一种台湾蠛蠓分子鉴定方法

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种台湾蠛蠓分子鉴定方法。

背景技术

台湾蠛蠓（Lasiohelea taiwana Shiraki, 1913）俗称小黑蚊，是我国南方常见的一类微小型吸血蠓类，属双翅目（Diptera）蠓科（Ceratopogonidae）蠛蠓属（Lasiohelea），是台湾蠛蠓种团（La.taiwana group）其中的一个种类，与种团中的其他种类（尤其是雌虫）极其相似，从形态学上难以准确进行鉴定。

对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是疾病预防与控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

分子鉴定技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家们的重视。近年来，随着以PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区（ITS）和线粒体DNA（mtDNA）的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）等基因逐渐受到重视，并在吸血蠓的分子鉴定中得到广泛应用。

由于COⅠ基因在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，而且目前研究表明，其DNA序列本身很少存在插入和缺失(即使有少数也主要分布于该基因的3 端，对结果的分析不会造成很大的影响)。同时，它还拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异，故人们选定COⅠ基因中的一个片段作为DNA条形编码基因。但COⅠ基因作为物种鉴定的唯一目的基因尚存在不足，比如可能会存在杂交或者基因渗透现象，因此需要尝试多个分子标记的结合使用。

ITS是位于rDNA上18S和28S基因之间的区域片段，包括ITS1和ITS2两段序列，由于该区域不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度较其他区域快，具有种内变异小而种间变异大的特性，加上协同进化作用保证了该片段在基因组不同单元间的一致性，因而适合进行各种分子操作，是较理想的亲缘种种间鉴定和系统发育分析的遗传标志。

目前，对吸血蠓的分子鉴定仍然主要采用单一基因（如仅采用COⅠ基因或者ITS基因），将两种不同基因相结合对吸血蠓进行鉴定的报道至今报道较见。本发明提供的台湾蠛蠓分子鉴定方法有利于实现台湾蠛蠓的准确鉴定，缩短鉴定时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种台湾蠛蠓特异基因及其分子鉴定方法。通过分子生物学方法获取台湾蠛蠓的两个特异基因：COⅠ基因和ITS2基因序列，通过基因序列相似性的比对，两个基因相结合，可实现台湾蠛蠓准确、快速的鉴定。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

本发明所述的一种台湾蠛蠓特异基因序列，其特异基因序列为COⅠ基因，为如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：

tttaatatta ggagctcctg atatagcttt cccacgaata aataatataa gattttgaat       60

attaccccct tctctttcat tattattaat tagaagttta gtagaaaatg gagctggtac       120

cggatgaaca gtttatcccc ctttagcggc caatatattt cacgcaggcg cttctgttga    180

tttagcaatt ttttctcttc atttagccgg aatttcatca attctaggag ctattaattt          240

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tgtatgatca gttttaatta ctgcagtatt attattatta tctttacctg ttcttgccgg         360

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     本发明所述的一种台湾蠛蠓特异基因序列，其特异基因序列为ITS2基因，为如下所述的基因序列SEQ ID NO.2：

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tcttgacgac ctcaactc                                                                          318。

所述的台湾蠛蠓的ITS2基因的PCR引物序列分别为：

正向引物 5’GATGAAGACCGCAGCAAACT 3’

反向引物 5’ATTTGGGGGTAGTCACACAT 3’。

本发明所述的一种台湾蠛蠓的分子鉴定方法，包括：

1）从待测的昆虫组织中分离提取DNA；

2）以该DNA为模板，对COⅠ基因采用的引物为：正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’， 反向引物5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’， 通过聚合酶链式反应扩增出台湾蠛蠓COⅠ基因；对于ITS2基因采用的引物为：正向引物 5’GATGAAGACCGCAGCAAACT 3’，反向引物 5’ATTTGGGGGTAGTCACACAT 3’），通过聚合酶链式反应扩增出台湾蠛蠓ITS2基因；

3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的COⅠ基因和ITS2基因分别用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能相应地特异性扩增出大小约为520 bp或大小约为360 bp的条带，送生物公司测序；

4）根据测序结果，若相应与COⅠ基因序列SEQ ID NO.1和ITS2基因序列SEQ ID NO.2的相似性均在98%以上，即可判断所述的待测组织即为台湾蠛蠓。

具体地说，本发明采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增台湾蠛蠓的COⅠ基因和ITS2基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。台湾蠛蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结果的可靠性。

所述引物根据文献合成，COⅠ基因：正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’， 反向引物5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’；ITS2基因：正向引物 5’GATGAAGACCGCAGCAAACT 3’，反向引物 5’ATTTGGGGGTAGTCACACAT 3’。

本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。

本发明的优点为：1）本发明采用两种标记基因相结合的方法对台湾蠛蠓进行分子鉴定，可实现台湾蠛蠓的准确鉴定。

2）与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的台湾蠛蠓分子鉴定方法能有效缩短台湾蠛蠓的鉴定时间。

