一种治疗肺阴虚咳嗽证型器官纤维化的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种治疗肺阴虚咳嗽证型器官纤维化的药物组合物。

背景技术

肺纤维化(Pulmonary fibrosis/PF)疾病是多种原因引起肺部炎症和肺泡持续性损伤及细胞外基质的反复破坏、修复、重建和过度沉积从而导致正常的肺组织结构改变和功能丧失的一类疾病谱，是多种原因引起慢性肺疾病的共同结局，是呼吸衰竭的主要病理基础，其病因和发病机制复杂，其确切的发病机制虽然目前尚未彻底阐明，但多种细胞因子及其网络的调控是其发生发展病理机制的极重要因素。

肺纤维化属于国际关注度极高的一类难治性重大病种，国内外研究认为：纤维化是慢性病久治不愈的根本原因，也是其致残、致死的主因，有近50％的死亡与纤维化有关，而各种慢性肺病久治不愈的根本原因即在于其有纤维化病变。肺纤维化(PF)是器官纤维化中最具代表性、最典型最常发者，其病因复杂，除非典型肺炎可致PF外，很多肺系疾病均可导致PF，至少有150种以上病因与之相关。治疗上，目前尚仅限于非特异性抗炎、免疫抑制剂及糖皮质激素等方法，其共同特点是缺少特异性治疗，且大量使用抗生素和激素，这本身就是导致纤维化和加重纤维化的重要原因。随着其发病率、死亡率的不断上升，PF研究已成为世界关注热点，故寻求中医药等其他疗法已成当务之急。

过去认为器官的纤维化一旦形成，就不能逆转。然而，上世纪九十年代以来，大量实验研究结果表明，包括肺纤维化在内的器官纤维化是可以逆转的。各种器官纤维化之所以都可以经过正确的治疗和调理发生过程相似的逆转，是因为在细胞水平和分子水平上各种纤维化形成的过程就非常相似，具有殊途同归的特点。这些相似的发生过程提示，一种器官纤维化发生机制的研究结果，也适用于其他各种器官纤维化；对一种器官纤维化的有效治疗方法，对阻止、减轻其他各种组织器官纤维化也是有益的(Border WA.Evidencethat TGF-β should be a therapeutic target in diabetic nephropathy.Kidney Int,1998,54:1390-1391.)。有鉴于此，国内外许多学者集中力量从一种器官纤维化的逆转开始，逐渐扩展到多种器官纤维化逆转的研究，获得了器官纤维化可以逆转的大量证据，其中包括肺纤维化。

虽然肺纤维化具有治疗可逆性，但目前尚缺乏满意的西医药防治手段，这可能与肺纤维化发病的多因素、病变的多靶点、病理进程的多样性等相关。作为一种典型的复杂性疾病，以单靶点为主的西医化学药物经常显得无能为力，中医药等传统医学在器官纤维化的治疗方面拥有很大的潜力和优势，基于疗效确切的中医药开发抗器官纤维化的药物，特别是开发抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化的药物，前景日益广阔。

中医认为肺纤维化属于典型的“本虚标实”病证，其病机为“病已久→本已虚”、“虚、阻相夹”，可归属中医络病范畴(李戎.论艾灸肺俞膏肓俞治疗肺纤维化的中医理论基础与施治依据.辽宁中医杂志,2004,31(4):291-293.)。杨珂等报道了一种扶正化瘀方，主要成分为绞股蓝、丹参、冬虫夏草，用于抗大鼠肺纤维化，效果明显。专利号：CN201110162621.6，提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，其原料组成为：人参5-15份、丹参5-15份、当归1-11份、黄精5-15份、紫苏子5-15份、白芥子1-11份、枳实1-11份、紫金牛5-15份，可以抑制人胚肺二倍体纤维母细胞2BS细胞株增殖的功效，治疗肺纤维化。专利号：201110162761.3，提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，其原料组成为：人参5-15份、丹参7.5-22.5份、银杏叶7.5-22.5份、天门冬7.5-22.5份、黄精7.5-22.5份、瓜蒌皮7.5-22.5份、当归2.5-7.5份、三七2.5-7.5份，可以改善器官纤维化患者临床症状及生存质量。

根据目前的治疗情况而言，中医药在对器官纤维化(尤其是肺纤维化)的治疗上，取得了重大的研究进展，因此，从中医药角度出发研发治疗器官纤维化的新药，已成为当前的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肺阴虚咳嗽证型器官纤维化的新药物组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种治疗肺阴虚咳嗽证型器官纤维化的药物组合物，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黄精20-28份，百合17-23份，麦冬17-23份，天冬17-23份，百部10-15份，紫菀10-15份，款冬花7-13份，射干7-13份，红景天15-20份，橘络7-13份，枳实10-15份，山楂7-13份，甘草4-8份。

