一种抑制凋亡抑制蛋白的异喹啉化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属生物医学技术领域，具体涉及抑制凋亡抑制蛋白的异喹啉化合物及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤细胞的凋亡信号通路通常都存在着不同程度的畸变，他们靠此来保持自身生存的活力。其中一种逃逸凋亡的方式是通过上调凋亡抑制蛋白（IAPs）来起作用的（1）。IAPs是一组结构和功能相近的蛋白家族，是细胞凋亡的内源性抑制剂（2），主要包括XIAP（X-linked IAP）、cIAP1（cellular inhibitor of apoptosis proteins 1）、cIAP2（cellular inhibitor of apoptosis proteins 2）、ML-IAP、survivin等等。所有的IAP家族都至少有一个杆状病毒IAP重复序列（BIR）结构域。cIAP1、cIAP2和XIAP都包含了三个BIR结构，其N端BIR1结构域相对比较保守（3）。IAPs通常在多种肿瘤细胞中表达，并且保护肿瘤细胞免受凋亡促进因子的作用，在肿瘤细胞的增殖和耐药中起重要作用，是抗肿瘤治疗的一个重要靶点（4）。

多种通过抑制IAP蛋白来治疗肿瘤的方法已在临床前，甚至是临床试验中取得了不错的成绩。其中最为有效的是模拟内源性IAP蛋白抑制剂（Smac）来拮抗IAP蛋白或引起IAP蛋白的泛素化（4）。但是目前的蛋白抑制剂仍然易被蛋白酶降解，生物利用度较低，作用时间短而排泄快；并且多数只能与XIAP 的BIR3结构域结合，而无法抑制包括cIAPs和survivin等在内的其他IAP蛋白，在临床中的推广受到限制（5）。因此下一步需要将SMs结构进一步拆解、简化，得到更具特异性结构的新型IAP蛋白抑制剂（6）。Marcos等（7）发现异喹啉骨架对BIR2结构域C端有很高的选择性，是抑制IAP蛋白的另一种选择，在药物研发中也更具优势。

基于此，本发明以Marcos等得到的基础异喹啉骨架2(见表1)为先导物，导向合成一种新型异喹啉骨架化合物；体内外确证其可以安全有效地抑制卵巢癌生长，逆转卵巢癌耐药，提供具有良好抗肿瘤活性的新型IAP蛋白抑制剂。

参考文献

1. Fulda S, Vucic D. Targeting IAP proteins for therapeutic intervention in cancer. Nature reviews Drug discovery. 2012;11(2):109-24.

2. Vucic D, Fairbrother WJ. The inhibitor of apoptosis proteins as therapeutic targets in cancer. Clinical Cancer Research. 2007;13(20):5995-6000.

3. Owens TW, Gilmore AP, Streuli CH, Foster FM. Inhibitor of Apoptosis Proteins: Promising Targets for Cancer Therapy. J Carcinogene Mutagen e S. 2013;14.

4. Fulda S. Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins as therapeutic targets for radiosensitization of human cancers. Cancer treatment reviews. 2012;38(6):760-6.

5. Dubrez L, Berthelet J, Glorian V. IAP proteins as targets for drug development in oncology. OncoTargets and therapy. 2013;9:1285.

6. Sharma SK, Straub C, Zawel L. Development of Peptidomimetics Targeting IAPs. International journal of peptide research and therapeutics. 2006;12(1):21-32.

