重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗雄激素性脱发药物中的应用

技术领域

本发明涉及使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组灵芝免疫调节蛋白在治疗雄激素性脱发中的一种新用途，尤其涉及重组灵芝免疫调节蛋白在预防、缓解和/或治疗雄激素性脱发方面的用途，属于生物医药工程领域（生物医学领域）。

背景技术

雄激素性脱发(Androgenetic Alopecia,AGA)，又名脂溢性脱发 (Seborrheic Alopecia,SA)，男性型脱发(Male Pattern Alopecia,MPA)，是皮肤科临床的常见病、多发病，也是难治疾病之一，该病病程漫长且顽固难愈。临床症状常表现为头发油腻、多屑、有明显瘙痒感、额颞区及顶部的渐进性脱发，继而形成“高额”，病情严重时顶部大部分头发脱落或全部脱落，仅枕部及两颞毛发基本正常。男性型脱发是世界性皮肤科问题，从发病率来看，白种人>黄种人>黑种人，在美国目前有500万患者，在台湾大约有120万左右的男性型脱发患者而在韩国，50岁以上的男性一半左右会受到男性型脱发疾病的困扰。据推断，中国的男性型脱发的发病率也不会低于同处东亚的韩国和台湾地区，而且有一个重要而且不容忽视的趋势——发病呈年轻化。这意味着脱发将成为更多年轻人的心头之痛。

目前认为遗传因素和雄激素共同作用是主要发病原因之一，近年来，随着生物技术的不断发展，AGA的发病机理，特别是AGA与雄激素的关系更趋明了，因此，性激素失衡是导致AGA发生的主要因素，该病的发病特点为：好发于20~30岁的男性，女性少有，且脑力劳动者多于体力劳动者，脱发时轻时重，不能自行逆转。基于现在生活节奏的加快与工作压力的加大，其发病率逐渐上升，发病年龄也趋于低龄化，由于该病有碍容貌，影响美观，常给患者带来很大的心理负担和精神压力，因此对该病的深入研究，特别是临床的药物治疗应受到广泛的重视。

随着研究手段的不断发展，对于雄激素性脱发的研究水平也在逐渐提高。现有的关于AGA的各种治疗方法都有其局限性，再加之AGA本身是一个顽固且复发性较高的疾病，因此到目前为止还没有找到能从根本上治疗AGA的药物。近年来，关于免疫调节、细胞因子分泌和激素调控方面的研究已成为AGA治疗的研究焦点，一些激素调节类药物和免疫调节剂已在动物模型和临床中取得了令人瞩目的成果，这为AGA的治疗进展奠定了坚实的基础。

LZ-8属于真菌免疫调节蛋白（fungal immunoregulatory protein, FIP）家族，是1989年由日本人Kino K等首次从赤灵芝菌丝体提取物中分离出的一种免疫调节蛋白。等电点为4.4，分子量为12.4 kD，由110个氨基酸残基组成，基因编码区有330-350个碱基对。本发明中所使用的重组灵芝免疫调节蛋白(recombinant Ganoderma lucidum immunoregulatory protein，rLZ-8)，是应用基因工程方法得到的具有高纯度和稳定生物活性的rLZ-8样品。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进末梢淋巴细胞和脾脏细胞的生物活性，诱导动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康。

性激素代谢紊乱之后，会直接导致AGA的发生，不仅脱发加重，而且机体内血脂异常升高，且与脱发相关的各种细胞因子分泌异常。很多研究证明，使用免疫调节类药物可能对雄激素性脱发具有改善作用。本发明的积极效果在于首次公开了重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)对雄激素性脱发的作用，其不仅能在小鼠模型体内具有改善脱发作用，并且无明显毒副作用，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制雄激素性脱发的药物有一定的积极作用。

发明内容

本发明目的之一是提供重组灵芝免疫调节蛋白的一种新用途，即在预防、缓解和/或治疗雄激素性脱发中的用途。

本发明所述的重组灵芝免疫调节蛋白是使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组灵芝免疫调节蛋白，不论是从何种途径提取或得到的灵芝免疫调节蛋白，其主要成分相同，基本结构相同，都具有相同的药理功效，即，都可以用于预防、缓解和/或治疗雄激素性脱发。