进一步地，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黄精24份，百合20份，麦冬20份，天冬20份，百部12份，紫菀12份，款冬花10份，射干10份，红景天18份，橘络10份，枳实12份，山楂10份，甘草6份。

其中，紫菀、款冬花可优选使用蜜炙品，山楂为生山楂。

其中，所述药物组合物是由所述重量配比的原料药的药粉、水提取物或/和乙醇提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为经胃肠道吸收制剂。

本发明还提供了上述药物组合物的制备方法，它包括如下步骤：

(1)按所述重量配比称取原料药；

(2)取原料药加水煎煮，合并水煎液，加上药学上可用的辅料或辅助性成分制备成常规制剂。

本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗器官纤维化的药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗肺纤维化的药物。

更进一步地，所述药物是增加肺组织内基质金属蛋白酶-3的药物。

进一步地，所述药物是治疗肺阴虚咳嗽证型的肺纤维化的药物。

目前已公认“整体观念”、“辨证施治”、“复方使用”、“复方配伍用药如用兵”是中医最科学最有效的几大优势，其中“复方配伍用药如用兵”是非常科学的中医药原创理论。中医组方中各药如行兵布阵那样环环相扣的严密配伍，是其优于西医化学药配方的有效手段。中医方剂理论认为，每一方剂，不仅需要根据病因病机选择合适的药物妥善配伍，同时也应符合组方的基本结构，即“君、臣、佐、使”的组方配伍理论，所谓“君、臣、佐、使”的组方配伍，就是其建立在对疾病病机的全方位判断基础上的科学配比。中医用方通过多环节、多靶点整合调节的生物学机制，对肺纤维化这样具有发病多因素、病变多靶点、病理进程多样性(“三多”)等复杂特点、治疗困难的疾病或其症状进行调控，可以取得比西医化学药更好、更持久的治疗效果，且避免了西医化学药的毒副作用，而这种疗效是建立在上述中医传统原创理论的正确指导之上的，本发明药物组合物正遵循了这一原则。

在肺纤维化的各种证型中，阴虚者很多，阴虚咳嗽亦复不少，而在中医理论中，则咳嗽广涉肺、脾、肾三脏，特别是肺纤维化这种病程很久、久病脏虚的津液亏少咳嗽，不仅与肺、脾、肾三脏本已虚弱有关，且更可使肺、脾、肾三脏受到进一步戕损，而亟需匡扶此三脏正气，故本发明组方以匡扶肺、脾、肾三脏的黄精为君药。天冬可助黄精滋养肺肾，麦冬可助黄精滋养脾肺，百合助黄精养心肺(另还可防心火刑肺金)，故此三味为臣药，襄助君味。病情主症为咳嗽，需要疗效极佳的镇咳化痰之品抗抑主症，故使用紫菀、冬花、百部、射干镇咳为左路佐药。中医治咳理论认为：“善治咳者治痰，善治痰者治气。”即镇咳需化痰(故前述佐药紫菀、冬花、射干等均善化痰)，化痰需行气，所以特用枳实行气，以充任佐药之佐药。另外，中医认为“久病入络”，且纤维化的病机也正为小络不通，必须活血化瘀通络，而红景天、山楂、橘络相配，就善于活血化瘀通络而不伤正，正可入络疏通，所以遣为右路之佐药，以辅佐前药建功。甘草素善调和诸药，常以之为使，加之其可缓中止咳，因而本发明组合物也以甘草担任使药，协同奏效。

以上君臣佐使各组药味职司分明，相辅相成，充分发挥了中医学所独有的复方配伍用药如排军布阵般的思辨性科学研究方法论精髓，可共奏养肺阴止久咳、缓解咳嗽之标，减轻患者痛苦，提高其生存质量的功效，对于本发明组方所针对的肺纤维化证型有着较好的治疗效果且可改善其相关病理指标，使纤维化病变向好的方向发展，为临床用药提供了一种新的选择。

附图说明

图1为MMP-3蛋白测定图，其中，1为空白组；2为模型组；3为艾灸组；4为本方组。

具体实施方式

实施例1 本发明药物组合物的制备

取黄精24克，百合20克，麦冬20克，天冬20克，百部12克，紫菀12克，款冬花10克，射干10克，红景天18克，橘络10克，枳实12克，山楂10克，甘草6克。各药味按量称取，掺以足量的净水，武火煎沸后改文火再煎煮10分钟至15分钟，收集水煎液后，再加水煎煮2次，合并各次水煎液，即得汤剂。

