茜草科类型环肽制备方法及其用作为Hippo-YAP信号通路抑制剂

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一系列茜草科类型环肽用作为 Hippo-YAP信号通路抑制剂，以其作为有效成分的药物组合物，其制备方法及 其在癌症治疗及预防中的应用。

背景技术：

Hippo通路是近年来在果蝇体内发现的一条新的细胞信号通路，在器官大小 调控、癌症发生、组织再生、以及干细胞的功能上发挥重要作用。Hippo通路高 度保守，其核心由四个蛋白组成，在果蝇中为Hippo(Hpo)，Salvador(Sav)， Wts和Mats；哺乳动物中相应的为Mst1/2，Sav1，Lats1/2和Mob。其中Wts是 第一个被发现的Hippo通路成员，在果蝇的遗传筛选实验中，发现wts基因突变 可导致组织的过度生长。在四个核心成员的上游，存在诸多蛋白对其进行调节， 果蝇中最初发现的有Ex，Mer，Kibra等，而更上游受到Fat等的调节。核心成 员的下游，Hippo通路可负调节一个转录辅激活因子，果蝇中为Yki，哺乳动物 中为YAP/TAZ。YAP(Yes-associated protein)蛋白是Hippo通路的开关蛋白， 在该通路中发挥着重要作用。Yki(YAP/TAZ)作为转录辅激活因子，在Hippo 通路处于抑制状态时，可以入核与转录因子结合，激活下游基因的表达；而当 Hippo通路处于激活状态时，Yki(YAP/TAZ)被Wts(Lats1/2)磷酸化，滞留 于胞质中处于非活性状态并最终泛素化降解，从而抑制其活性。最初发现与Yki 结合的转录因子是Scalloped(Sd)，其后又发现Hth/Tsh，Mad等；哺乳动物中 与YAP/TAZ结合的转录因子为TEADs(与Sd同源)，Smad1/2/3等。

yap是一个原癌基因，YAP蛋白作为转录辅激活因子入核，激活下游基因表 达后，能够促进细胞的增殖生长，抑制细胞的凋亡。其mRNA在许多肿瘤细胞 内均高表达。此外有实验表明YAP过表达可引起上皮间充质转化，而后者常与 肿瘤转移相关；另外，YAP过表达会使小鼠肝脏肿大并最终导致肿瘤的发生。

综上所述，Hippo-YAP信号通路在肿瘤发生、发展中起着重要作用。

TEAD家族转录因子在调控基因表达上被确认为是YAP和TAZ的重要伙伴。 结缔组织生长因子(CTGF)是典型的YAP-TEAD直接调控的靶基因，它在YAP 诱导的细胞增殖和非锚定依赖生长中发挥重要作用。干扰YAP-TEAD的相互作 用可以消除YAP依赖的基因转录，并在很大程度上减少YAP诱导的细胞增殖、 致癌基因转化和上皮向间质转化。解析YAP-TEAD复合物的晶体结构发现YAP 的N端结构域包裹着TEAD的C端结构域形成的球状结构。特别是YAP从86 到100位的残基肽段通过将侧链插入到TEAD形成的口袋里而在YAP-TEAD的 相互作用中发挥重要作用。这些残基位点可能成为对YAP-TEAD相互作用进行 药理学干扰的很好的靶位点。在此基础上，Duojia Pan实验室发现小分子化合物 verteporfin可以通过干扰YAP和TEAD的相互作用，进而抑制肝肿大和肿瘤发 生。这一发现具有重要的学术意义和很好的应用前景，也为进一步开发以 Hippo-YAP通路作为靶位点的特异性小分子抗癌药物带来了希望。