附图说明

图1为台湾蠛蠓实验室种群COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-4均为台湾蠛蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为520 bp的条带。M为2000plus的DNA marker。

图2为台湾蠛蠓实验室种群ITS2基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-4为台湾蠛蠓的ITS2基因，检出大小约为360 bp的条带。M为DL-1000的DNA marker。

图3为未知蠛蠓COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-2均为未知蠛蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为520 bp的条带。M为2000plus的DNA marker。

图4为未知蠛蠓ITS2基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-2均为未知蠛蠓雌虫的ITS2基因，检出大小为360 bp的条带。M为DL-1000的DNA marker。

具体实施方式

实施例1 台湾蠛蠓COⅠ基因序列的获取。

1、台湾蠛蠓标本的获取

取实验室批量饲养的台湾蠛蠓，经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。台湾蠛蠓批量饲养前种类已经权威专家复核。

2、DNA模板制备

   采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取台湾蠛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用。

3、引物合成

本实施例所用引物如下：

正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’

反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’

4、PCR扩增

    本实施例的PCR反应体系如表1所示。

表1 台湾蠛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）

本实施例的反应程序如表2所示。

表2台湾蠛蠓COⅠ基因PCR反应程序

    PCR产物于4℃保存备用。

5、PCR扩增产物检测

取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图1。

6、基因序列测定

选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为台湾蠛蠓的CO基因序列—SEQ ID No.1。

实施例2 台湾蠛蠓ITS2基因序列的获取

1、引物合成

以实施例1中获得的台湾蠛蠓DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物 5’GATGAAGACCGCAGCAAACT 3’

反向引物 5’ATTTGGGGGTAGTCACACAT 3’

2、PCR扩增

    本实施例的PCR反应体系如表3所示。

表3 台湾蠛蠓ITS 2基因PCR反应体系（以50uL为例）

本实施例的反应程序如表4所示。

表4 台湾蠛蠓ITS 2基因PCR反应程序

3、PCR扩增产物检测

取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。

4、基因序列测定

选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为台湾蠛蠓的ITS2基因序列—SEQ ID No.2。

实施例3 未知蠛蠓的鉴定

1、标本的采集与保存

采用挥网法或人诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。

2、DNA模板制备

在解剖镜或体视显微镜下，从采集到的蠓类标本中随机挑选出一只雌性蠛蠓，采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取蠛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用。

3、目的基因序列的获取

3.1 COⅠ基因

3.1.1 引物合成

以获得的未知蠛蠓DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’

反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’

3.1.2 PCR扩增

    本实施例的PCR反应体系如表5所示。

  表5 未知蠛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）

本实施例的反应程序如表6所示。

表6未知蠛蠓COⅠ基因PCR反应程序

    PCR产物于4℃保存备用。

3.1.3 PCR扩增产物检测与基因序列测定

取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图3。由附图3看出实施例3的未知蠛也能特异性扩增出大小约为520 bp 的产物，将大小约为520 bp 的产物送生物公司测序，结果显示与基因序列SEQ ID NO. 1的相似性为99.9%，因而可初步判定该未知蠛蠓为台湾蠛蠓。

3.2 ITS2基因

3.2.1引物合成

在获取COⅠ基因的同时，从获得的未知蠛蠓DNA中取出部分，以该部分DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物 5’GATGAAGACCGCAGCAAACT 3’

反向引物 5’ATTTGGGGGTAGTCACACAT 3’

3.2.2 PCR扩增

    本实施例的PCR反应体系如表7所示。

表7 未知蠛蠓ITS 2基因PCR反应体系（以50uL为例）

本实施例的反应程序如表8所示。

表8 未知蠛蠓ITS 2基因PCR反应程序

3.2.3 PCR扩增产物检测与基因序列测定

取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图4。由附图4看出实施例3的未知蠛蠓也能特异性扩增出大小约为360 bp 的产物，将大小约为360 bp 的产物送生物公司测序，结果显示与基因序列SEQ ID NO. 2的相似性为99.9%，因而可确定该未知蠛蠓为台湾蠛蠓。

<110>  福建国际旅行卫生保健中心

<120>  一种台湾蠛蠓分子鉴定方法

<160>  6    

<170>  PatentInversion 3.1

<210>  1

<211>  472

<212>  DNA

<213>  台湾蠛蠓COⅠ基因

<400>  1

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attaccccct tctctttcat tattattaat tagaagttta gtagaaaatg gagctggtac       120

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tttagcaatt ttttctcttc atttagccgg aatttcatca attctaggag ctattaattt          240

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<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  COⅠ基因正向引物

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<212>  DNA

<213>  COⅠ基因反向引物

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<213>  台湾蠛蠓ITS2基因

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<213>  ITS2基因正向引物

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<213>  ITS2基因反向引物

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