法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-04-27
授权
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2014-07-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/80 申请日:20121213
实质审查的生效
2014-06-18
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，属于生物 技术领域。
背景技术
芝麻枯萎病是由尖孢镰刀菌芝麻专化型（Fusarium oxysporum f.sp.sesami (Zaprometoff)Castellani）引起的一种重要的土传真菌病害，在世界范围内芝麻种植区域均有 不同程度发生。在我国，芝麻枯萎病对芝麻生产危害较为普遍，一般流行年份发病率为5-15% 左右，大发生时可达30%以上，严重影响芝麻的产量和品质，因此对于尖孢镰刀菌芝麻专化 型致病特征的研究非常重要。由于芝麻病害研究起步较晚，研究基础薄弱，至今鲜少有对芝 麻枯萎病菌致病机理进行深入研究的报道。
近年来，随着尖孢镰刀菌的基因组测序的完成以及芝麻枯萎病菌功能基因组学研究的尝 试，缺乏合适的遗传转化体系成为进一步深入研究的重要限制因素。因此，建立一种简单、 高效、稳定的遗传转化方法对于研究芝麻枯萎病致病机理具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专 化型原生质体遗传转化的方法，包括以下步骤：
1）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝的收集
将尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝接种于PDB液体培养基，振荡培养后，收集孢子；将孢子 转移到YEPD液体培养基中，振荡培养后，收集菌丝；
2）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的制备
a、在步骤1）收集的菌丝中加入原生质体裂解缓冲液，振荡培养；
b、过滤酶解混合物，离心，弃上清液，收集原生质体沉淀；
c、在原生质体沉淀中加入STC缓冲液重悬，离心，弃上清液；再重复步骤c两次；
d、在步骤c的沉淀中加入STC缓冲液重悬至2-5×107个原生质体/mL；
3）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的转化
a、在原生质体悬浮液中加入pBHt2-eGFP质粒，混匀后静置；再加入40%PTC缓冲液， 混匀后静置；最后加入TB3培养基，室温振荡培养；
b、将步骤a得到的培养物离心，弃上清液，用STC缓冲液重悬；再加入约50℃未凝固 的Bottom Agar培养基，混匀后倒平板，室温过夜培养；最后加入约50℃未凝固的Top Agar 培养基覆盖到Bottom Agar平板上，培养至转化子长出；
c、挑取单个转化子到含有200μg/mL潮霉素的PDA培养基上，筛选培养，转接5代后 得到纯和转化子。
尖孢镰刀菌芝麻专化型转化子的检测
a、PCR检测：根据转化入尖孢镰刀菌芝麻专化型转化子的筛选标记基因序列设计特异引 物，以SDS法快速提取的转化子DNA作为模板进行PCR扩增，随后用1％琼脂糖凝胶电泳 检测扩增片段大小。
b、荧光显微镜观察
将PCR检测为阳性的转化子菌丝和分生孢子悬浮液分别制成临时玻片，用荧光显微镜观 察其由蓝紫光激发出的绿色荧光。
所述原生质体裂解缓冲液的加入量为5mL/0.25-0.30g菌丝。
所述pBHt2-eGFP质粒的加入量为5-6μg/200μL原生质体悬浮液。
所述PDB培养基：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤液体 至烧杯中，加入葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述PDA培养基：取灭菌前的PDB培养基1L，加入琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌 20min。
所述YEPD培养基：取酵母提取物3.0g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，补水至1L，121℃ 高压蒸汽灭菌20min。
所述原生质体裂解缓冲液：取Driselase 500mg，Lysing enzyme 100mg，加入1.2M KCl 溶液至20mL，室温振荡30min，4000rpm离心6min，吸取上清液，用0.45μm细菌过滤器 过滤除菌。
所述STC缓冲液：取蔗糖50g，0.5M Tris-Cl（pH=8.0）25mL，CaCl2·2H2O 1.838g，补 纯水至250mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述PTC缓冲液：取PEG800020g，补STC缓冲液至50mL，在65℃水浴锅中溶解， 用0.45μm细菌过滤器过滤除菌。
所述TB3培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，补水至1L， 121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述Bottom Agar培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，琼脂 粉10g，补水到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至约50℃再加入200μg/mL潮霉素和 50μg/mL头孢霉素。
所述TopAgar培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，琼脂粉15 g，补水到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至约50℃再加入300μg/mL潮霉素和50μg/mL 头孢霉素。