现有技术中未见茜草科类型环肽作为Hippo-YAP信号通路抑制剂及用于治 疗相关癌症的报道。

茜草科类型环肽在茜草科植物中的分离纯化较为困难，最重要的原因是茜草 属植物中富含蒽醌类色素，且环肽含量较低。现有报道的分离方法多是对茜草属 植物中环肽类成分进行系统分离，尚无对特定分子，尤其是针对具有显著活性的 RA-V(1)的快速分离纯化方法。近年从茜草属植物中分离环肽类成分已公开发 表如下方法：(1)茜草科茜草属植物小红参的根用甲醇提取后，甲醇浸膏加水混 悬后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇部分依次用 正反相硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶柱层析，HPLC等技术分离纯化，得到 系列环肽。参见：Fan,J.T.et al.Rubiyunnanins C-H,cytotoxic cyclic hexapeptides  from Rubia yunnanensis inhibiting nitric oxide production and NF-κB activation. Bioorganic&medicinal Chemistry,2010,18,8226-8234。其缺点在于萃取对富集环 肽类化合物作用不明显，工作量大且效率低。(2)茜草科茜草属植物茜草的根用 甲醇提取后，甲醇浸膏经HP-20大孔树脂、硅胶、活性炭、氨丙基键合硅胶色 谱柱层析得到环肽富集部分。此环肽富集部分用甲醇重结晶，再结合各种层析材 料包括HPLC对结晶或母液进行分离纯化，得到一系列环肽。参见：Hitotsuyanagi, Y.et al.Isolation,structure determination,and synthesis of allo-RA-V and neo-RA-V, RA-series bicyclic peptides from Rubia cordifolia L.Chemistry-A European Journal 2012,18,2839–2846。其缺点在于活性炭对样品的吸附性强，氨丙基键合硅胶材 料价格较贵，实验室和工业上不常用，甲醇重结晶技术可控性和重现性不好。

发明内容：

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类茜草科类型 环肽化合物作为新型Hippo-YAP信号通路抑制剂；提供制备该类化合物的方法， 该方法可快速分离纯化目标化合物RA-V(1)，效率高，目的性强，分离步骤少， 操作方便，可控性和重现性好，溶剂可以反复回收利用，成本低，适用于工业生 产；本发明的目的还在于提供以茜草科类型环肽化合物为有效成分的药物组合 物；以及其在制备治疗YAP异常激活的相关癌症的药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

以下述结构式所示的茜草科类型环肽RA-V(1)或其药理学上容许的盐为 有效成分的Hippo-YAP信号通路抑制剂，

药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的茜草科类型环肽RA-V(1)或 其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

用所述的茜草科植物中的茜草科类型环肽RA-V(1)或其药理学上容许的 盐作为Hippo-YAP信号通路抑制剂。

所述的茜草科类型环肽RA-V(1)或其药理学上容许的盐在制备Hippo-YAP 信号通路抑制剂中的应用。

所述的茜草科类型环肽RA-V(1)或其药理学上容许的盐在制备治疗与预 防YAP异常激活的相关癌症的药物中的应用。

本发明还提供了制备如上所述的茜草科类型环肽化合物RA-V(1)的方法， 取多花茜草(Rubia wallichiana Decne.)的根及根茎，经干燥、粉粹后，用甲醇 回流提取3-4次，时间为2-4小时，提取液经减压浓缩得总浸膏；将总浸膏经 D101大孔树脂柱层析，用0％，50％，100％的甲醇/水梯度洗脱，结合环肽TLC 检测方法取100％甲醇洗脱含有环肽RA-V(1)的部分；以下的每一步骤都须结 合环肽TLC检测方法来进行分离纯化；含环肽RA-V(1)部位经硅胶柱层析， 用3:1-1:1的石油醚/丙酮梯度洗脱，合并含RA-V(1)部位；该部位继续经硅胶 柱层析，用30:1-1:1的氯仿/甲醇梯度洗脱，即得到RA-V(1)。

本发明对茜草科茜草属植物多花茜草中环肽化合物RA-V(1)进行了提取 分离纯化工艺研究，利用D101大孔树脂和硅胶柱层析，从中快速分离得到了 RA-V(1)。之后用RA-V(1)等小分子化合物处理稳定表达Myc-YAP/TEAD/CTGF  promoter-luciferase荧光素酶活性检测系统的HEK293细胞进行初步筛选，根据 细胞毒性和对上述荧光素酶活性检测系统的活性抑制程度，挑选出一些阳性化合 物。然后用同样的方法处理瞬时表达beta半乳糖苷酶/Flag-YAP/Gal4-TEAD4/ 9XUAS-luciferase荧光素酶活性检测系统的HEK293细胞进行再次筛选，发现了 RA-V(1)对Hippo-YAP通路具有显著抑制作用；通过蛋白质印记发现RA-V(1) 能够显著抑制YAP通路下游靶基因CTGF和Cyr61的蛋白表达水平，为新型YAP 信号通路抑制剂。

