多肽、提高多肽稳定性的方法、药物组合物以及多肽在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体的，本发明涉及分离的多肽及其应用，更具体的，本发明涉 及分离的多肽，提高多肽稳定性的方法，药物组合物以及分离的多肽在制备药物中的用途。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症(也称为“艾滋病”，Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS) 是一种由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的致死性传染病。

HIV进入人类细胞可以分为三个过程。吸附过程：HIV表面糖蛋白gp120与人类细胞表 面受体CD41结合，从而使得HIV吸附到人类细胞表面。拉近过程：HIV表面糖蛋白gp120 进一步与人类细胞的辅助受体CCR5或CXCR4结合，从而拉近HIV与人类细胞膜的距离。 融合过程：HIV表面跨膜亚基gp41构象发生改变，接着其N端的融合肽插入到宿主细胞膜 内。最后启动病毒包膜与人类细胞膜的融合，完成病毒进入宿主细胞。

艾滋病融合抑制剂是一种可以在艾滋病感染初期切断其传染的新一代预防和治疗艾滋 病的药物。它通过阻断HIV与人类细胞膜的融合过程，进而阻断艾滋病毒进入人类细胞。艾 滋病融合抑制剂是以HIV表面跨膜糖蛋白gp41为靶点，通过抑制gp41六螺旋体 (six-helixbundle，6-HB)的形成，进而阻断膜融合过程。

然而，现有的HIV膜融合抑制剂仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提 出能够有效地抑制HIV的膜融合过程的多肽。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的多肽，具有酶稳定性高的性质。根据 本发明的实施例，所述多肽是(a)SEQ ID NO：1～4任一项所述的氨基酸序列经下列至少一 种修饰而获得的：(1)与(a)相比具有侧链修饰的氨基酸序列；(2)与(1)和(a)相比， 具有一个或几个氨基酸的插入和/或替换和/或缺失的氨基酸序列；(3)与(1)和(a)相比， 具有非天然氨基酸移位的氨基酸序列；(4)与(1)～(3)和(a)相比，具有被修饰的N 端乙酰基的氨基酸序列；以及(5)与(1)～(4)和(a)相比，具有C端为酰胺的氨基酸 序列。根据本发明实施例，所述多肽能够有效地抑制HIV的膜融合过程，具有抑制HIV膜 与人细胞表面融合过程的活性。另外，发明人惊奇地发现，根据本发明的实施例的多肽酶稳 定性好，药代稳定性高，能够有效的抑制HIV的膜融合作用，从而进一步提高抑制HIV感 染细胞的效率。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种提高多肽酶稳定性的方法。根据本发明实施 例，该方法可以包括在所述多肽两个氨基酸侧链之间形成共价键合，其中，所述共价键合选 自碳碳双键、碳碳单键、碳硫键、硫碳键、酰胺键或碳氧键的之一。根据本发明的一个具体 示例，所述键合为碳碳双键。发明人惊奇地发现，经该方法修饰的多肽，多肽酶稳定性好， 根据本发明的实施例，可以将该方法应用于提高多肽药物的药代稳定性。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明实施例，该药物组 合物包括：本发明所述的多肽。发明人惊奇地发现，该药物组合物能够有效地抑制HIV的 膜融合过程，具有抑制HIV膜与人细胞表面融合过程的活性。另外，发明人惊奇地发现， 根据实施例的多肽酶稳定性好，药代稳定性高，能够有效的抑制HIV的膜融合作用，从而 进一步提高抑制HIV感染细胞的效率。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了本发明所述的多肽在制备药物中的用途，所述 药物用于治疗或者预防艾滋病，或者所述药物用于抑制HIV膜融合。发明人惊奇地发现， 能够有效地抑制HIV的膜融合过程，具有抑制HIV膜与人细胞表面融合过程的活性。另外， 发明人惊奇地发现，根据实施例的多肽酶稳定性好，药代稳定性高，能够有效的抑制HIV 的膜融合作用，从而进一步提高抑制HIV感染细胞的效率。根据本发明的实施例，可将本 发明的多肽用于治疗或者预防艾滋病，或者所述药物用于抑制HIV膜融合。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的多肽圆二色谱的色谱图片；以及

