低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌 株及其构建方法。

背景技术：

纯生啤酒是指采用无菌酿造、无菌过滤、无菌包装生产的一种健康时尚、 口感新鲜、自然、卫生、安全营养的鲜啤酒。由于在生产过程中没有经过巴氏杀 菌或瞬间杀菌，避免了加热造成的风味物质和营养成分的破坏，保持了啤酒的新 鲜口味和成分，因而与普通啤酒相比，纯生啤酒更纯正、更爽口、更新鲜、营养 更丰富。

然而，纯生啤酒在泡沫质量方面存在着明显的质量缺陷，即随着货架时间 的延长，泡沫稳定性逐渐下降。因此，提高纯生啤酒的泡沫稳定性一直是纯生啤 酒生产厂家亟待解决的技术难题。国内外研究资料表明，蛋白酶A是导致纯生 啤酒泡持性下降的主要原因。蛋白酶A(EC 3.4.23.6)是在啤酒发酵过程中由酵 母分泌的一种酸性蛋白酶。纯生啤酒因未经巴氏杀菌而残存蛋白酶A，随着货架 时间的延长，蛋白酶A会分解啤酒内的泡沫活性蛋白而导致啤酒泡沫泡持性下 降。

目前，国内外主要从添加蛋白酶A抑制剂、优化发酵工、菌种改造等方面 入手来降低蛋白酶A，提高啤酒泡沫稳定性。添加蛋白酶A抑制剂虽可降低蛋 白酶A的活性，但外源物质的加入可能会影响啤酒的风味、稳定性和安全性。 从发酵工艺来看，为了维持啤酒的风味特征，啤酒发酵的原辅料处理、发酵温度、 灌压等条件相对固定，通过调整这些条件来降低蛋白酶A分泌，提高啤酒泡沫 稳定性的空间不大。通过敲除蛋白酶A基因的方法虽可降低蛋白酶A的分泌， 但同时会影响酵母的生理生化特性。

常规条件下，蛋白酶A定位于酵母细胞液泡内，参与液泡内多种蛋白的成 熟和激活过程。有研究表明，在氮源缺乏、CO₂浓度过高或酒精度过高等胁迫条 件下，蛋白酶A可以分泌到胞外，并推测是可能是通过缺省途径(default pathway) 来完成的。研究表明常规条件下，组成型分泌途径是细胞膜蛋白和分泌型蛋白的 主要运输途径，但目前对于胁迫条件下组成型蛋白分泌途径的研究报道很少，尤 其是对于蛋白酶A在胁迫条件下外分泌途径的研究更是空白。常规条件下，细 胞内的组成型分泌途径是通过囊泡来介导完成的，包括四个步骤：囊泡的出芽、 转运、栓系和融合。而胞吐复合体在囊泡的栓系和融合过程中发挥重要作用，由 八个不同的亚基(Sec3p、Sec5p、Sec6p、Sec8p、Sec10p、Sec15p、Exo70p和Exo84p) 组合而成，其中Sec5p是复合体的核心因子，维持着胞吐复合体的完整性和稳定 性。有研究表明，将果蝇的SEC5基因敲除后会影响生殖细胞的生长及细胞中膜 的极性运输，并使其对温度敏感；将酵母中的SEC5基因敲除会引起菌体对温度 的异常敏感。

目前通过敲除酿酒酵母组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p来降低胁 迫条件下蛋白酶A的分泌量的方法尚未见报道。本发明通过敲除酵母中组成型 分泌途径中胞吐复合体的核心因子Sec5p的基因来选育适合啤酒发酵的低分泌 蛋白酶A的酿酒酵母菌株，从而提高啤酒的泡沫稳定性。

发明内容：

本发明所解决上述技术问题所采用的技术方案是通过敲除酿酒酵母出发菌 株中编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列，获得低 蛋白酶A酿酒酵母菌株。

所述SEC5基因其Gene ID为：851744，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1 所示。