本发明人通过大量雄激素性脱发动物模型实验，发现rLZ-8对AGA动物模型的脱毛现象具有改善作用，故用ELIAGA法检测小鼠血清中睾酮(T)和雌二醇(E₂)含量，结果显示模型组小鼠血清T含量显著升高(P<0.01)，E₂含量显著下降(P<0.01)， T/E₂比值严重失调，而rLZ-8可改善由T引起的小鼠性激素分泌紊乱现象，该结果提示rLZ-8可通过调节性激素代谢来起到对AGA的治疗作用。

本发明目的之二是提供一种能够预防和治疗雄激素性脱发的药物组合物，该药物组合物包含治疗上有效量的rLZ-8和至少一种药学上可接受的辅料或载体，所述辅料或载体可以是：淀粉、氯化钠、微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。该组合物的给药方式可以是但不限于经腹腔注射、静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、丸剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、口服液、软胶囊、滴丸剂、贴片、膏剂等，其中优选注射液、冻干粉针剂、片剂和胶囊剂。本领域技术人员根据现有技术以及制剂领域的公知常识可以方便地制备出所需剂型。

本发明具有以下优点：

1.安全性高，可长期使用。在目前阶段，雄激素性脱发通常是不可逆的皮肤科临床常见病和多发病，病因复杂。为了使患者病情不继续恶化，病人用药周期较长。灵芝免疫调节蛋白作为来源于灵芝的一种蛋白质，其高安全性可以保证病人长期用药的需要。

2.治疗效果好。rLZ-8可以有效调节机体性激素分泌平衡，改善由激素分泌紊乱引起的雄激素性脱发症状。

说明书附图说明

图1 各组雌性小鼠毛发收集测定结果。

注： *与正常对照组相比p<0.05、**与正常对照组相比p<0.01；^△与AGA模型组相比p<0.05。

图2各组雄性小鼠毛发收集测定结果。

注：各组雄性小鼠毛发收集测定结果。*与正常对照组相比p<0.05、**与正常对照组相比p<0.01；^△与AGA模型组相比p<0.05、^△△与AGA模型组相比p<0.01。

具体实施方式

下述结合实施例对本发明做进一步的描述。（以下将结合附图就药理作用的实验结果分述如下：）

实施例 1  rLZ-8能改善丙酸睾酮所致的小鼠脱毛现象。

1 实验材料

rLZ-8（由吉林大学钻智基因工程药物研究所提供），丙酸睾酮注射液（上海通用药业股份有限公司）。

2 仪器设备

篦子，镊子，自封袋，佳能照相机。

3 实验动物

健康灵活的ICR小鼠，雌雄各半，体重20±2g，SPF级。购自吉林大学基础动物中心，动物许可证编号：SCXK京2009-0004。在吉林大学SPF级条件下饲养。实验期间控制室温在 20℃±2℃，12小时交替照明，小鼠自由饮水、 取食。

动物于给药前进行毛发检查，选取合格的小鼠60只随机分为6组，每组10只，雌雄各半。

4 实验方法

4.1  实验分组及给药

小鼠60只随机分为6组，每组10只，雌雄各半。正常对照组：每天腹腔注射生理盐水2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射等体积的生理盐水1次。溶媒对照组：每天腹腔注射生理盐水2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射等体积的玉米油1次。AGA模型组：每天腹腔注射生理盐水2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射丙酸睾酮注射液(1.0mg/kg)，每天给药1次；rLZ-8低、中、高剂量组：分别腹腔注射60.0 μg/kg、100.0 μg/kg、160.0 μg/kg体重的 rLZ-8，每天2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射丙酸睾酮注射液(1.0mg/kg)，每天给药1次。

