巴利森苷对照品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化技术，尤其是一种巴利森苷对照品的制备方法。

背景技术

天麻(Gastrodia elata B1.)为兰科多年生草本植物，分布于全国大部分地区，主产于云南、贵州、四川、陕西及河南等地，在日本、韩国也有广泛分布。其干燥块茎亦称天麻，是一味常用而较名贵的中药。天麻性平，味甘，有平肝息风止痉的功能。主治头痛眩晕，肢体麻木，小儿惊风，癫痫抽搐，破伤风。近年来的研究发现天麻还具有增智、健脑、延缓衰老的作用，对老年性痴呆症有一定的疗效。

目前一般认为天麻素是天麻重要的活性成分，“2010年版中国药典附录”中天麻质量标准的制定，也是以天麻素作为重要的参考指标。多项有关天麻素的药理研究报道，天麻素并没有表现出与其传统药效相关的药理活性。虽然用几个化学成分作为指标控制天麻的质量有失偏颇，但是目前天麻对照品只能购买到天麻素、对羟基苯甲醇、香兰素等结构较简单、价廉的合成品，用其评价名贵中药天麻局限性明显。而天麻成分中较具特征的巴利森苷类化合物及多芳环化合物没有对照品，很难再深入开展研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种巴利森苷对照品的制备方法，采用本发明技术能从天麻中分离获得纯度极高的巴利森苷对照品。

本发明是这样实现的：巴利森苷对照品的制备方法，包括以下步骤

1）将天麻粉加入质量百分比为70%的乙醇中，回流提取温度75℃～80℃，过滤提取液；将提取液进行减压浓缩回收酒精，向浓缩液中加入石油醚萃取脱脂，萃取至萃取液无色透明，分离的水层用大孔吸附树脂层析柱分离，用乙醇-水梯度洗脱，洗脱梯度为纯水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿：甲醇为50:1～1:1，V:V，在氯仿与甲醇的体积比为3:1的洗脱部分获得巴利森苷粗品。

2）将巴利森苷粗品用色谱甲醇溶解后，经制备液相色谱分离纯化，流动相为乙腈-水，乙腈与水的体积比为15:85（色谱柱为C₁₈反相硅胶柱，流速15mL/min，柱温25℃），收集液经冷冻干燥后，获得白色粉末状结晶，即为巴利森苷对照品。

天麻与乙醇的料液比为1:10到1:20 。

回流提取为3次，3次提取的时间依次为3小时、3小时及2小时，合并3次提取液。

减压浓缩的压力为0.05MPa，温度为75℃，浓缩时间为45min。

向浓缩液中加入石油醚萃取脱脂时，浓缩液与石油醚的体积比为1:3，反复萃取5～8次。

为了证明本发明的实验效果，进行了如下实验：

1  材料与仪器

1.1 材料 

1.1.1 供试材料  

天麻(Gastrodia elata B1.)购于贵阳药材公司,经贵州大学熊源新教授鉴定为兰科植物天麻。

1.1.2 试剂与仪器 

柱色谱硅胶（青岛海洋化工产）；柱色谱大孔树脂（日本三菱公司）；薄层色谱硅胶（青岛海洋化工产）；乙腈为色谱纯级，其它试剂均为分析纯级。FW100型高速万能粉碎机（泰斯特仪器有限公司）：HZT-B5000电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴镉（上海浦东物理光学仪器产）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器产）；SHB-IIIS循环式多用真空泵（郑州长城科工有限公司）；101-1型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；1200型高效液相色谱仪（安捷伦）：1200型制备液相色谱仪（安捷伦）；WRS-1B型数字熔点仪（上海精科）。

2  方法与结果

2.1 巴利森苷的提取分离

取天麻粉2 Kg用20 L质量百分比为70%的乙醇回流提取3次，回流提取温度75℃～80℃，提取时间分别为3 h、3 h、2 h，合并3次提取液，向浓缩液中加入石油醚萃取脱脂，萃取至萃取液无色透明，分离的水层用大孔吸附树脂层析柱分离，用乙醇-水梯度洗脱，洗脱梯度为纯水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿：甲醇为50:1～1:1，V:V，在氯仿与甲醇的体积比为3:1的洗脱部分获得巴利森苷粗品。

2.1.2 巴利森苷的纯化

将巴利森苷粗品用色谱甲醇溶解后，经制备液相色谱分离纯化，流动相为乙腈-水，乙腈与水的体积比为15:85（色谱柱为C₁₈反相硅胶柱，流速15mL/min，柱温25℃），收集液经冷冻干燥后，获得白色粉末状结晶，即为巴利森苷对照品。

巴利森苷对照品的提取、分离、纯化工艺流程图如图1所示。

2.2  纯度检测

2.2.1 巴利森苷的TLC纯度检测

取巴利森苷对照品，加甲醇配制成1 mL含1 mg的对照品溶液，按薄层色谱法试验，取上述溶液2、5、10、15、20、25 μL点于同一硅胶G薄层板上，分别以氯仿：甲醇：冰乙酸（2:1:0.05）薄层色谱图见图2；丙酮：甲醇：冰乙酸（6:1:0.02）薄层色谱图见图3；乙酸乙酯：丙酮：甲醇：冰乙酸（4:2:1:0.03）为展开剂，薄层色谱图见图4；展开、取出、晾干，分别在紫外灯下观察（254 nm）、碘显、硫酸显色剂显色后观察记录结果。由图2、图3、图4可知，在3种展开剂和3种不同的显色剂中，对照品斑点清晰除对照品显色单一斑点外，不应有其它斑点，自制的巴利森苷对照品溶液随着浓度增加，仍呈现单一斑点且圆整性好，说明对照品纯度较高。