本发明的所述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐，可以列举例如与盐 酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、 柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂， 钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明所述的治疗癌症的药物组合物，由茜草科类型环肽化合物与药学上可 接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉 针剂等。由于茜草科类型环肽RA-V(1)可从多花茜草以及同属植物中提取分 离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也 是本领域的常规知识。因此，由茜草科类型环肽化合物与相应载体制备的各种药 物剂型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀 释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸 收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土； 润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物 中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的 方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片 剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、 酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本 发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性 成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含 有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病 的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5 mg/kg体重。可以一次或多次施用。

附图说明：

图1为本发明的多花茜草中茜草科类型环肽RA-V(1)的制备方法流程图；

图2为本发明的茜草科类型环肽RA-V(1)抑制Hippo-YAP通路荧光素酶 活性检测系统的活性；

图3为本发明的茜草科类型环肽RA-V(1)抑制Hippo-YAP通路下游靶基 因CTGF和Cyr61的蛋白表达水平；

图4为稳定转染Myc-YAP/TEAD/CTGF promoter-luciferase荧光素酶活性检 测系统的模式图；

图5为瞬时表达beta半乳糖苷酶/Flag-YAP/Gal4-TEAD4/9XUAS-luciferase 荧光素酶活性检测系统的模式图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并 不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范 围。

实施例1：

茜草科类型环肽RA-V(1)的制备方法：

取多花茜草的根及根茎(1kg)，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次(3 L×3次)，时间为3h、3h和2h，提取液经减压浓缩得总浸膏180g；将总浸膏 经D101大孔树脂层析，用甲醇/水梯度洗脱(100:0，50:50，0:100)，结合环肽 TLC检测方法合并其中含有环肽的100％甲醇洗脱部分；以下的每一步骤都须结 合环肽TLC检测方法来进行分离纯化。合并后的环肽部分(11g)经硅胶柱层析， 用石油醚/丙酮(3:1-1:1)梯度洗脱，合并含有环肽RA-V(1)部位，得总RA-V 部位(120mg)；总环肽部位继续经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(30:1-1:1)梯度 洗脱，既得环肽RA-V(1)(21mg)。

环肽RA-V(1)的结构如下所示：

实施例2：

本发明的茜草科类型环肽RA-V(1)在稳定转染Myc-YAP/TEAD/CTGF  promoter-luciferase荧光素酶活性检测系统的HEK293细胞上进行初筛，然后在 瞬时转染beta半乳糖苷酶/Flag-YAP/Gal4-TEAD4/9XUAS-luciferase荧光素酶活 性检测系统的HEK293细胞中进行复筛，发现RA-V(1)可以抑制Hippo-YAP 通路的活性。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：荧光素酶报告基因是检测信号通路活性常用的实验方法，荧光素 在荧光素酶催化下发出荧光，通过检测到的荧光强度体现信号通路活性的强弱。

在HEK293稳定细胞中，Myc-YAP/TEAD/CTGF promoter-luciferase荧光素 酶活性检测系统中高表达的Myc-YAP蛋白通过内源表达的TEAD蛋白作用于 CTGF promoter，启动荧光素酶的表达，从而表现出高强度的荧光信号。当有特 异性的小分子化合物抑制其中的某个环节进而抑制荧光素酶的表达水平时，荧光 强度会明显减弱。

上述荧光素酶活性检测系统的模式图如图4所示。

Cell Titer-Blue^TM细胞活性检测以均质、荧光的方法监控细胞活性。检测的 基础是活性细胞能将一种氧化还原染料(刃天青)转化成一种荧光终产物(试卤 灵)。由于非活性细胞很快丧失新陈代谢能力，故而不能生成荧光信号。均质的 检测方法就是将产生信号的试剂直接加到含有血清的细胞培养基中，经过孵育， 用96孔板荧光计或分光光度计来记录数据。