4.2毛发收集 

从造模第五周开始至实验结束，每天收集脱落毛发。将每只小鼠在相相同条件下，用相同的篦子梳理小鼠背部毛发。具体操作方法：将受试小鼠置于黑色粗糙表面上，左手拉紧小鼠尾部，右手持工具与小鼠背部表面呈45°角方向，力度均匀一致梳理染色区毛发。正常梳理与逆行梳理毛发每天各30下。用眼科镊收集脱落毛发并用自封袋将其制成标本。每只小鼠测试后用医用酒精擦拭动物背部，用干布擦净后进行下一只。

5 实验结果

5.1 各组雌性小鼠毛发收集测定结果

在雌性小鼠中，与正常对照组相比，其它各实验组小鼠均发生不同程度的脱毛现象，除AGA模型组存在极显著性差异（p<0.01）外，其余各组都存在显著性差异（p<0.05）；与AGA模型组相比，溶媒对照组、rLZ-8各剂量组脱毛明显减少，除rLZ-8高剂量组之外，都存在显著性差异（p<0.05）；rLZ-8各剂量组之间无显著性差异。结果见图1。

5.2  各组雄性小鼠毛发收集测定结果

在雄性小鼠中，与正常对照组相比，其它各实验组小鼠均发生不同程度的脱毛现象，其中AGA模型组存在极显著性差异（p<0.01），溶媒对照组和rLZ-8低、高剂量组都存在显著性差异（p<0.05），与AGA模型组相比，溶媒对照组和rLZ-8低、高都存在显著性差异（p<0.05），rLZ-8各剂量组之间无显著性差异。结果见图2。

实施例2  rLZ-8能改善小鼠体内性激素分泌平衡及对主要脏器指数的影响

1 实验材料

rLZ-8（由吉林大学钻智基因工程药物研究所提供），丙酸睾酮注射液（上海通用药业股份有限公司）。

2 仪器设备

低温离心机(eppendorf centrifuge 5810R)、数显恒温循环水箱（国华HH-42型）、752型紫外光栅分光光度计（山东高密分析仪器厂）。

3 实验动物

健康灵活的ICR小鼠，雌雄各半，体重20±2g，SPF级。购自吉林大学基础动物中心，动物许可证编号：SCXK京2009-0004。在吉林大学SPF级条件下饲养。实验期间控制室温在 20℃±2℃，12小时交替照明，小鼠自由饮水、 取食。

动物于给药前进行毛发检查，选取合格的小鼠60只随机分为6组，每组10只，雌雄各半。

4 实验方法

4.1  实验分组及给药

小鼠60只随机分为6组，每组10只，雌雄各半。正常对照组：每天腹腔注射生理盐水2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射等体积的生理盐水1次。溶媒对照组：每天腹腔注射生理盐水2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射等体积的玉米油1次。AGA模型组：每天腹腔注射生理盐水2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射丙酸睾酮注射液(1.0mg/kg)，每天给药1次；rLZ-8低、中、高剂量组：分别腹腔注射60.0 μg/kg、100.0 μg/kg、160.0 μg/kg体重的 rLZ-8，每天2次，连续63天，其中第4-63天，每天还需皮下注射丙酸睾酮注射液(1.0mg/kg)，每天给药1次。

4.2小鼠血清中睾酮（T）含量

4.2.1取血清：实验第64天，将各组小鼠经摘眼球取血后，3000rpm 4℃离心10分钟，分别取上清液后进行分装，置于-80℃冰箱待测；

4.2.2检测方法：

（1）取步骤4.2.1中制备的血清样本测定T含量。

（2）将试剂盒在室温下平衡20min，取出所需板条，剩余板条封好后置4℃保存。

（3）设置标准品孔、样本孔和空白孔。标准品孔加入不同浓度的标准品；样本孔先加入40μl样本稀释液，再加入10μl样本；空白孔只加样本稀释液。每个样本均做双复孔。

（4）用封板膜将反应孔封住，37℃恒温孵育箱中反应30min。

（5）弃去孔内液体，用洗板液洗孔5次。

（6）向各孔内加入酶标试剂50μl(空白孔除外)，37℃孵育30min。

（7）弃去孔内液体，用洗板液洗孔5次。

（8）向各孔加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻混匀后37℃下避光显色15min。

（9）每孔加入中止液50μl，空白孔调零，使用酶标仪在15min内测定450nm处各孔的吸光度值。

（10）以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算标准曲线的回归方程，根据样本的吸光度计算出样本浓度。