7. González-Lόpez M, Welsh K, Finlay D, Ardecky RJ, Ganji SR, Su Y, et al. Design, synthesis and evaluation of monovalent Smac mimetics that bind to the BIR2 domain of the anti-apoptotic protein XIAP. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2011;21(14):4332-6.。

发明内容

本发明目的在于提供一种抑制凋亡抑制蛋白的异喹啉化合物及其制备方法与应用。

本发明提供的抑制凋亡抑制蛋白（IAPs）的异喹啉化合物（1），其结构式为：

。

本发明提供的异喹啉化合物，以化合物（2）为先导物(见表1)设计合成，先导物的结构式为：

表1

。

本发明提供的异喹啉化合物（1）的合成路线为：

合成的具体步骤为：

首先，以2-炔基苯甲醛肟为原料，以三氟甲磺酸银为催化剂，经过6-endo环化反应得到一种含异喹啉环的1，3-偶极子活性中间体；然后，在二苯基环丙烯酮的活化下，2-氨基吡啶对1-3偶极子亲核加成，然后重新芳构化，即得到目标化合物（1）。

合成方法的具体操作如下：

在氮气保护下依次向试管中加入邻炔基苯甲醛肟（1.0 当量，0.3 - 30 mmol），三氟甲磺酸银（0.1 当量）和1.0-100 mL 1, 4-二氧六环，上述混合物在65 - 70^oC下搅拌1小时；再依次向上述反应液中加入二苯基环丙烯酮（2.0>oC下搅拌过夜；TLC点板跟踪至反应结束，快速柱层析分离，即得到目标化合物1。

化合物1表征：¹H>3 )>13C>3 )>-1):>17H₁₅N₃:>+),>

本发明以化合物2为先导物，设计合成了一系列能够与IAP蛋白家族BIR2结构域相互作用的新的异喹啉化合物，使多种IAPs活性降低。一方面拮抗XIAP对Caspase-3的抑制作用；另一方面促进cIAP的泛素化和蛋白酶体的降解，从而具有对抗卵巢癌生长的生物学活性。因此，本发明设计合成的异喹啉化合物，可用于制备抗卵巢癌、逆转卵巢癌耐药的抑制剂（药物）。

本发明的异喹啉化合物通过抑制IAPs起到抗卵巢癌、逆转卵巢癌耐药的作用。经CCK-8、平板克隆实验、Hochest染色、流式细胞术、体内裸鼠皮下移植肿瘤实验、Western Blot、RT-PCR、ELISA法得以证实。本发明化合物分子质量小，口服生物利用度高，临床用药灵活；与多种IAPs的BIR2结构域结合，作用对象和途径更为广阔，抗肿瘤活性也更高，因此在临床应用中更具优势。

具体说明如下：

（1）化合物1的结合位点为IAP蛋白家族的BIR2结构域；

（2）化合物1的作用机制为以下两种：Ⅰ拮抗XIAP对Caspase-3的抑制作用，Ⅱ促进cIAP的泛素化和蛋白酶体的降解；

（3）化合物1对卵巢癌；SKOV3,A2780cisR及A2780的IC₅₀，见表2；

（4）化合物1的体外作用浓度为其IC₅₀；

（5）化合物1的体内作用浓度为其致死剂量（40mg/mL）的1/10，即高剂量组：4mg/mL溶于PBS，低剂量组：4mg/mL溶于PBS，联合给药组：2mg/mL+>

（6）给药期间至最终结束，活性化合物不会对裸鼠的心肝脾肺肾等重要脏器产生重大伤害，初步证实活性化合物相对安全；

（7）活性化合物能够体外增强肿瘤的凋亡能力,具体为24%；

（8）活性化合物能够体内增强肿瘤的凋亡能力,具体为16%；

（9）活性化合物能够体外抑制肿瘤细胞的增殖；

（10）活性化合物能够体内抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，具体为83.37%；

（11）活性化合物能够体内能够有效逆转卵巢癌耐药。

附图说明

图1：化合物1对肿瘤细胞的生长抑制曲线。CCK-8结果显示，化合物1对卵巢癌细胞A2780 and A2780cisR生长的抑制呈浓度依赖性。其中，该图横坐标为化合物作用浓度，单位为ug/mL，横坐标为细胞抑制率。其中左图为卵巢癌细胞系A2780的细胞生长抑制曲线；右图为卵巢癌细胞系顺铂耐药的A2780的细胞生长抑制曲线。