在瞬时表达beta半乳糖苷酶/Flag-YAP/Gal4-TEAD4/9XUAS-luciferase荧光 素酶活性检测系统的HEK293细胞中，以持续表达的beta半乳糖苷酶作为内参， 它能够水解无色底物ONPG，生成黄色产物，通过测量吸光值，可以得出beta 半乳糖苷酶的活性。另外，Gal4-TEAD4通过与启动子序列的特异性结合启动荧 光素酶的表达。在Flag-YAP高表达情况下，Flag-YAP与TEAD结合，能够极大 地激活下游启动子，进而表现出高强度的荧光信号。当有特异性的小分子化合物 抑制其中的某个环节进而抑制荧光素酶的表达水平时，荧光强度会明显减弱。

上述荧光素酶活性检测系统的模式图如图5所示。

实验方法：(1)细胞培养：HEK293细胞培养于含有10％胎牛血清和100U/ml  penicillin、0.1mg/ml streptomycin的DMEM培养基中。(2)化合物处理：做小 分子化合物的初步筛选时，将稳定转染Myc-YAP/TEAD/CTGF promoter-luciferase 荧光素酶活性检测系统的HEK293细胞以每个孔2500个细胞接种到384孔板中， 或以每个孔20000个细胞接种到96孔板中。接种24h后，细胞密度达到 80％～90％，向培养基中加入终浓度为10μg/ml的化合物，作用24h后，检测细 胞活力和荧光素酶活性。做小分子化合物复筛时，将HEK293细胞接种到100mm 的细胞培养皿中，当细胞密度达到40％～50％时，瞬时转染beta半乳糖苷酶 /Flag-YAP/Gal4-TEAD4/9XUAS-luciferase荧光素酶活性检测系统，转染24h后， 将细胞消化重悬计数，然后以每个孔20000个细胞接种到96孔板中，接种24h 后，向培养基中加入终浓度为10μg/ml或1μg/ml的化合物，作用24h后，检测 beta半乳糖苷酶的活性和荧光素酶活性。(3)初步筛选的细胞活力和荧光素酶活 性检测：在化合物作用了24h后，将20μl Promega公司的Cell Titer-Blue^TM细 胞活性检测试剂直接加入96孔板的100μl细胞培养基中，反应4h后，取出反 应后的100μl培养基至不透明的96孔板，按照540nm Ex/590nm Em读取荧光 强度即细胞活力数据。另外，吸去细胞培养基的细胞用Promega公司的荧光素酶 检测试剂盒进行荧光素酶活性检测。将培养基去除干净，加入50μL细胞裂解液， 在震荡仪上充分裂解5分钟，取20μl细胞裂解液与20μl荧光素酶底物混合， 立即读取荧光素酶活性。另外取20μl细胞裂解液与60μl beta半乳糖苷酶底物 ONPG混合，37℃下孵育15分钟后，读取420nm波长下的吸光值。

实验结果如图2。初步筛选中，利用稳定表达Myc-YAP/TEAD/CTGF  promoter-luciferase荧光素酶活性检测系统的HEK293细胞，在384孔板中做细 胞水平的小分子化合物处理，得到高通量荧光素酶活性的初步筛选数据，按照抑 制程度达到60％及以上的标准，挑选出可能具有抑制活性的阳性小分子化合物， 然后在96孔板中对上述阳性数据做进一步验证，同时进行细胞活力检测，最终 以细胞活力达到80％及以上，活性抑制程度达到40％及以上作为标准，初步筛 选出一些可能具有YAP活性抑制功能的小分子化合物。

初步筛后得到的阳性小分子化合物，以beta半乳糖苷酶 /Flag-YAP/Gal4-TEAD4/9XUAS-luciferase荧光素酶活性检测系统分别在10 μg/ml和1μg/ml的作用浓度上来进行复孔复筛，得到的数据以在10μg/ml的作用 浓度上活性抑制程度达到75％及以上并且在1μg/ml的工作浓度上活性抑制程度 达到40％及以上作标准，挑选出更可能具有YAP活性抑制功能的小分子化合物。 其中RA-V(1)在10μg/ml及1μg/ml浓度下均能显著抑制YAP活性，提示其为 一类新型Hippo-YAP信号通路抑制剂。