本方中，若红景天使用鲜品，则用量应增加1倍。同时，紫菀、款冬花亦可蜜炙入煎，力较温润；山楂宜用生品，取其活血之功，故不主张炒焦。

实施例2 本发明药物组合物的制备

取黄精20克，百合23克，麦冬23克，天冬23克，百部15克，紫菀15克，款冬花13克，射干13克，红景天20克，橘络13克，枳实15克，山楂13克，甘草8克。先以70％v/v乙醇提取2次后，合并醇提液，药渣再以水煎煮2次，合并水煎液。分别将醇提液、水煎液浓缩后，混合，再加入适当糊精、可溶性淀粉，制粒，即得颗粒剂。

实施例3 本发明药物组合物的制备

取黄精28克，百合17克，麦冬17克，天冬17克，百部10克，紫菀10克，款冬花7克，射干7克，红景天15克，橘络7克，枳实10克，山楂7克，甘草4克。各药味按量称取，掺以足量的净水，武火煎沸后改文火再煎煮10分钟至15分钟，收集水煎液后，再加水煎煮2次，合并各次水煎液，浓缩、干燥后，加入适量微晶纤维素，混匀后，装胶囊，即得胶囊剂。

实施例4 本发明药物组合物的制备

取实施例1制备的汤剂，静置，取上清液，浓缩后，干燥，粉碎，备用；取适量聚乙二醇4000，熔融后，将上述药粉加入熔融基质中，75-85℃下保温；采用各型滴丸机，滴口内/外径及滴速适度，将其滴入二甲基硅油中，收集滴丸，即得滴丸剂。

实施例5 本发明药物组合物的制备

取实施例1制备的汤剂，浓缩后，加适当淀粉、糊精或/和微晶纤维素，制粒。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例 本发明药物对大鼠实验性肺纤维化的治疗作用

1、实验动物和材料

1.1实验动物

实验动物选取100只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重为200g±20g，适应性喂养一周，保持室温18-25℃，相对湿度55-70％，实验期间大鼠自由饮水与进食。

1.2实验药品

本发明药物组合物：实施例1制备的汤剂，配成1.5g生药/ml的药液。

博莱霉素原液zeocin125mg/支，用时以无菌生理盐水稀释成4mg/ml的溶液。

0.9％生理盐水(250ml/瓶)。

1.3实验试剂及主要仪器

RNA prep pure Tissue Kit(组织总RNA提取试剂盒)。

RNAstore reagent(RNA样本保存液)。

Parafim封口膜。

ReverTra Ace qPCR RT Kit(RT-PCR高性能逆转录酶试剂盒)。

THUNDERBIRD qPCR Mix(“雷鸟”定量PCR试剂)。

Rabbit Anti-MMP-3antibody(兔抗MMP-3抗体)。

eblot蛋白转印试剂盒。

动物组织蛋白提取试剂盒。

Pro-light HRP化学发光检测试剂。

BCA蛋白定量试剂盒。

Western封闭液封闭抗体。

AccuPower GreenStar qPCR PreMix(实时荧光定量PCR试剂盒)。

RocketScriptTM>

DF110型电子分析天平秤。

CFX96型实时荧光定量PCR仪。

L002O5C-1型eblot干式快速蛋白转印系统。

2实验方法

2.1造模方法

博莱霉素A5(BLM_A5)为最常用的肺纤维化诱导剂，由于其对肺的毒性作用的可预测性，已成为当今经典的肺纤维化动物模型诱导剂。具体方法如次：在乙醚麻醉下，将大鼠仰卧位固定于手术板上，拉出舌，压迫舌腹，暴露喉头，额镜直视下趁动物吸气瞬间，将与注射器相连的7号钝头腰穿针经气管软骨环间隙朝向心端插入气管，将大鼠直立，继续进针1.5～2.0cm，回抽见空气无阻力后，将药液注入气管内。空白组(n＝10)注入生理盐水2ml/Kg。其余3组(模型组，n＝30；本发明药物组合物治疗组(以下简称“本方组”)，n＝30；艾灸对照组，n＝30。一次性缓慢注入博莱霉素原液稀释液5mg/Kg，并注入0.2ml空气，完毕后立即将大鼠手术板直立，旋转，使药物充分均匀的散布于双肺。几分钟后，大鼠即可醒来并随意觅食。

