一种益心舒制剂中人参皂苷的含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种益心舒制剂中人参皂苷的含量测定方法，属于中药质量检测技术领域。

背景技术

益心舒中药制剂是以人参、黄芪、丹参、麦冬、五味子、川芎、山楂等七味药组成，具 有益气复脉，活血化瘀，养阴生津的功效，用于气阴两虚，心悸脉结代，胸闷不舒、胸痛及 冠心病心绞痛见有上述症状者，目前临床上广泛用于治疗心绞痛、心肌缺血、各型心率失 常、房性早搏、胸痛及冠心病心绞痛患等。

益心舒中药制剂中含有人参，人参皂苷是人参的主要有效成分，现已明确知道的GS单 体约有40余种；在人参中的含量在4％左右。众多研究表明，它具有较高的抗肿瘤活性，对 正常细胞无毒副作用，与其他化疗药物(如顺铂)联合应用有协同作用。其中，Rg₁：可快 速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用。Re 具有抑制中枢神经，促进DNA、RNA合成，升高血浆皮质酮的作用，扩张血管，还有抗疲 劳作用。Rb₁：具影响动物睾丸的潜力，亦会影响小鼠的胚胎发育，具有增强胆碱系统的功 能，增加乙酰胆碱的合成和释放以及改善记忆力作用。Rc：具有抑制癌细胞的功能。可增加 精虫的活动力。由此可见人参皂苷中的Rg₁、Re、Rb₁、Rc都具有十分重要的药理作用，因 此对其含量进行测定具有十分重要的意义。

HPLC测定益心舒胶囊中人参皂苷Rg₁，Re，Rb₁的含量(中国实验方剂学杂志，杜佳 新，2010年9月第16卷第11期，88-90页)一文中公开了HPLC测定益心舒胶囊中人参皂 苷Rg₁，Re，Rb₁的含量的方法，但是，现有的益心舒中药制剂的质量检测方法并没有对人 参皂苷Rc成分的含量进行测定，为进一步完善益心舒中药制剂的质量检测标准，以确保其 药品质量，并且为了减少分开多次测定不同人参皂苷成分含量而产生的误差，如果能一次性 测定多种成分的含量，不仅可以节约时间和成本，还可以使得同一系统条件下的测试结果更 稳定、可靠，因此本申请人着手研究了同时测定益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc 四种成分含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种益心舒制剂中人参皂苷的含量测定方法，能够同时对益心 舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc成分的含量进行快速、准确、高重现性、高回收率的 测定。

为解决现有技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种益心舒制剂中人参皂苷的含量测定方法，它是以人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc对照 品为对照，以甲醇为流动相A、0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B梯度洗脱的高效液相色谱 法。

前述的益心舒制剂中人参皂苷的含量测定方法按照高效液相色谱法，步骤如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，0.02％～2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为203nm；流速为 0.8～1.0mL/min；柱温为25～35℃；理论板数以人参皂苷Re峰计算不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc 对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁0.1mg的溶液、每1mL含 人参皂苷Re0.1mg的溶液、每1mL含人参皂苷Rb₁0.25mg的溶液和每1mL含人参皂苷 Rc0.2mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：采用下述方法①-④中的任一种：

①精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；

②精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液 25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及滤液，浓缩至干，残 渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即 得；

③精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液 25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液洗3次，每次 20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理好的大孔吸附树脂柱或中性氧 化铝柱，水洗至无色，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移 至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

④精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加入石油醚、三氯甲烷或两 者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具塞锥形瓶中，加入醇碱溶 液50mL，加热回流1h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤滤饼及容器3次，合并洗液和滤液， 浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，分别用氨试 液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1次，每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣 加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

前述方法中，所述梯度洗脱的具体条件为：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A： B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75； 80～110min：A：B＝25：75。

前述方法中，供试品溶液的制备方法③中所述的碱溶液为1％氢氧化钠溶液或氨试液， 所述的大孔吸附树脂柱为D101、AB-8或NKA-9树脂；供试品溶液的制备方法④中所述的 醇碱溶液为2％氢氧化钾甲醇液。