优选的，所述酿酒酵母出发菌株为模式菌株W303-1A；

优选的，所述酿酒酵母出发菌株为工业菌株S6。

所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插 入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SEC5基因的上、下游序列及标记基因 KanMX的重组片段，将重组片段转化入酿酒酵母出发菌株中，得到重组后的基 因工程菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除；

(4)pGAPza质粒丢失

具体如下：

(1)重组质粒的构建

①以出发菌株总DNA为模板，PCR扩增出SEC5基因的上、下游序列；

②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基 因；

③将步骤(1)-①和(1)-②获得的PCR产物依次连接到含有Amp抗性的 pUC19质粒上，获得重组质粒；

(2)SEC5基因的敲除

①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有SEC5基因的上、下游序 列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段；

②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株中，得到重组 菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的重组菌株中，

②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板 上不生长的基因工程菌株；

(4)pGAPza质粒丢失

将步骤(3)-②中挑选的基因工程菌株于YEPD液体培养基中进行传代培养， 选取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR 扩增，验证pGAPza质粒是否丢失。

(5)工业菌株进行第二条等位基因敲除

利用(2)-②中所述方法向(4)中得到的菌株中导入(2)-①所得的重组 片段，筛选得第二条等位基因缺失的重组工业菌株，并按照步骤(3)和(4)去 除KanMX抗性基因。

所述重组菌株可通过上述方法构建获得，这些方法已有许多文献报道，如 Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用 本领域已知的其它方法来构建基因突变的酵母菌株。

本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的 基因序列，该基因序列是以所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株基因组为模板扩 增的特异性片段，该特异性片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2和SEQ  ID NO:3所示。

本发明所述酿酒酵母菌株在其他发酵性能不受影响的情况下，在氮源缺乏 麦芽汁中以16℃发酵4-5d，发酵液中蛋白酶A的酶活与出发菌株明显降低，泡 持性明显增加。

有益效果：

1、本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量，能够提 高纯生啤酒的泡持性，对于模式菌W303-1A，其重组菌株的蛋白酶A酶活较出 发菌株有明显降低，降低约29％，同时，重组菌株的泡持性相较出发菌增加了 17％；对于工业菌株S6其重组菌株的蛋白酶A酶活有明显降低，约为16％，同 时，重组菌株的泡持性相较出发菌增加了13％。

2、本发明选育的酿酒酵母菌株在啤酒发酵的条件下，发酵性能及生长性能 良好，未出现影响重组菌株生长性能或温度致死的情况。对于模式菌株W303-1A 还取得了预想不到的效果，其重组菌株的生长发酵性能非但没有下降，反而提高 了发酵速度，从5天缩短到4天。

3、本发明选育的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株是通过敲除常规条件下组 成型分泌途径中胞吐复合体的核心因子Sec5p的基因来实现的，这为胁迫条件下 选育低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株提供了一个新的方向。

附图说明：

图1为pUC-AKB质粒构建过程

图2为pUC-AKB重组质粒验证图

a中M为DNA maker，泳道1为KpnI单酶切pUC-A质粒，泳道2为EcoRI 和KpnI双酶切pUC-19质粒

b中M为DNA maker，泳道1为BamHI单酶切pUC-AK质粒

c中M为DNA maker；泳道1为以重组质粒pUC-AKB为模板，以SA1和 SB2为引物PCR验证；泳道2为以质粒pUC19为模板，以SA1和SB2为引物 PCR验证

图3为基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组同源重组过程

图4为重组菌株PCR验证结果

a中M为DL5000DNA maker(从上至下依次为：5000、3000、2000、1500、 1000、750、500、250和100bp)；泳道1为以重组菌株WS5K为模板，以S1U 和S1D为引物PCR验证；泳道2为重组菌株SS5K-1为模板，以S1U和S1D为 引物PCR验证；泳道3为出发菌株W303-1A为模板，以S1U和S1D为引物PCR 验证；泳道4为出发菌株S6为模板，以S1U和S1D为引物PCR验证

b中M为DL5000DNA maker(从上至下依次为：5000、3000、2000、1500、 1000、750、500、250和100bp)；泳道1为重组菌株WS5K为模板，以S2U和 S2D为引物PCR验证；泳道2为重组菌株SS5K-1为模板，以S2U和S2D为引 物PCR验证；泳道3为出发菌株W303-1A为模板，以S2U和S2D为引物PCR 验证；泳道4为出发菌株S6为模板，以S2U和S2D为引物PCR验证