图2显示了根据本发明一个实施例的多肽的糜蛋白酶降解动力学曲线示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的多肽，具有酶稳定性高的性质。根据 本发明的实施例，

所述多肽是(a)SEQ ID NO：1～4任一项所述的氨基酸序列

经下列至少一种修饰而获得的，其中，SEQ ID NO：1～4具体如下：

(1)与(a)相比具有侧链修饰的氨基酸序列，且该多肽具有抑制HIV膜融合的活性。 根据本发明实施例，所述侧链修饰包括下列至少之一：侧链增长、侧链缩短、杂原子替换。 由此，氨基酸侧链间易于形成稳定的共价键。

其中需要说明的是，在本文中使用的术语“侧链修饰”的含义不受特别的限制，只要经 修饰后仍具有抑制HIV膜融合活性即可。优选该侧链为形成共价键的连接臂侧链。侧链增 长是指：增加侧链的碳原子数目；侧链缩短是指：减少侧链的碳原子数目；杂原子替换是指： 选自N原子、P原子和O原子的至少之一替换至少一个碳原子；

在本文中所使用的术语“多肽”应做广义理解，是指包含至少两个以肽键结合的氨基酸 的化合物，其可以含有任选经过修饰的氨基酸或者非氨基酸结构。另外，在本文中，如没有 明确说明，“多肽”、“蛋白质”以及“肽链”可以互换使用。

本发明中所用术语“分离的”是指如多肽或者蛋白质等材料，其与其天然存在的环境相 分离。所述分离的材料任选包含在其天然环境中未发现的材料。

(2)与(1)和(a)相比，具有一个或几个氨基酸的插入和/或替换和/或缺失的氨基酸 序列，且该多肽具有抑制HIV膜融合的活性。

其中需要说明的是，在本文中所使用的术语“替换”的含义不受特别限制，只要替换后 的氨基酸仍具有抑制HIV膜融合的活性即可。根据本发明的实施例，用于替换的氨基酸既 可以为常见氨基酸，也可以为构象D-型的氨基酸、天然存在的稀有氨基酸或者人工修饰的 氨基酸。

(3)与(1)和(a)相比，具有非天然氨基酸移位的氨基酸序列，且该多肽具有抑制 HIV膜融合的活性。即将多肽中非天然氨基酸插入位置进行改变所得到的多肽，且该多肽仍 具有抑制HIV膜融合的活性。

在文中所使用的术语“非天然氨基酸”的种类和结构不受特别的限制，只要获得的多肽 仍具有抑制HIV膜融合的活性即可，优选易于形成共价键的非天然氨基酸。根据本发明实 施例，所述非天然氨基酸均为(S)-2-(4’-戊烯基)-丙氨酸。由此，氨基酸侧链易于形成 共价键，且共价键稳定性好。

(4)与(1)～(3)和(a)相比，具有被修饰的N端乙酰基的氨基酸序列，且该多肽 具有抑制HIV膜融合的活性。即改变上述(1)～(3)和(a)中多肽的N端乙酰基修饰所 获得的多肽，且该多肽仍具有抑制HIV膜融合的活性。

(5)与(1)～(4)和(a)相比，具有C端为酰胺的氨基酸序列，且所述多肽具有抑 制HIV膜融合的活性。即改变上述(1)～(5)中多肽的C端为酰胺而获得的多肽，且该多 肽仍具有抑制HIV膜融合的活性。