前述方法中，所述流动相B优选为0.2％磷酸水溶液。

本发明所述的益心舒制剂是按以下方法制备而成的：川芎100～150g与山楂150～250g、 黄芪150～250g和麦冬150～250g加水煎煮二次，第一次2.5小时，第二次1.5小时，滤过， 合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.15(80℃)，向浓缩液中加入一倍量的85％乙醇，混 匀，静置，滤过，滤液浓缩，备用；将五味子100～150g与丹参250～300g加入85％乙醇回 流提取二次，第一次3小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相 对密度为1.25～1.30(80℃)，得醇提浸膏，备用；将前述两种浸膏混合，加入人参细粉200g (或其醇提物)，混匀，干燥，粉碎，加入适量辅料制成任何一种药剂学上所说的剂型， 如：片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、冲剂、丸剂、膏剂、散剂、丹剂等制剂形 式。

前述益心舒制剂中人参皂苷的含量测定方法中，每克益心舒制剂中以人参皂苷Rg_l、人 参皂苷Re、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rc的总量计，不得少于3.4mg。

虽然人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc属于同一类成分，但其各有区别，适宜的含量测定条 件往往并不相同，要同时测定它们的含量，必须对HPLC的各项条件参数进行摸索、试验。 为了能将多种人参皂苷成分有效分离开来，对流动相种类、流动相比例以及梯度洗脱条件的 摸索、确定是非常关键的。本发明在现有技术的基础之上，继续探索，通过对流动相种类、 流动相比例、梯度洗脱条件、对照品及供试品的制备方法等进行摸索、筛选，最终建立了益 心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的高效液相色谱含量测定方法。以下是申请人所进 行的相关试验研究和考察的主要内容。

一、仪器与试药(见表1)

表1仪器与试剂表

二、方法与结果

1、色谱条件的选择

1.1柱温选择

为寻找最佳柱温，申请人采用不同柱温进行实验，观察结果，结果见表2。

表2柱温实验表

由表2可知，选择25～35℃作为柱温均可。

1.2流速选择

为寻找最佳流速范围，申请人采用不同流速进行实验，记录色谱峰，结果见表3。

表3色谱峰记录表

由表3可知，设置流速为0.8～1.0mL/min，各峰间的分辨率良好，色谱时间短，峰面积 适中，效果最好。

1.3流动相选择

为寻找最佳流动相，申请人采用不同流动相进行UV检测，记录色谱峰，结果如下。

(1)乙腈-水梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65； 35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A： B＝25：75。

(2)乙腈-0.02％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(3)乙腈-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(4)乙腈-1％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(5)乙腈-2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(6)甲醇-水梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35：75～65； 35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min：A： B＝25：75。

(7)甲醇-0.02％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(8)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(9)甲醇-1％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(10)甲醇-2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝25：75；5～35min：A：B＝25～35： 75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A：B＝50～25：50～75；80～110min： A：B＝25：75。

(11)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝10：90；5～40min：A：B＝10～28： 90～72；40～75min：A：B＝28～38：72～62；75～80min：A：B＝38～10：62～90；80～110min： A：B＝10：90。

(12)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝15：85；5～40min：A：B＝15～30： 85～70；40～75min：A：B＝30～40：70～60；75～80min：A：B＝40～15：60～85；80～110min： A：B＝15：85。

(13)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～5min：A：B＝12：88；5～40min：A：B＝12～30： 88～70；40～75min：A：B＝30～35：70～65；75～80min：A：B＝35～12：65～88；80～110min： A：B＝12：88。

(14)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～8min：A：B＝15：85；8～40min：A：B＝15～25： 85～75；40～55min：A：B＝25～35：75～65；55～80min：A：B＝35～15：65～85；80～110min： A：B＝15：85。

(15)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～10min：A：B＝15：85；10～45min：A： B＝15～25：85～75；45～60min：A：B＝25～35：75～65；60～80min：A：B＝35～15：65～85； 80～110min：A：B＝15：85。

(16)甲醇-0.2％磷酸水溶液梯度：0～10min：A：B＝20：80；10～45min：A： B＝20～35：80～65；45～60min：A：B＝35～45：65～55；60～80min：A：B＝45～20：55～80； 80～110min：A：B＝20：80。

结果显示在流动相B与洗脱条件相同的条件下，流动相A运用乙腈与甲醇均可，且甲 醇较乙腈效果稍好，又因甲醇价格比乙腈低廉，因此优选流动相A为甲醇；在流动相A为 甲醇且洗脱条件相同的情况下，流动相B采用水或0.02％～2％磷酸水溶液均可，但用一定浓 度的磷酸水溶液替代水可得到较好的效果，且流动相用甲醇-0.2％磷酸水溶液效果更好；采 用甲醇-0.2％磷酸水溶液的流动相体系，对不同时间段不同比例的流动相进行调整，摸索得 到甲醇-磷酸水溶液体系采用上述(8)的梯度洗脱方式所得色谱峰较好，其分离度均符合要 求，峰形均较好。