2.3 HPLC含量测定

2.3.1 供试品溶液的制备

分别精密称取巴利森苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg 的溶液，即得。

2.3.2 测定法

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，巴利森苷以乙腈-水（15:85，V:V）为流动相，检测波长为 222 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：5 μL。色谱条件下测定，面积归一化法计算其纯度。巴利森苷对照品的含量为99.37％。理论塔板数按巴利森苷峰计算不低于8000，对称因子均大于0.9，HPLC色谱图见图4。

2.4 稳定性试验

将巴利森苷对照品置棕色玻璃瓶中，分别对其的温度、光照、进行稳定性考察，量测定方法分别在 0、3、5、7、10天测定含量。 

2.4.1 温度考察

由于前期工作总结得出，巴利森苷对温度比较敏感，容易分解，所以条件选择为室温、冷藏、冷冻。结果见表1

2.4.2 光照考察

光照考察条件为照度4500 lx、25℃条件下按含量测定方法，结果见表1。对照品的储存条件为干燥、室温10天内含量变化不大，巴利森苷对照品含量稳定。

2.5 化合物的结构鉴定  

2.5.1 巴利森苷对照品  

对照品为白色粉末，易溶于水及甲醇，在乙醇、乙腈。乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、石油醚中的溶解性均不好，硫酸显色为紫红色。

巴利森苷 (tri-[4-(β-D-glucopyranos yloxy)benzyl] citrate, parishin)熔点125-126℃。

UV λmax (ACN-H₂O):222.I（λmax，cm^-1）：3400,2920,1740,1620,1520,240,1080,830.(-)ESI-MS, 30eV,m/z(rel.int.):995[M-H]^-(4),727[M-H-268]^-(100),424(2).¹H NMR(CD₃OD,400 MHz)δ：2.79(d, 15.6 Hz，2H)，2.92(d, 15.2Hz,2H)，3.68 (dd, J = 4.7, 12.0 Hz,3H,), 3.87 (3H,dd, J = 1.8, 12.0 Hz, 3H), 4.88 (d, J =7.5 Hz, 3H), 4.90 (s,2H,), 4.97 (s,4H), 7.03 (d, J = 8.6 Hz,2H),7.06 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 7.15, 7.24, 7.25,( d, J=8.6Hz,2H).¹³C NMR(500MHz, CD₃OD）δ：44.7 (2C, C-l, 3), 62.5 (3C,3×Glc C-6), 67.3 (2C, 2×C-7'), 68.2 (C-7'), 71.4(3C), 74.7, 74.9 (2C), 77.9 (3C), 78.1 (3C) (3×Glc-2', 3', 4', 5'), 102.3 (3C,3×Glc C-l'),117.8(6C,3×3',5'), 130.7(3C,3×C-1'),131.0(6C,3×C-2',6'),159.1(3C,3×C-4'),170.9(2C,-COOR₁,-COOR₃), 174.3 (-COOR₂)。

以上数据与文献报道一致，故鉴定为巴利森苷。化合物结构式，如式（1）所示。

附图说明

图1为巴利森苷对照品的提取、分离、纯化工艺流程图；

图2为巴利森苷对照品的薄层色谱图，展开剂为氯仿：甲醇：冰乙酸（2:1:0.05）；

图3为巴利森苷对照品的薄层色谱图，展开剂为丙酮：甲醇：冰乙酸（6:1:0.02）；

图4为巴利森苷对照品的薄层色谱图，展开剂为乙酸乙酯：丙酮：甲醇：冰乙酸（4:2:1:0.03）；

图5为巴利森苷对照品的HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明的实施例：巴利森苷对照品的制备方法，包括如下步骤：

1）将天麻粉加入质量百分比为70%的乙醇中，天麻粉与乙醇的料液比为1:15，回流提取温度75℃～80℃，回流提取为3次，3次提取的时间依次为3小时、3小时及2小时，合并3次提取液，过滤提取液；将提取液进行减压浓缩后，减压浓缩的压力为0.05MPa，温度为75℃，浓缩时间为45min，向浓缩液中加入石油醚萃取脱脂，浓缩液与石油醚的体积比为1:3，反复萃取5～8次，萃取至萃取液无色透明，分离的水层用大孔吸附树脂层析柱分离，用乙醇-水梯度洗脱，洗脱梯度为纯水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、乙醇，收集20%乙醇部分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿：甲醇为50:1～1:1，V:V，在氯仿与甲醇的体积比为3:1的洗脱部分获得巴利森苷粗品。

2）将巴利森苷粗品用色谱甲醇溶解后，经制备液相色谱分离纯化，流动相为乙腈-水，乙腈与水的体积比为15:85（色谱柱为C₁₈反相硅胶柱，流速15mL/min，柱温25℃），收集液经冷冻干燥后，获得白色粉末状结晶，即为巴利森苷对照品。