实施例3：

本发明的茜草科类型环肽RA-V(1)在HeLa细胞中，通过蛋白质印记技术 检测其对Hippo-YAP通路下游靶基因CTGF和Cyr61蛋白表达水平的抑制活性。 实验原理、方法和结果如下：

实验原理：蛋白质印迹又称为免疫印迹，这是一种可以检测固定在固相载体 上蛋白质的免疫化学技术方法。蛋白质印迹采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检 测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS是一种阴离子表面 活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及 三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，从而使蛋白在 SDS-PAGE中仅根据蛋白质的分子量的差异进行分离。经过SDS-PAGE(聚丙烯 酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，以共价键形式吸附到硝酸纤维素薄膜上，且 能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以蛋白质或多肽作为抗原，与 对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色 或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

实验过程：(1)细胞培养：HeLa细胞培养于含有10％胎牛血清和100U/ml  penicillin、0.1mg/ml streptomycin的DMEM培养基中。(2)化合物处理：为促 进细胞短时间内贴壁，在多孔板中加入含有纤连蛋白的PBS缓冲液，在4℃环境 下过夜放置使多孔板的底部覆盖上一层纤连蛋白，然后将不同浓度的RA-V与 HeLa细胞同时接种到多孔板中作用4.5h后收取蛋白样品。(3)蛋白质印迹检测： 将蛋白质样品进行SDS-PAGE分离后，转移到硝酸纤维素薄膜上，用5％脱脂奶 粉封闭1小时后，用TBST缓冲液润洗三次，然后在4℃环境下分别用tubulin、 CTGF、Cyr61抗体缓慢震荡孵育过夜。第二天，回收抗体，用TBST缓冲液快 速震荡洗涤三次，每次洗10分钟。然后用相应抗体的二抗室温下孵育1小时， 用TBST缓冲液快速震荡洗涤三次，然后利用底物化学发光检测内源tubulin、 CTGF、Cyr61的蛋白表达水平，其中tubulin作蛋白检测的上样量内参。

实验结果如图3。RA-V(1)能够明显抑制YAP下游靶基因CTGF和Cyr61 蛋白表达水平，提示其为一类新型Hippo-YAP信号通路抑制剂。

实施例4：

实施例1所得化合物1，加入4％的硫酸乙醇溶液，PH＝4，过滤，干燥， 制成硫酸盐化合物1。

实施例5：

实施例1所得化合物1，加入4％的盐酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成 盐酸盐化合物1。

实施例6：

实施例1所得化合物1，加入4％的酒石酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制 成酒石酸盐化合物1。

实施例7：

实施例1所得化合物1，加入4％的柠檬酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制 成柠檬酸盐化合物1。

实施例8：

片剂：实施例1所得化合物1或实施例4-7所得的盐10mg，乳糖180mg， 淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的 混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg， 化合物含量为10mg。

实施例9：

安瓿剂：实施例1所得化合物1或实施例4-7所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶 液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例10：

注射用冻干剂：实施例1所得化合物1或实施例4-7所得的盐10mg，碳酸 氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min 除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1 N盐酸调节PH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞， 轧盖，即得。

实施例11：

胶囊剂：实施例1所得化合物1或实施例4-7所得的盐10mg，乳糖187mg， 硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合 物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Hippo-YAP信号通路在肿瘤发生、发展中起着重要作用。其中YAP蛋白是 Hippo通路的开关蛋白，其过表达会导致肿瘤的发生。本发明的茜草科类型环肽 RA-V(1)能够显著抑制Hippo-YAP信号通路，之前未见其作为Hippo-YAP信 号通路抑制剂的报道。此外，本发明提供的制备方法，能够快速分离纯化目标化 合物RA-V(1)，效率高，目的性强，分离步骤少，操作方便，可控性和重现性 好，溶剂可以反复回收利用，成本低，适用于工业生产。