

上述海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌，该菌株分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），菌株为HS-10株，保藏编号为CGMCC No.6044，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为本发明菌株HS-10的革兰氏染色显微镜图片

图2为本发明HS-10农药降解菌的扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

降解菌株的筛选与鉴定

1、培养基和试剂

营养培养基：精确称取磷酸高铁0.01  g、蛋白胨5.0  g、酵母膏1.0  g，加入过滤海水1000mL，混合均匀后，调节pH 为7.0-7.8，高压蒸汽灭菌（121℃，20 min）后制得。

富集培养液：在营养培养基中加入氯氰菊酯和溴氰菊酯溶液，使得氯氰菊酯和溴氰菊酯的浓度均为100 mg/L。

2、菌株分离纯化

海水样品采自宁波近岸海域，取500mL 海水于无菌状态下过滤富集后，加入到含氯氰菊酯和溴氰菊酯各100 mg/L的富集培养液中，于28℃、转速180 r/min摇床培养7 d后，按10%接种量转移到上述富集培养液中，继续培养7 d，重复上述步骤连续富集培养3次，取0.1mL培养液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯化后的各菌落分别接至富集培养基中振荡培养（28℃，180 rpm）7 d，通过气相色谱- 电子捕获器（GC-ECD）检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，最后筛选获得一株对氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药具有高效降解能力的菌株，命名为HS-10。

该菌株为HS-10株，分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），菌株保藏编号为CGMCC No.6044，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所, 该菌株的16S rDNA的Genbank登陆号为JX087926。

 具体实施例二

高效氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药降解菌株的鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的革兰氏染色显微镜图片如图1 所示，扫描电镜图如图2所示，该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色阴性，为杆菌，精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、柠檬酸盐试验、鸟氨酸脱羧试验、尿素酶试验阳性，V-P反应、H₂S反应、明胶液化实验阴性，可以利用蔗糖。该菌株海水中生长，最适生长温度25-30℃，最适生长pH 为7.0-7.8，在固体培养基上，菌落圆形、凸起，边缘完整，呈灰白色，半透明。

菌株序列号为JX087926。经BLAST同源性比对发现，该菌株的16S rDNA与假交替单胞菌相似度最高，进一步结合形态学和生理生化特征可初步鉴定该菌株为假交替单胞菌。

 具体实施例三

氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌对海水中拟除虫菊酯类农药的降解效果及应用

将分离、纯化后的菌株接种于100 mL 含氯氰菊酯和溴氰菊酯100 mg/L 的富集培养液中（配制方法如实施例一所示），以不接菌的富集培养基作对照，在28℃、180 rpm 的恒温摇床上震荡培养7 d。培养结束后，吸取2 mL 培养液，加0.4 g NacL，涡旋混匀，依次采用4 mL 的正己烷与丙酮（体积比1:1）的混合溶液和2 mL 的正己烷与丙酮的混合溶液萃取，合并两次萃取所得上清液，取3 mL 上清液，加入0.4 g 无水硫酸钠，氮气吹干后用1 mL 异辛烷与丙酮（体积比1:1）的混合溶液溶解，供GC-ECD 分析检测，每个实验重复三次，通过考察降解率来判断该菌的降解能力。

气相色谱检测条件：SPB-5石英弹性毛细管柱（30 m × 0.25 mm× 0.25 μm）；ECD检测器；色谱柱温150℃（5 min），40 °C/min；240℃（10 min），5℃ /min；260℃（3 min）；检测器温度320℃，进样口温度280 ℃，进样量为1.0μL，柱流 1.0 mL/min；分流比为1：30；载气为N₂（99.999%），采用外标法计量。降解率（%）=（对照样品残留量-处理样品残留量）×100/对照样品残留量。

实验结果表明该菌对海水中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药残留具有较好的降解能力，可安全、高效、快速的降解海水环境中残留的氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药，在温度25-30 ℃、pH 7.0-7.8、农药浓度100mg/L 的条件下，7d 后对海水中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯的降解率分别达到75.6%和90.9%，因此，该菌对环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯农药的降解，尤其是海水养殖环境污染的修复具有广泛的应用前景。

上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于上述实施例，以权利要求书为准。