图2：化合物1对肿瘤细胞的凋亡促进情况。Hochest结果显示，相比于空白对照组，化合物1对卵巢癌细胞SKOV3细胞有明显的凋亡促进作用。

图3：化合物1促进肿瘤细胞凋亡的作用机制。Western Blot结果显示，相比于空白对照组，给化合物1和顺铂后裸鼠肿瘤组织中的Caspase-3表达均明显增高。其中，Cleaved caspase-3为被剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase)；Cleaved PARP为被剪切的caspase的切割底物；β-actin为内参。

图4：化合物1抑制肿瘤细胞的增殖和转移。Western Blot结果显示，相比于空白对照组，给化合物1和顺铂后裸鼠肿瘤组织的增殖相关指标PCNA表达均明显升高。其中，PCNA为增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen）；β-actin为内参。

具体实施方式

化合物1的合成：

首先，以2-炔基苯甲醛肟为原料，以三氟甲磺酸银为催化剂，经过6-endo环化反应得到一种含异喹啉环的1，3-偶极子活性中间体；然后，在二苯基环丙烯酮的活化下，2-氨基吡啶对1-3偶极子亲核加成，然后重新芳构化，即得到目标化合物（1）。

合成方法的具体操作如下：

在氮气保护下依次向试管中加入邻炔基苯甲醛肟（1.0 当量，0.3 - 30 mmol），三氟甲磺酸银（0.1 当量）和1.0-100 mL 1, 4-二氧六环，上述混合物在65 - 70^oC下搅拌一小时；再依次向上述反应液中加入二苯基环丙烯酮（2.0>oC下搅拌过夜；TLC点板跟踪至反应结束，快速柱层析分离，即得到目标化合物1。

化合物1表征：¹H>3 )>13C>3 )>-1):>17H₁₅N₃:>+),>

实施例1 CCK-8法检测细胞活力证实化合物1对卵巢癌A2780、A2780cisR具有对抗肿瘤的作用，见图1所示。通过CCK-8法，我们对化合物1作用后的A2780、A2780cisR细胞进行了细胞活力的检测。发现化合物1可以抑制卵巢癌细胞增殖，并且这种抑制作用呈现浓度依赖性。其中在10μg/mL的浓度下对细胞抑瘤率达69.8%。同时根据肿瘤细胞生长抑制曲线计算出化合物1对A2780、A2780cisR的IC50分别为5.9和64.4μg/mL。

实施例2Ho chest染色法检测细胞凋亡率证实化合物1对卵巢癌SKOV3的凋亡具有促进作用。见图2所示。通过Hochest染色的方法，对化合物1作用后的卵巢癌SKOV3进行凋亡能力的分析。其中相比于空白对照组，经过化合物1处理后的卵巢癌A2780和A2780cisR细胞中凋亡细胞数量增多，数量依次为B01002（246.3±35.6）个和（125.7±34.9）个，与空白对照组比较均有统计学差异（P<0.05）。细胞染色结果如图2所见，在化合物1处理过的卵巢癌细胞中可以看到很多明显的核碎裂以及核固缩现象。

实施例3Western Blot法检测PARP、Caspase-3、PCNA表达，证实化合物1对卵巢癌SKOV3细胞具有促进凋亡及抑制增殖的作用，见图3、图4所示。Caspase-3是IAP蛋白抑制凋亡信号通路中的关键蛋白，因此我们这里应用Western Blot的方法检测了Caspase-3在各组肿瘤组织中的表达，另外我们也进行了Caspase切割底物PARP的活化蛋白——cleaved PARP蛋白表达情况的测定。结果显示，各组中cleaved PARP和cleaved Caspase-3表达有差异，给化合物1组的裸鼠肿瘤组织中cleaved PARP和cleaved Caspase-3表达最高。另外通过检测肿瘤组织中PCNA的表达量来反映化合物1对肿瘤增殖抑制的情况，结果显示，给化合物1组的裸鼠肿瘤组织中PCNA表达最低。