根据本发明实施例，本发明具有下列有点至少之一：抑制HIV膜融合的活性强、多肽 酶稳定性好、药代稳定性高。例如，经修饰后的多肽的氨基酸序列可以为如下所示：

发明人惊奇的发现，上表所列出的多肽酶稳定性好，药代稳定性高，能够有效的抑制 HIV的膜融合作用，从而高效的抑制HIV感染细胞。

根据本发明的实施例，所述多肽进一步包括至少两个非天然氨基酸，并且在所述非天然 氨基酸的侧链之间形成共价键合(例如：碳碳双键、碳碳单键、碳硫键、硫碳键、酰胺键、 碳氧键)。由此，多肽的酶稳定性好，药代稳定性高。

根据本发明的实施例，在所述非天然氨基酸的侧链之间形成有两个所述的共价键合。由 此，多肽的稳定性更好，多肽对HIV膜融合抑制活性进一步提高。

根据本发明的实施例，所述共价键选自碳碳双键、碳碳单键、碳硫键、硫碳键、酰胺键 或碳氧键的之一。根据本发明的一个具体示例，所述共价键合为碳碳双键。由此，多肽分子 内共价键稳定性好。

根据本发明的实施例，所述多肽具有α-螺旋构象。这一特点使得多肽不容易被体内的蛋 白酶识别，从而不易被蛋白酶降解。同时，这一结构特点也使得多肽与HIV结合能力更强。 由此，多肽的抑制活性强，酶稳定性好，药代稳定性高。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种提高多肽酶稳定性的方法。根据本发明实 施例，该方法可以包括在所述多肽两个氨基酸侧链之间形成共价键合，其中，所述共价键合 选自碳碳双键、碳碳单键、碳硫键、硫碳键、酰胺键或碳氧键的之一。根据本发明的一个具 体示例，所述键合为碳碳双键。发明人惊奇地发现，经该方法修饰的多肽，多肽酶稳定性好， 药代稳定性高。

根据本发明的又一方面，本发明又提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药 物组合物包括：本发明所述的多肽。发明人惊奇地发现，该药物组合物在体内不易被蛋白水 解酶降解，多肽酶稳定性好，药代稳定性高。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包含赋形剂、附加剂、及药学可接受的载 体的至少一种。

其中，需要说明的是，“药学上可接受的载体”在本发明中指不显著改变所加入的活性 成份(例如，本发明的具有抑制HIV膜融合活性的多肽)的生物活性的载体介质。药学上 可接受的载体包括但不限于下列物质的一种或多种：水、缓冲液、生理盐水、0.3％的甘氨酸、 醇溶液、等渗水溶液；还可以包括一种或多种以下物质，例如甘油；油；盐，如钠盐、钾盐、 镁盐、铵盐和磷酸盐；碳酸酯；脂肪酸；糖类(例如甘露醇)；多糖；聚合物；赋形剂；和 防腐剂和/或稳定剂等。

根据本发明的在一方面，本发明提供了本发明所述的多肽在制备药物中的用途，所述药 物用于治疗或者预防艾滋病，或者所述药物用于抑制HIV膜融合。

本发明的药物组合物或药物包括例如适于口服、直肠、鼻、局部、腹膜和胃肠外(包括 肌内、皮下或静脉内)给予的组合物。或者通过吸入或吹入给予的组合物。可以局部或全身 性给予。优选通过口服或静脉内途径给予。本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物 剂量形式，例如胶囊、丸剂、片剂、粉末、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷 雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油 乳状液如乳剂、洗剂和香脂。

发明人惊奇地发现，本发明的多肽在体内不易被蛋白水解酶降解，多肽酶稳定性好，药 代稳定性高，对HIV膜融合的抑制作用强，可将本发明的多肽用于治疗或者预防艾滋病， 或者所述药物用于抑制HIV膜融合。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的， 而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材 料，如无特殊说明，均为购自常规生化试剂公司。