图5为重组菌株WS5K KanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证

a中M为DNA Marker；泳道1为以重组菌株WS5K基因组为模板，K1和 K2为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株 基因组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增；

b中M为DNA Marker；泳道1为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第一 代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除 KanMX抗性基因重组菌株的第十代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR 扩增的产物；

图6为重组菌株SS5K-1KanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证

a中M为DNA Marker；泳道1为为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因 组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增；泳道2为以重组菌株SS5K-1基因 组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增的产物；

b中M为DNA Marker；泳道1以去除KanMX抗性基因重组菌株的第十代 酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除 KanMX抗性基因重组菌株的第一代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR 扩增的产物；

图7为敲除第二个等位基因的重组菌株PCR验证结果

a中M为DNA maker；泳道1为以重组菌株SS5-1为模板，以S1U和S1D 为引物PCR验证；泳道2为重组菌株SS5K-2为模板，以S1U和S1D为引物PCR 验证；

b中M为DNA maker；泳道1为以重组菌株SS5-1为模板，以S2U和S2D 为引物PCR验证；泳道2为重组菌株SS5K-2为模板，以S2U和S2D为引物PCR 验证；

图8为重组菌株SS5K-2KanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证

a中M为DNA Marker；泳道1为以重组菌株SS5K-2基因组为模板，K1和 K2为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株 基因组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增；；

b中M为DNA Marker；泳道1为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第一 代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；泳道2为以去除 KanMX抗性基因重组菌株的第十代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR 扩增的产物；

图9为出发菌株W303-1A及重组菌株WS5二氧化碳累积失重

图10为出发菌株S6及重组菌株SS5-2二氧化碳累积失重

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株及 其构建方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株WS5的构建

出发菌株W303-1A通过两次同源重组的方法构建重组基因工程菌株。

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例中 各引物。

表1 本实施例中所用到的引物

注：划线部分表示酶切位点

(1)重组质粒pUC-AKB的构建

重组质粒pUC-AKB的构建流程如图1所示.

①以酵母出发菌株W303-1A总DNA为模板，利用引物SA1和SA2PCR扩 增出SEC5基因的上游序列SA；

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃45s；72℃30s，30个循环；72℃ 10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

PCR反应体系(20μL)

将PCR产物连接到含有Amp抗性的pUC19质粒载体上，获得重组质粒 pUC-A。

②以pUC6质粒为模板，以引物K1和K2PCR扩增出KanMX抗性基因；

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃45s；72℃90s，30个循环；72℃ 10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到重组质粒pUC-A上，得到重组质粒pUC-AK。

③以酵母出发菌株W303-1A总DNA为模板，以引物SB1和SB2PCR扩增 出SEC5基因的下游序列SB；

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃45s；72℃30s，30个循环；72℃ 10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到重组质粒pUC-AK上，得到重组质粒pUC-AKB，图2 为重组质粒酶切验证图。

(2)SEC5基因的敲除

基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组重组过程如图3所示。

以重组质粒pUC-AKB为模板，PCR扩增获出含有SEC5基因的上、下游序列和 KanMX抗性基因的重组基因盒SA-KanMX-SB片段。通过醋酸锂转化的方法将重 组基因盒SA-KanMX-SB导入酿酒酵母出发菌株W303-1A中，通过SA和SB片 段与酵母染色体上SEC5基因两侧的同源序列同源重组，从而整合到酵母染色体 上并随染色体一起复制，KanMX片段同源重组替换了酵母染色体上的SEC5基 因，从而得到SEC5基因完全敲除的重组菌株WS5K，并使重组子获得G418抗 性。根据出发菌株W303-1A已知的G418抗性，选取800μg/ml的G418抗性平 板筛选转化子，能在抗性平板上生长的即为可能的重组菌株。提取WS5K的基 因组为模板，分别以引物S1U/S1D和S2U/S2D为引物进行PCR扩增，分别得到 1276bp(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)和1715bp(核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示)的条带；而以W303-1A的基因组为模板不能扩增出1276bp和1715bp 的条带，说明SEC5敲除成功，如图4。