2、对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc对照品适量，精密称定， 分别加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁0.1mg的溶液、每1mL含人参皂苷Re0.1mg的溶 液、每1mL含人参皂苷Rb₁0.25mg的溶液和每1mL含人参皂苷Rc0.2mg的溶液，即得；

3、供试品溶液的制备

采用下述方法①-④中的任一种：

①精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；

②精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液 25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及滤液，浓缩至干，残 渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即 得；

③精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液 25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液(如1％氢氧化钠 溶液、氨试液)洗3次，每次20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理 好的大孔吸附树脂柱(如D101、AB-8、NKA-9树脂)或中性氧化铝柱，水洗至无色，收集 50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释 至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

④精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加入石油醚、三氯甲烷或两 者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具塞锥形瓶中，加入醇碱溶 液50mL(如2％氢氧化钾甲醇液)，加热回流1h，放冷，滤过，用少量甲醇洗涤滤饼及容器 3次，合并洗液和滤液，浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和的正丁醇提取4次 (20，20，10，10mL)，合并正丁醇液，分别用氨试液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1 次，每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲 醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对四种供试品制备方法进行比较，结果如表4所示：

表4

由表4可知，通过方法一与方法二制备供试品，步骤简单操作方便，提取效率高，但是 纯度稍低，杂质较多；采用方法三和方法四制备供试品，步骤繁琐，提取效率较前两者低， 但提取的人参皂苷纯度高，杂质残留量低，降低了检测过程中杂质的影响力，更利于保证检 测结果的准确性和稳定性。

4、检测波长的选择

本发明人通过大量试验反复对人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc对照品溶液进行光谱紫外扫 描，发现特别是在203nm处有极大吸收波长，因此本发明中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc检 测波长确定为203nm。

5、标准曲线的制备

分别精密量取人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc对照品溶液，其浓度分别为0.1mg/mL、 0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.2mg/mL，分别进样5、10、15、20、25μL，测得峰面积并记录， 以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，回归方程及线性范围见表 5。

表54种人参皂苷回归方程及相关系数

6、精密度实验

取对照品溶液10μL，重复进样6次，测得人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc峰面积，计算 得RSD分别为0.47％、0.36％、0.51％、0.33％，表明精密度良好。

7、稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、4、8、12、24h各吸取10μL，共进样6 次，测得人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc峰面积，计算得RSD分别为0.64％、0.91％、 1.36％、0.78％，表明处理后的溶液在室温下24h内稳定，稳定性良好。

8、重复性实验

取同一供试品溶液6份，各进样10μL，测得人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc峰面积，计 算得RSD分别为0.83％、0.76％、1.22％、0.74％，表明重复性良好。

9、加样回收率实验

精密称取已知含量的样品100mg，分别加入相当于各被测物含量的80％、100％、120％ 的对照品储备液，按照供试品溶液的制备项下方法制备低、中、高回收率样品各3份，测定 各人参皂苷成分的含量并计算加样回收率(n＝9)，结果人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc 4种组分 的平均回收率分别为101.7％(RSD＝1.16％)、101.3％(RSD＝1.40％)、100.4％(RSD＝1.06％)、 100.5％(RSD＝0.76％)，表明本方法准确度良好。

10、样品含量测定

取5批益心舒制剂或其内容物适量，精密称定，分别按对照品溶液的制备项、供试品溶 液的制备项下方法进行制备，按线性关系的考察项下含量测定(供试品溶液、对照品溶液分 别进样10μL)，计算出人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量及四种人参皂苷的总量，结果见 表6。

表6样品含量测定结果(n＝5)

本发明通过高效液相色谱法对益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc成分的含量进 行测定，所述方法的专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准 确，达到了有效控制药物质量的目的，确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。 而且，本发明一次性测定四种人参皂苷成分的含量，可避免因分开多次测定不同人参皂苷成 分含量而产生的误差，还能节省时间和成本，并使得同一系统条件下的测定结果更稳定、可 靠。