为更清楚对后续实施例进行说明，下面给出各实施例中用到的各原料的符号缩写表示， 在各实施例中，用到符号缩写的地方均指相应的符号缩写对应的内容，具体如下：

实施例1

在本发明的实施例中，本发明所提供的多肽，均采用标准Fmoc固相合成策略得到。为 了掩蔽C端的负电荷，采用Rink Aminde AM树脂将C端最后一个氨基酸的羧基变为酰胺。 固相合成过程中采用的氨基酸均为标准Fmoc氨基酸以及Fmoc-S₅-OH。待线性肽合成完毕， 利用第一代Grubbs催化剂在树脂上进行烯烃复分解反应。然后使用TFA(三氟乙酸)/TIPS (三异丙基硅烷基)/H₂O将多肽从树脂上切割下来。最后利用HPLC纯化多肽，ESI-MS检 测。具体合成步骤如下：

1.氨基酸缩合：称取300mg取代度为0.33mmol/g的Rink Amide AM树脂于80mL多 肽合成管中，加入2mL DMF(二甲基甲酰胺)和6mL DCM(二氯甲烷)混合溶剂溶胀。 0.5h后用水泵抽干溶剂。依次使用DMF(5mL*5)，DCM(5mL*5)，DMF(5mL*5)洗 涤树脂。然后使用5mL 20％哌啶DMF溶液脱去Fmoc保护基(5min+10min)。重复上述洗 涤树脂，用量及方法如上所述。最后加入预先活化一分钟的氨基酸反应液(Fmoc-AA-OH 4 equiv.，HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)3.9equiv.(当量，下同)，HOBt(1- 羟基苯并三唑)4equiv.，DIEA(N，N-二异丙基乙胺)8equiv.，DMF5mL)反应1.5h。树 脂上缩合天然氨基酸步骤均如上所述。缩合非天然氨基酸Fmoc-S₅-OH时反应液组合为 Fmoc-S₅-OH 2equiv.，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)1.9 equiv.，HOBt 2equiv.，DIEA 4equiv.，DMF 3ml，反应时间为2h。

2.烯烃复分解：多肽链在树脂上组装完毕后，进行烯烃复分解反应。在氩气保护条件 下加入Grubs’催化剂的1，2-二氯乙烷溶液(40mg/5mL)室温反应。2h后再次加入Grubs’ 催化剂的1，2-二氯乙烷溶液。待反应2h后分别使用DMF，DCM洗涤。

3.乙酰化修饰：多肽N端均进行乙酰化修饰，具体操作如下。在进行烯烃复分解后， 将多肽链上最后一个氨基酸的Fmoc脱除、洗涤，然后加入5mL乙酰化试剂(Ac₂O(乙酸 酐):DIEA:DMF＝1:1:8，v:v:v)反应，5min后再次加入乙酰化试剂，最后再使用DMF，DCM 洗涤。

4.保护基切除：于多肽合成管中加入10mL切割试剂(TFA:TIPS:水＝95:2.5:2.5，v:v:v)， 室温反应。2.5h后将切割试剂转移到50mL离心管中，使用Ar气将离心管中的TFA吹至 2mL。然后向离心管中，加入40mL冰乙醚沉淀、离心。最后倾倒出乙醚溶液留沉淀。

5.多肽分离与鉴定：利用SHIMAZU高效液相色谱，GRACE Vydac C184.6×250mm 的高效液相色谱柱进行对粗肽的分析，流动相为A:含有0.1％TFA的乙腈，B:含有0.1％ TFA的水，进行梯度洗脱，30min从10％的B到80％的B，流速为1mL/min。待多肽经 ESI质谱确定后，使用GRACE Vydac C18高效液相半制备柱对粗肽进行分离纯化。