本发明实现了PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体转化，建立了一套完整的遗传 转化、筛选方法，获得大量高强度表达潮霉素抗性蛋白和绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌 株。本发明通过控制尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝的生长时间、尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质 体的复壮时间、原生质体裂解缓冲液的加入量以及载体质粒的加入量，确保获得较高的转化 效率，本发明的转化效率可达7667个转化子/mg DNA。本发明转化所用载体具有增强型绿色 荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子gpd，有效提高了转化菌体所发出的荧光强度。另外， 本发明也可利用无T-DNA片段的载体进行遗传转化。
附图说明
图1为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005的菌丝形态，标尺：25μm；
图2为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005的原生质体，标尺：25μm；
图3为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005转化子在PDA培养基上的部分筛选结果；
图4为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005及部分转化子的菌落形态，
图中，1：野生型尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005的菌落形态，2-6：尖孢镰刀菌 芝麻专化型菌株HSFO 08005部分转化子的菌落形态；
图5为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005部分转化子的琼脂糖凝胶电泳图，
图中，M：DNA Marker，1、2、15、16：尖孢镰刀菌芝麻专化型野生型菌株HSFO 08005 的扩增结果，3：潮霉素抗性基因标记的阳性对照，4-14：尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005部分转化子用潮霉素抗性基因标记的扩增片段，17：GFP基因标记的阳性对照，18-28： HSFO 08005菌株部分转化子用绿色荧光蛋白基因标记的扩增片段；
图6为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005部分转化子的荧光显微镜观察图，标尺： 25μm，
图中，1：尖孢镰刀菌芝麻专化型野生型菌株HSFO 08005的菌丝，2：尖孢镰刀菌芝麻 专化型菌株HSFO 08005转化子的菌丝，3：尖孢镰刀菌芝麻专化型野生型菌株HSFO 08005 的分生孢子，4：尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005转化子的分生孢子。
具体实施方式
尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株选用尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005。
主要试剂与培养基的配制：
PDB培养基：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤液体至烧 杯中，加入葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
YEPD培养基：取酵母提取物3.0g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，补水至1L，121℃高压 蒸汽灭菌20min。
TB3培养基：取酵母提取物3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，补水至1L，121℃ 高压蒸汽灭菌20min。
BottomAgar培养基（含200μg/mL潮霉素和50μg/mL头孢霉素）：取酵母提取物3.0g， 酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，琼脂粉10g，补水到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
Top Agar培养基（含300μg/mL潮霉素和50μg/mL头孢霉素）：取酵母提取物3.0g，酸 水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，琼脂粉15g，补水到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
PDA培养基（含200μg/mL潮霉素）：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用 四层纱布过滤液体至烧杯中，加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭 菌20min。
原生质体裂解缓冲液：取Driselase 500mg，Lysing enzyme 100mg，加入1.2M KCl溶液 至20mL，室温振荡30min，4000rpm离心6min，吸取上清液，用0.45μm细菌过滤器过滤 除菌。
STC缓冲液：取蔗糖50g，0.5M Tris-Cl（pH=8.0）25mL，CaCl2·2H2O 1.838g，补纯水 至250mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