2.2动物分组

100只实验大鼠随机分为4组：模型组30只、本方治疗组30只、艾灸对照治疗组(下称艾灸组)30只。另设空白对照组10只。

2.3动物治疗

2.3.1空白组、模型组不给予任何治疗和干预措施，从造模后第7天开始，只在每天同一时间内以相同的方式进行抓取、固定，并按等容量生理盐水灌胃作为对照。

2.3.2本方组：从造模后第7天开始，每只每天以本发明药物中剂量组按人剂量的10倍，即5g生药/kg给大鼠灌胃，每日1次，10次为1疗程，共治疗3个疗程，疗程间休息1天。

2.3.3艾灸组：于造模后第7天开始治疗，将大鼠固定在自制的手术板上，取“肺俞”、“膏肓俞”穴(腧穴定位参照《实验针灸学》及《中国兽医针灸学》)，先用剃毛器在其穴位周围剔除被毛，用马克笔对穴位进行标记，同时在施灸前用手指触摸确定穴位，并在其穴位处涂少量白凡士林固定艾炷，后开始采用麦粒灸，将提前自制好的麦粒灸放其穴位处，左手固定大鼠下部三分之二处，右手施灸，左右交替施灸(以不灼伤其皮肤为度)。每穴3壮，每壮重5mg。每天治疗一次，10次为1疗程，共治疗3个疗程，疗程间休息1天。

3、指标检测与方法

肉眼观察一般情况(观察大鼠的食欲、神态、反应能力、被毛、肌肉及呼吸情况)及肺组织的情况，计算各组大鼠肺系数[肺系数(LC)＝肺湿重(g)/体重(kg)×100％]，光镜观察肺组织病理学改变。

3.1标本的采集与处理

最后一次治疗后，称取体重，断颈处死大鼠，开胸取其肺组织，肉眼观察其肺组织的形状、色泽、表面的状态、病灶的特征。分别取150mg肺组织，按比例放入RNAstore reagent样本保存液，Parafim封口膜迅速封口，放入四度冰箱保存待检。常规石蜡包埋、固定﹑切片。

3.2实时荧光定量PCR检测MMP-3

检测步骤：

⑴匀浆处理，研磨，56度10-20分钟。

⑵12000rpm(-13,400xg)离心2-5分钟，取上清。

⑶加入无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR3中，12000rpm(-13,400xg)离心30-60秒。

⑷向CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12000rpm(-13,400xg)离心30-60秒。

⑸DNase I工作液。

⑹向吸附柱CR3中央加入80ul的DNase I工作液，室温放置15分钟。

⑺向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12000rpm(-13,400xg)离心30-60秒。

⑻向吸附柱CR3中加入500ul漂洗液RW,室温静置2分钟，12000rpm(-13,400xg)离心30-60秒。

⑼重复步骤8。

⑽12000rpm(-13,400xg)离心2分钟，将吸附柱CR3置于室温，彻底晾干

⑾将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100ul RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12000rpm(-13，400xg)离心2分钟，得到RNA溶液(-70度保存)。

⑿依据RNA prep pure Tissue Kit说明书进行RNA纯度及浓度检测。

⒀依据RocketScriptTMRT PreMix说明书进行RNA逆转录分析。

3.3Western Blot检测MMP-3

(1)样本总蛋白的提取及定量

·切取冰冻组织约100mg置1.5mlEP管中，PBS漂洗两遍同时充分剪碎，离心去上清。然后每管加4℃裂解液lml，继续剪碎、混匀，冰上孵育20分钟；14000转离心，五分钟，取上清备用

·取上清5ul，依据BCA蛋白定量试剂盒说明书操作；

(2)蛋白电泳及转膜

·样品煮沸5min，冷却后取50ug上样；

·电泳条件:SDS-PAGE胶，电压100V，90－120分钟。

·PVDF膜转印条件：300-400mA，10分钟；

·Western封闭液封闭抗体，加入Western封闭液使其充分覆盖膜，室温下轻微震荡一小时，即完成；

(3)抗体孵育及化学发光

·一抗孵育(Rabbit Anti-MMP-3antibody1：500稀释)，4℃过夜；

·二抗孵育(辣根酶标记羊抗兔IgG1：500稀释)，37℃，1小时；

·化学发光使用Pro-light HRP化学发光检测试剂盒说明书操作；X片扩大

·以MMP-3蛋白/β-actin灰度值表示

4.数据处理

采用SPSS18.0统计软件包进行分析，结果以均数±标准差()表示。组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SD-t法检验，P＜0.05为有统计学意义。