(3)抗性基因KanMX的去除

采用Cre-LoxP报告基因挽救系统来剔除WS5K中的KanMX抗性基因，具 体实施方法如下：

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒导入WS5K中，并用Zeocin抗性浓度 为500mg/mL的YEPD平板筛选转化子,避光培养2-3天；

②将带有pGAPza质粒的转化子在半乳糖培养基中诱导表达5h左右，梯度 稀释后取适量菌液涂布于YEPD平板，培养1-2天；

③挑取步骤②中长出的单菌落对应点接到无G418的YEPD平板和含有800 μg/mL G418的YEPD平板上，30℃培养2-3d；

④挑取上述步骤③中在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能 生长的单菌落进行提基因组；

⑤以步骤④提取的基因组为模板，以K1/K2为引物，进行PCR扩增。以 重组菌株WS5K基因组为模板扩增出约1600bp的条带(核苷酸序列如SEQ ID  NO：4所示)，而步骤③中在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不 能生长的单菌落基因组不能扩增出1600bp的条带，证明KanMX抗性基因去除 成功，如图5a；

(4)pGAPza质粒的丢失

①将去除KanMX抗性基因的菌株于YEPD培养基中进行培养，以丢失其导 入的pGAPza质粒，传代10次；

②选取去除KanMX抗性基因的菌株的第一代和第十代提取酵母 质粒，然后利用提取质粒为模板，利用Z-U和Z-D引物进行PCR扩 增。第一代酵母质粒上可以扩增出1200bp左右大小的Zeocin抗性基 因片段，而从第十代酵母质粒上则扩增不出，证明突变株中的pGAPza 质粒已丢失，进而得到去除KanMX抗性基因同时丢失pGAPza质粒 的重组菌株WS5，验证图如图5b。

实施例2：低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株SS5-2的构建

出发菌株S6通过两次同源重组的方法构建重组基因工程菌株。本实施例中 所用各引物同实施例1。

(1)SEC5一条等位基因的敲除

以实施例1-(1)中得到的重组质粒pUC-AKB为模板，PCR扩增获得重组 基因盒SA-KanMX-SB片段。利用实施例1-(2)中所述方法将重组盒导入出发菌 株S6中，得到一条等位基因敲除的重组菌株SS5K-1。提取SS5K-1的基因组为 模板，分别以引物S1U/S1D和S2U/S2D为引物进行PCR扩增，分别得到1276bp (核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)和1715bp(核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示)的条带；而以S6的基因组为模板不能扩增出1276bp和1715bp的条带， 说明SEC5敲除成功，如图4。

(2)SS5K-1抗性基因KanMX的去除和pGAPza质粒的丢失

采用Cre-LoxP报告基因挽救系统来剔除SS5K-1中的KanMX抗性基因，并 采用连续传代的方式丢失导入的pGAPza质粒，具体实施方法同实施例1-(3) 和(4)，得到重组菌株SS5-1，验证图如图6

(3)重组工业菌株SS5-1第二条SEC5等位基因的敲除

利用(2)中所述方法将SEC5基因敲除盒SA-KanMX-SB导入重组工业菌 株SS5-1中，筛选得到第二条SEC5等位基因敲除的重组工业菌株SS5K-2，如 图7。

(4)SS5K-2抗性基因KanMX的去除和pGAPza质粒的丢失

采用Cre-LoxP报告基因挽救系统来剔除SS5K-2中的KanMX抗性基因，并 采用连续传代的方式丢失导入的pGAPza质粒，具体实施方法同实施例1-(3) 和(4)，得到重组工业菌株SS5-2，如图8。