多肽固相合成路线如下所示：

通过上述方法，共合成了四种类型共计12条多肽(SFT-0，SFT-1，SFT-2；SC34EK-0， SC34EK-1，SC34EK-2；MT-SC22EK-0，MT-SC22EK-1A，MT-SC22EK-1B，MT-SC22EK-2， CP32M-0，CP32M-1，其中0，1，2分别指代形成订书结构(即共价键)的个数)。其中， SFT-0、SC34EK-0、MT-SC22EK-0、CP32M-0分别为SEQ ID NO：1-4所示的多肽，其余多 肽为上述四种多肽经过修饰后获得的多肽衍生物。上述多肽具体氨基酸序列如下：

实施例2

采用圆二色谱法分析实施例1中获得的12条多肽(SFT-0，SFT-1，SFT-2；SC34EK-0， SC34EK-1，SC34EK-2；MT-SC22EK-0，MT-SC22EK-1A，MT-SC22EK-1B，MT-SC22EK-2， CP32M-0，CP32M-1)的物理化学性质。

1、实验方法

将12条多肽分别溶解在pH＝6.8的磷酸盐缓冲液中，最终得到浓度均为50μM测试溶 液。在25℃下，将测试溶液转移至0.1mm的石英比色皿中，使用Jasco-715分光偏振计测 试多肽的圆二色谱。分光偏振计测量参数：波长190-260nm，步长0.5nm，累计3次。

2、实验结果

典型的α-螺旋在圆二色谱的195nm处有正的吸收峰，在208nm和222nm两处有负的吸 收峰。从图1可以看出12条多肽在208nm和222nm处出现双负峰以及在195nm处出现正 的吸收峰，表明所合成的多肽都具有α-螺旋构象。多肽的螺旋程度由它在222nm处的CD 吸收峰[θ]₂₂₂决定。通过对222nm处的CD吸收峰[θ]222进行归一化处理后，使用多肽螺旋程 度计算公式[θ]₂₂₂/[θ]_max,即可计算出多肽的螺旋程度。四种类型12条多肽的螺旋程度见图1。

实施例3(多肽的酶稳定性质)

在本实施例中，采用高效液相色谱法分析实施例1所获得的12条多肽中的7条 (SC34EK-0、SC34EK-1、SC34EK-2；MT-SC22EK-0、MT-SC22EK-1A、MT-SC22EK-1B、 MT-SC22EK-2)的酶稳定性质。

1、实验方法

将上述7条多肽分别制备为浓度为1mM的DMSO储存液。将上述储存液50μL分别加 入到1950μL磷酸缓冲液中(0.05mol/L Na₂HPO₄，2mM CaCl₂，pH＝7.8，0.5ng/μL chymotrypsin) 在30℃下进行酶解反应。在不同时间段分别取100μL酶解反应液加入20μL1M盐酸淬灭酶 解反应。通过使用高效液相色谱监测不同时间段多肽的酶解反应液，得到其降解动力学过程。

2、实验结果

7条多肽的糜蛋白酶降解动力学曲线如图2所示。根据各多肽的糜蛋白酶降解动力学曲 线得到多肽的半衰期，各多肽的半衰期如下：SC34EK-0半衰期为55min，SC34EK-1半衰期 为109min，SC34EK-2半衰期为101min，MT-SC22EK-0半衰期为125min，MT-SC22EK-1A 半衰期为405min，MT-SC22EK-1B半衰期为725min，MT-SC22EK-2半衰期为3665min。

通过比较两个类型多肽的半衰期发现：

1、两种类型的多肽半衰期顺序为SC34EK-2>SC34EK-1>SC34EK-0； MT-SC22EK-2>MT-SC22EK-1B>MT-SC22EK-1A>MT-SC22EK-0。说明进行骨架钢化结构修 饰可以有效的增强多肽对糜蛋白酶的稳定性。