5.实验结果

5.1肉眼观察

5.1.1一般情况观察见表1

表1 大鼠一般情况观察结果

5.1.2肉眼观察肺组织的情况

空白组：外观肺叶轮廓清晰，双肺色泽正常，呈淡粉红色，表面光滑，弹性好。

模型组：肺脏质地变实，肺叶呈暗红色，部分肺叶呈灰白色，肺叶轮廓不清，整个肺脏萎缩，体积缩小。

本方组：表面略粗糙，肺叶颜色稍暗，质地较软，体积无明显变。

艾灸组：表面较粗糙，肺叶颜色较暗，质地尚软，体积无明显变。

5.1.3光镜观察肺组织的情况

空白组：镜见肺组织结构正常，肺泡间隔无纤维化，间质无炎性细胞浸润，肺泡形态正常，上皮细胞排列规则。

模型组：肺泡间质内纤维化显著，间隔增宽，肺泡壁破坏，部分实变，肺泡部分塌陷，肺泡间隔内可见小灶状出血点，淋巴、浆细胞等炎细胞浸润。

艾灸组：肺泡纤维化不太明显，间隔未见明显增宽，少许淋巴、浆细胞等炎细胞弥散。

本方组：肺泡纤维化不明显，间隔未见增宽，少许淋巴、浆细胞等炎细胞弥散。

5.1.4造模前后各组大鼠体重变化情况

表2 各组大鼠体重的比较()单位：g

#表示与对照组比较P＜0.05，*表示与模型组比较P＜0.05

造模前各组大鼠体重无显著差异(P＞O.05)；

各组大鼠造模30天体重均明显低于对照组，差异显著(P＜O.05)；

5.1.5各组大鼠肺系数比较见表3

表3 肺系数

#表示与空白组比较P＜0.05,※表示与模型组比较P＜0.05

由表3可知，各组肺系数较空白组明显增加(P＜0.05)；本方组与艾灸组肺系数均较模型组明显减小(P＜0.05)；本方组与艾灸组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。

5.1.6各组大鼠肺组织MMP-3mRNA适时荧光定量分析结果

各组大鼠肺组织MMP-3基因mRNA适时荧光定量分析结果表():见表4

表4 MMP-3基因mRNA相对表达量

￥与空白组比较P＜0.01＄与模型组比较P＜0.05

结果显示：空白组肺组织中MMP-3基因高表达，与各实验组比较均有极显著性差异(P＜0.01)。本方组：本方治疗后，MMP-3基因表达与模型组比较差异具显著性(P＜0.05)；本方组MMP-3基因表达与艾灸组比较差异不显著(P＞0.05)。

5.1.7Western-blot检测结果

图1显示：空白组蛋白表达值最高，其它三个组与空白组比较蛋白表达较低；本方组与模型组、艾灸组比较蛋白表达较高；艾灸组与模型组比较蛋白表达较高。

6.讨论

器官纤维化的病因和发病机制比较复杂，但各种器官纤维化的发病机制和病理转归基本相同，故以较多发的肺纤维化作为研究对象，即可基本推知其他各种纤维化的病理转归。随着对纤维化研究的不断深入，已经认识到基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)在纤维化的发生发展中具有相当重要的意义，而这个家族中的基质金属蛋白酶-3(MMP-3)则更有其特殊的作用。

肺纤维化的发生发展主要就是由于细胞外基质(ECM)的过度沉积在起着重要作用，而MMP则主要作用于ECM。MMP是一组对ECM有非常广泛降解功能和调节ECM动态平衡的酶系大家族，因其含有锌离子或钙离子故名，一种MMP至少能够分解一种基质成分。MMP-3在MMPs家族中有其特别的作用，它不仅可以降解FN、LN、蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型胶原等多种底物，还有激活其他种类MMPs的作用。研究认为MMP3可促进肺血管基底膜降解，参与肺血管重塑的全过程，在肺部疾病的发生发展过程中起着十分重要的作用，并认为MMP-3是肺纤维化发生的中介。

由此可见，本发明实验通过干预MMP-3具有提示本发明药物组合物疗效作用的充分科学依据，并可推知，本发明药物组合物对其他器官的纤维化也有治疗作用。

综上，本发明药物组合物能有效治疗或辅助治疗器官特别是肺的纤维化，改善其相关指标，从而达到缓解其症状以提高其生存质量的治疗效果，且避免了西医化学药物的严重毒副作用，为临床用药提供了一种新的选择。