具体实施方式

本发明实施例1：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，0.02％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75； 5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A： B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为0.8mL/min，柱 温为25℃，理论板数以人参皂苷Re峰计算不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc 对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁0.1mg的溶液、每1mL含 人参皂苷Re0.1mg的溶液、每1mL含人参皂苷Rb₁0.25mg的溶液和每1mL含人参皂苷 Rc0.2mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形 瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声或回流处理30～60min，用甲醇补足重量；滤 过，取续滤液，即得；

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

本发明实施例2：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75； 5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A： B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为0.9mL/min，柱 温为30℃，理论板数以人参皂苷Re峰计算不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc 对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁0.1mg的溶液、每1mL含 人参皂苷Re0.1mg的溶液、每1mL含人参皂苷Rb₁0.25mg的溶液和每1mL含人参皂苷 Rc0.2mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形 瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流提取30min～60min，用甲醇补足重量，滤 过；精密量取续滤液25mL，加水搅拌，滤过，加少量水洗涤滤饼及容器3次，合并洗液及 滤液，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，即得；

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

本发明实施例3：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75； 5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A： B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为1.0mL/min，柱 温为35℃，理论板数以人参皂苷Re峰计算不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc 对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁0.1mg的溶液、每1mL含 人参皂苷Re0.1mg的溶液、每1mL含人参皂苷Rb₁0.25mg的溶液和每1mL含人参皂苷 Rc0.2mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置100mL具塞锥形 瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min～60min，用甲醇补足重量，滤过； 精密量取续滤液25mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用碱溶液 (氨试液)洗3次，每次20mL，正丁醇液浓缩至干，残渣加水5mL使溶解，通过处理好的 大孔吸附树脂柱(D101)，水洗至无色，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩至干，残渣加 甲醇溶解，并转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

本发明实施例4：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min：A：B＝25：75； 5～35min：A：B＝25～35：75～65；35～70min：A：B＝35～50：65～50；70～80min：A： B＝50～25：50～75；80～110min：A：B＝25：75；检测波长为203nm，流速为1.0mL/min，柱 温为35℃，理论板数以人参皂苷Re峰计算不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc 对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁0.1mg的溶液、每1mL含 人参皂苷Re0.1mg的溶液、每1mL含人参皂苷Rb₁0.25mg的溶液和每1mL含人参皂苷 Rc0.2mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取益心舒制剂或其内容物5～20g，置索氏提取器中加 入石油醚、三氯甲烷或两者混合物加热回流3h，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100mL具 塞锥形瓶中，加入醇碱溶液(2％氢氧化钾甲醇液)50mL，加热回流1h，放冷，滤过，用少 量甲醇洗涤滤饼及容器3次，合并洗液和滤液，浓缩至干，残渣加水50mL溶解，用水饱和 的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，分别用氨试液、水、1％磷酸二氢钾溶液各洗涤1次， 每次40mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇稀 释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

本发明实施例5：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

除了“梯度洗脱条件为：0～10min：A：B＝15：85；10～45min：A：B＝15～25：85～75； 45～60min：A：B＝25～35：75～65；60～80min：A：B＝35～15：65～85；80～110min：A： B＝15：85”外，其余同实施例2。

本发明实施例6：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

除了“梯度洗脱条件为：0～10min：A：B＝20：80；10～45min：A：B＝20～35：80～65； 45～60min：A：B＝35～45：65～55；60～80min：A：B＝45～20：55～80；80～110min：A： B＝20：80”外，其余同实施例2。

本发明实施例7：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

除了步骤(3)中供试品溶液的制备中“通过处理好的大孔吸附树脂柱(AB-8)，水洗 至无色”外，其余同实施例3。

本发明实施例8：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

除了步骤(3)中供试品溶液的制备中“通过处理好的大孔吸附树脂柱(NKA-9)，水洗 至无色”外，其余同实施例3。

本发明实施例9：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

除了步骤(3)中供试品溶液的制备中“用碱溶液(1％氢氧化钠溶液)洗3次”以及 “通过处理好的中性氧化铝柱，水洗至无色”外，其余同实施例3。

本发明实施例10：一种益心舒制剂中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc的含量测定方法，步 骤如下：

除了“梯度洗脱条件为：0～5min：A：B＝10：90；5～40min：A：B＝10～28：90～72； 40～75min：A：B＝28～38：72～62；75～80min：A：B＝38～10：62～90；80～110min：A： B＝10：90”外，其余同实施例2。

上述实施例中的所有条件参数的任意组合，均可得到一致的含量测定结果。