4.2.3小鼠血清睾酮雌二醇（E₂）含量检测

取步骤4.2.1中制备的血清样本，按ELISA试剂盒说明书上的方法检测E₂含量，具体操作同4.2.2。

4.3小鼠各脏器指数测定

取小鼠心、肝、脾、肺、肾及胸腺，称重，按公式计算脏器指数。脏器指数( mg/10g) = 脏器重量/体重×100。

5 实验结果

5.1小鼠血清中睾酮（T）含量与雌二醇（E₂）含量测定结果

在睾酮（T）含量方面：与正常对照组相比，其余各组血清睾酮（T）含量均呈现不同程度的升高，且有显著性差异（P<0.05），其中模型组与正常对照组相比，有极显著性差异（P<0.01）；与模型组相比，各组T含量均有不同程度降低，且都有显著性差异（P<0.05）；rLZ-8高剂量组与rLZ-8中剂量组相比，有显著性差异（P<0.05）。

在血清雌二醇（E₂）含量方面：与正常对照组相比，各组血清雌二醇（E₂）含量均呈现不同程度的降低，且均有显著性差异（P<0.05）；与模型组相比，各组E₂含量均高于模型组，仅有rLZ-8中剂量有显著性差异（P<0.05）；rLZ-8各剂量组之间无显著性差异，且无剂量依赖性。

在血清T/E₂比值方面：与正常对照组相比，其余各组血清T/E₂比值均呈现不同程度的升高，且都有显著性差异（P<0.05），其中以模型组升高最为显著且存在极显著性差异（P<0.01）；与模型组相比，各组血清T/E₂比值均有不同程度降低，且都有显著性差异（P<0.05）；rLZ-8高剂量组与rLZ-8中剂量组相比，有显著性差异（P<0.05）。详见表1。

表1 小鼠血清T及 E₂含量测定结果（n=10）

注：^*与正常对照组相比p <0.05、^**与正常对照组相比p <0.01；^△与模型组相比p <0.05；#与rLZ-8中剂量组相比p <0.05。

5.2小鼠血清肝细胞生长因子(HGF)含量与血管内皮生长因子(VEGF)含量测定

在血清HGF含量方面：与正常对照组相比，各组血清HGF含量均呈现不同程度的降低，以模型组含量降低最为显著且存在显著性差异（p<0.05）；与模型组相比，各治疗组HGF含量均有所升高，rLZ-8中剂量组有显著性差异（p<0.05）；rLZ-8各剂量组间无显著性差异，也无剂量依赖性。

在血清VEGF含量方面：与正常对照组相比，其余各组血清VEGF含量均呈现不同程度的降低，模型组有显著性差异（p<0.05）；与模型组相比，各治疗组VEGF含量均有所升高，且仅有 rLZ-8中剂量组有显著性差异（p<0.05）；rLZ-8各剂量组间也无显著性差异。详见表2。

表2  小鼠血清HGF含量测定结果

注：^*与正常对照组相比P<0.05；^△与模型组相比P<0.05。

5.3 各组小鼠的主要脏器系数变化结果

在雌性小鼠中，与正常对照组相比，AGA模型组的肝脏指数、脾脏指数以及肾脏指数均有一定的升高，心脏指数、肺脏指数有所降低，胸腺指数基本不变。结果见表3。

表3  各组雌性小鼠脏器指数测定结果（n=5）

注：各组雌性小鼠脏器指数测定结果。*与正常对照组相比p<0.05、**与正常对照组相比p<0.01；^△与AGA模型组相比p<0.05、^△△与AGA模型组相比p<0.01。

在雄性小鼠中，与正常对照组相比，模型组的心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数以及肾脏指数均有一定的降低，胸腺指数有所升高。结果见表4。

表4  各组雄性小鼠脏器指数测定结果（n=5）

注：各组雄性小鼠脏器指数测定结果。*与正常对照组相比p<0.05、**与正常对照组相比p<0.01；^△与AGA模型组相比p<0.05。。