2、含有24个氨基酸的多肽MT-SC22EK系列半衰期>含有34个氨基酸的多肽SC34EK 系列半衰期。说明短肽对糜蛋白酶的稳定性高于长肽。

实施例4

在本实施例中，通过HIV检测系统，检测多肽抑制HIV假病毒感染的活性。

1、实验方法

分别将实施例1获得的12条多肽(SFT-0，SFT-1，SFT-2；SC34EK-0，SC34EK-1， SC34EK-2；MT-SC22EK-0，MT-SC22EK-1A，MT-SC22EK-1B，MT-SC22EK-2，CP32M-0 和CP32M-1)制备为一定浓度的DMSO储存液。使用三种不同亚型的HIV假病毒中国流行 株和三种HIV假病毒标准株进行多肽抑制病毒感染活性的检测，其中CNE6和CNE11为B’ 亚型，CNE15和CNE30为BC亚型，CNE5和CNE55为CRF01_AE亚型，sf162、JRFL和 HXB2为HIV标准株B亚型(菌株的构建方法参考文献：Hong Shang,Xiaoxu Han,Xuanling  Shi,et al.J Biol Chem.2011Apr 22；286(16):14531-41.，由清华大学张林琦教授实验室提供)。 这9种HIV假病毒均含有荧光素酶报告基因检测系统，使用这9种假病毒分别对12条多肽 进行检测，通过测定报告基因荧光素酶的活性得到HIV假病毒感染细胞的能力。

HIV假病毒的包装和检测方法：利用能够表达各种亚型HIV全长膜蛋白的真核表达质 粒(pcDNA3.1+,购自Invitrogen)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase(参考文献:He J,Choe S, Walker R,Di Marzio P,Morgan DO,Landau NR.J Virol 69:6705–6711,1995.)共转染293T细 胞，制备具有感染性但没有复制能力的HIV假病毒，其感染性同活病毒相似。利用制备的 HIV假病毒同多肽共同孵育后再上清感染HIV的易感细胞GHOST(3)X4/R5，通过测定报告 基因荧光素酶的活性进行HIV假病毒感染能力的确定。其中，上清感染HIV的易感细胞 GHOST(3)X4/R5实验中，如果多肽具有抑制HIV感染易感细胞的GHOST(3)X4/R5的能力， 则能进入GHOST(3)X4/R5的病毒数量就会显著减少，则HIV假病毒本身携带的荧光素酶在 GHOST(3)X4/R5中的表达量也会减少，所以通过测定GHOST(3)X4/R5中荧光素酶的活性就 可定量地检测感染细胞的病毒量，也可反应出多肽抑制HIV感染的能力。

2、实验结果

通过检测荧光素酶的活性可获得各多肽对9类型HIV假病毒抑制曲线，从而得到可以 表征多肽抑制HIV假病毒感染的活性参数(即：半数抑制浓度，半数抑制浓度越低抑制HIV 感染活性越强)，具体结果见表1-表4。

表1SFT系列多肽对艾滋假病毒的半数抑制浓度(IC50，nM)

表2SC34EK系列多肽对艾滋假病毒的半数抑制浓度(IC50，nM)

表3MT-SC22EK系列多肽对艾滋假病毒的半数抑制浓度(IC50，nM)

表4CP32M系列多肽对艾滋假病毒的半数抑制浓度(IC50，nM)

通过比较四个类型多肽的半数抑制浓度发现：

(1)对于四种类型的多肽半数抑制浓度顺序为：SC34EK>MT-SC22EK>SFT>CP32M。 没有经过修饰的多肽的半数抑制浓度是经过骨架钢化结构修饰的多肽(即形成多肽分子内共 价键的多肽)的2-10倍。

(2)对于氨基酸个数大于30的多肽，进行两次骨架钢化结构修饰肽的活性要低于进行 一次骨架结构修饰肽。对于氨基酸个数小于30的多肽，进行两次骨架钢化结构修饰的肽活 性要高于进行一次骨架钢化结构修饰肽。

(3)上述12条多肽均具有抑制HIV膜融合过程活性，其中，SC34EK-1和MT-SC22EK-2 的活性最好。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指 的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。