PTC缓冲液：取PEG8000 20g，补STC缓冲液至50mL，在65℃水浴锅中溶解，用0.45 μm细菌过滤器过滤除菌。
实施例1、尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝的收集
挑取PDA平板保存的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝接种于100mL PDB液体培养基中， 26℃、130rpm振荡培养3d后，用双层无菌细孔纱布过滤培养基，室温下4000rpm离心6min 收集孢子。将孢子块转移到100mLYEPD液体培养基中，26℃、130rpm培养15h后，用双 层无菌细孔纱布过滤培养基，收集菌丝，菌丝形态如图1所示。
实施例2、尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的制备
1）取0.3g收集的新鲜菌丝放至50mL离心管中，加入5mL原生质体裂解缓冲液，30℃、 100rpm振荡培养3h，显微镜下观察原生质体，形态如图2所示。
2）用三层擦镜纸过滤酶解混合物到50mL离心管中，并用1.2M KCl尽可能多地将原生 质体冲洗下来，室温3600rpm离心6min收集，弃去上清液。
3）加入10mL STC缓冲液轻轻重新悬浮原生质体沉淀，室温3600rpm离心6min，弃去 上清液。重复该步骤1次。
4）加入1mL STC缓冲液重新悬浮原生质体，后转移至2mL离心管中，室温3600rpm 离心6min，再加入适量STC缓冲液重新悬浮至2-5×107个原生质体/mL。
实施例3、尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的转化
1）在含有200μL原生质体悬浮液的50mL离心管中加入6μg pBHt2-eGFP质粒，轻轻 混合均匀，室温静置20min。后缓慢加入1mL 40%PTC缓冲液至离心管中，轻轻混合，室 温静置20min，再加入5mL TB3培养基，室温100rpm振荡培养10h。
2）5000rpm离心5min，弃去上清液，用1mL STC缓冲液重悬，后再加入10mL冷却 至50℃的Bottom Agar培养基（含200μg/mL潮霉素和50μg/mL头孢霉素），混匀后倒平板， 室温下培养12h后，将10mL冷却至50℃的Top Agar培养基（含300μg/mL潮霉素和50μg/mL 头孢霉素）覆盖到Bottom Agar平板上，26℃培养至转化子长出，如图3所示。统计共获得 46个转化子，转化效率为7667个转化子/mg DNA。
3）挑取单个转化子到含有200μg/mL潮霉素的PDA培养基上，26℃筛选培养，获得纯 和转化子，如图4所示。
尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株转化子的检测
1、PCR扩增法
1）转化子DNA的提取：
a、分别将尖孢镰刀菌芝麻专化型野生型菌株及尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005 转化子的菌丝放置在2mL离心管里，加入适量石英砂（用盐酸浸泡处理后灭菌）、500μL SDS DNA抽提缓冲液和500μL酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），250rpm室温振荡1h，10000rpm 离心10min。
b、吸取上清液，加入等体积异丙醇，室温静置2h，10000rpm离心10min，弃去上清 液。加入1mL 70%乙醇洗涤，10000rpm离心5min，弃去上清液，再加入1mL无水乙醇洗 涤，10000rpm离心5min，弃去上清液。
c、室温风干，加入30μL无菌水溶解，-20℃保存备用。
2）转化子的PCR扩增
根据转化入尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株HSFO 08005的DNA片段中潮霉素抗性基因及绿 色荧光蛋白基因的序列，分别设计两对特异引物：
引物对1 Hph-F：5′-GACCTATTGCATCTCCCGCC-3′（SEQ ID NO:1）
Hph-R：5′-GAATCCCCGAACATCGCCTC-3′（SEQ ID NO:2）
引物对2 eGFP-F:5′-CCACAAGTTCAGCGTGTCC-3′（SEQ ID NO:3）
eGFP-R:5′-TTCACCTTGATGCCGTTCT-3′（SEQ ID NO:4）
分别以提取的DNA为模版，进行PCR扩增。
PCR反应体系为：0.1μL Taq DNA polymerase，1.0μL 10×Taq Buffer（含Mg2+），1.0μL dNTP Mix（2.5mM/L），1.0μL DNA，0.3μL上下游引物（10μM/L），补ddH2O至10μL。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 个循环；72℃延伸8min，16℃保温。
PCR扩增后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图5所示，除HSFO 08005野生菌株 未见明显扩增产物外，阳性对照及所有转化子均有潮霉素抗性基因及绿色荧光蛋白基因的扩 增片段（分别约为414bp和420bp），与预期目标条带大小相同，则可确定其均为阳性转化 子。
2、转化子荧光显微镜观察
将PCR检测为阳性的转化子的菌丝和其分生孢子悬浮液分别制作临时玻片，用莱卡 DM6000B荧光显微镜以蓝紫光作为激发光源进行观察，如图6所示，可以观察到阳性转化子 的菌丝和分生孢子均能被激发出较强的绿色荧光。而在检测的25个转化子中，仅有1个未观 察到被激发出的绿色荧光，转化子阳性率为96%。另外，这些转化子在PDA培养基上经过5 代转接之后仍具有潮霉素抗性及较强的激发荧光，表明其具有较高的遗传稳定性。
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