实施例3：低分泌蛋白酶A酿酒酵母WS5发酵实验

将出发菌株W303-1A与重组酿酒酵母实验室菌株WS5同时进行啤酒发酵 实验。氮源缺乏麦芽汁制作工艺：称量一定量的粉碎的麦芽，按1：4的料水比 于65℃糖化至碘检完毕，用糖度计调整外观糖度至5°Brix，再补加葡萄糖至外 观糖度为10°Brix。将培养好的种子液离心得酵母泥，按照0.8％的接种量接入氮 缺乏麦汁培养基中，16℃静置发酵5天。

(1)低分泌蛋白酶A菌株WS5的蛋白酶A酶活及泡持性

出发菌株W303-1A及重组菌株WS5泡持性的测定采用NIBEM法。蛋白酶 A活力的测定采用荧光底物法：向试管中一次加入蒸馏水1370μL，磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液1500μL，待测样品100μL；并依次向上述试管中加入12μL 1mM 的荧光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu(Dnp)-NH₂，37℃准确反应 30min后，加入18μL 0.5M氢氧化钠溶液终止反应。用荧光分光光度计测定荧光 强度(Ex＝328nm，Em＝393nm)。

经测定，出发菌株W303-1A与重组菌株WS5的蛋白酶A酶活分别为0.62 ×10^-4U/mL、0.44×10^-4U/mL。与出发菌株比较，重组菌株的蛋白酶A酶活有 明显降低，约为29％。同时，重组菌株WS5的泡持性为211s，而出发菌株W303-1A 的泡持性为181s，其泡持性增加了17％。以上结果说明：胁迫条件下，敲除SEC5 的重组菌株WS5其PrA活力明显下降，且泡持性也得到了相应的提高。

(2)所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株WS5的基本发酵性能

发酵过程中，毎24h称一次重，以CO₂累积失重为纵坐标，发酵时间为横 坐标，绘制CO₂累积失重曲线(如图9)。发酵结束后测定酒精度、残糖和α-氨 基氮。酒精度的测定根据国标中规定的酒精容量法进行，残糖的测定采用滴定法， α-氨基氮的测定采用茚三酮比色法进行，结果见表2。结果表明，SEC5基因缺 失后，实验室酿酒酵母菌株在啤酒发酵的温度条件下能够正常生长，未出现温度 致死的情况，且发酵速度明显加快，发酵时间缩短1天，而酒精度、残糖及α- 氨基氮的最终含量并没有显著变化。

表2 菌株发酵性能比较

实施例4：低分泌蛋白酶A酿酒酵母工业菌株SS5-2发酵实验

将出发菌株S6与重组酿酒酵母工业菌株SS5-2同时进行啤酒发酵实验，发 酵培养基及发酵条件同实施例2。

(1)低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株SS5-2的蛋白酶A酶活及泡持性

发酵结束后，出发菌株S6及重组菌株SS5-2蛋白酶A及泡持性的测定方法 同实施例2。

经测定，出发菌株S6与重组菌株SS5-2的蛋白酶A酶活分别为0.32×10^-4U/mL、0.27×10^-4U/mL。与出发菌株比较，重组工业菌株SS5-2的蛋白酶A酶 活有明显降低，约为16％。同时重组菌株SS5-2的泡持性为231s，而出发菌株 S6的泡持性为205s，其泡持性增加了13％。以上结果说明：胁迫条件下，敲除 SEC5两个等位基因的重组菌株SS5-2其PrA活力明显下降，且泡持性也得到了 相应的提高。

(2)低分泌蛋白酶A酿酒酵母工业菌株SS5-2的基本发酵性能

发酵过程中，毎24h称一次重，以CO₂累积失重为纵坐标，发酵时间为横 坐标，绘制CO₂累积失重曲线(如图10)。发酵结束后测定酒精度、残糖和α- 氨基氮，测定方法同实施例2，结果见表3。由此看出，工业酿酒酵母菌株的两 个SEC5等位基因缺失后，菌体在啤酒发酵的温度条件下能够正常生长，未出现 温度致死的情况，并且啤酒发酵的发酵速度、酒精度、残糖及α-氨基氮等基本发 酵性能并没有发生显著变化。

表3 菌株发酵性能比较