示踪剂和标记产品中示踪剂的方法

本发明涉及一种示踪剂和检测产品组合物中的示踪剂化合物的方 法。特别是涉及依靠表面增强光谱技术来检测复杂产品组合物中的示 踪剂化合物的方法。

公知向高价值产品中添加明显不同的示踪剂化合物，以提供用于 识别伪造产品的手段，和确定真产品是否经过掺假(例如经过稀释)。 示踪剂化合物通常以非常低的浓度添加，因而需要使用灵敏的分析方 法来检测示踪剂化合物，并且测量与示踪剂化合物添加时的浓度相比 其浓度的变化。表面增强光谱(SES)是这样一种确定非常低浓度的分析 物的方法。例如WO2008/019161中描述了SES用于检测液体产品中 的示踪剂化合物的用途，其涉及用表面增强拉曼光谱法(SERS)标记来 进行燃料识别的方法。该方法包括将具有已知拉曼光谱的物质与一定 量的燃料相关联。在一个实施方案中，可以将SERS活性染料(包括拉 曼活性指示剂化合物)与一定量的燃料混合。识别燃料的方法则可以包 括将燃料样品与拉曼增强金属颗粒的胶体混合，然后获得与示踪剂相 关联的拉曼活性指示剂化合物的拉曼光谱。可选地，可以将部分样品 与SERS活性基质相关联。通过与胶态金属颗粒或SERS基质相关联 来检测液体(例如燃料)中的SERS活性示踪剂化合物的原则理论上应 当可以应用于其他液体产品。然而，已经发现许多产品存在问题，无 法通过对WO2008/019161中的简单方法简单应用而解决。液体产品的 某些性质，例如它们的粘度、光学透明度或组成，可能阻碍示踪剂化 合物与增强金属胶体或基质的表面的相互作用，或者以其他方式妨碍 收集示踪剂化合物的SERS光谱。本发明的一个目标是提供识别示踪 剂化合物的方法，其可以克服至少一些现有技术所遇到的问题。

根据本发明，提供一种识别包含至少一种原始液体成分的液体组合 物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向含有所述至少一种原始液体成分的已知液体组合物中添加示 踪剂化合物，以形成经标记的已知液体组合物；

b)获得未识别的液体组合物的样品；

c)任选地，通过与液体混合来稀释所述未识别的液体组合物的样 品；

d)使所述任选稀释的未识别的液体的样品与包含金、银或铜的光 谱增强表面接触；

e)获得该样品的拉曼光谱；和

f)从所述光谱计算相对于该未识别的组合物的样品中所述原始液 体成分的浓度的该示踪剂的浓度；

g)将在f中算出的相对浓度与该经标记的已知液体组合物的该示 踪剂和原始液体成分的相应相对浓度进行比较。

表面增强光谱包括这样的光谱方法：当分析物分子接近具有等离子 体激元增强表面的物质，或者被该物质吸附时，该光谱方法易于增强。 SES的优选形式包括SERS(表面增强拉曼光谱法)和SERRS(表面增强 共振拉曼光谱法)。优选地，拉曼光谱是共振拉曼光谱。

液体组合物通常是例如以下的产品：燃料、燃料添加剂、润滑剂、 生物衍生产品(例如植物油)、柴油机废液、杀虫剂、漆、油墨或药物， 或者任何其他需要保证其来源和标识的组合物。这些产品可能是伪造活 动的目标，对真产品的提供商和经常也对伪造产品的使用者造成经济上 的和其他的损害。

示踪剂经选择以溶于液体组合物，并且易于通过SES来检测。优选 地，示踪剂化合物可以在低于10^-4M的浓度检测到，尤其是低于10^-6M， 特别优选在≤10^-7M的浓度。为使示踪剂在这些浓度可检测到，必须使 用本发明的方法在组合物中提供高SES信号强度。“高信号强度”是指 由示踪剂产生的信号必须能够与组合物的任何其他组分的信号分辨。示 踪剂必须在组合物中经时稳定。稳定是指使用本发明的方法测量的示踪 剂的SES信号在组合物需要被识别的时间段内不能显著变化。该时间段 通常为几个月或几年，即组合物存在于分销链中的时期。如果需要，示 踪剂可以对组合物赋予可见颜色，不过这种颜色可能在深色或不透明的 组合物中被掩盖。可选地，可以使用无形的(silent)示踪剂，即示踪剂不 影响用裸眼观察的液体组合物的外观。

适合的示踪剂包括呫吨染料，例如若丹明(例如若丹明6G)、荧光素、 曙红(例如曙红Y和曙红B)、偶氮(和重氮)染料如诱惑红(Allura Red)和 酒石黄；香豆素(例如5,6-苯并吡喃-2-酮)、噻唑、噁嗪和三芳基甲烷。 这些着色染料特别适于使用可见激光线的SERRS分析。其他适合的化 合物包括，作为非限制性实例的非着色化合物，例如BPET(反式1,2- 双(4-吡啶基)-乙烯)和喹啉。

液体组合物可以任选地被分离，以提供含有溶解的示踪剂化合物 的液体部分和组合物的固体组分(如果存在任何这种组分的话)。如果 发现存在的固体妨碍光谱学测量，例如如果它们使液体组合物过于不 透明以至无法获得有意义的光谱，可以进行该步骤。可以通过本领域 技术人员已知的任何适当手段对含有溶解的示踪剂化合物的液体与组 合物中存在的固体进行分离。这种方法包括过滤和离心。如果使用过 滤，重要的是使用不会影响液体滤液中的示踪剂化合物的浓度的过滤 方法和材料。这可以通过选择示踪剂化合物不吸附到其上，或者优选 其不吸附液体组合物中任何组分的过滤器介质来实现。所选择的过滤 器的性质取决于示踪剂和组合物的液体组分的特性。适合的过滤器包 括由PTFE制成的那些。要用的过滤器介质对于示踪剂化合物的非亲 合性可以如下来测试：使在溶剂中含有示踪剂化合物的溶液经过过滤 器介质，并确定过滤后SES信号是否改变。不希望被束缚，相信某些 固体的存在会吸附或吸收示踪剂，或者以其他方式妨碍示踪剂分析结 合到光谱学增强表面。此外，固体的存在会对胶态金属SES基质(其 通常需要聚集以产生SES效应)的聚集，或者光透过样品产生不利影 响。

在本发明方法的一些实施方案中，样品可以用稀释液稀释。液体 的稀释可以在任选的分离步骤(如果进行的话)之前或之后进行。已经 发现，通过与液体混合来稀释组合物，与未稀释的样品相比，可以增 强示踪剂化合物的SES光谱，这可能是因为组合物其他组分的光谱被 抑制了。样品的稀释还促进粘性样品的精确处理和配制。显然，必须 知晓用来稀释样品的液体量，来计算稀释前原始样品中示踪剂化合物 的浓度。稀释液优选与组合物的至少一些组分混溶。对于许多组合物 而言，水可以用作稀释剂。可以通过增加SES光谱和/或提高配制样品 精确度所需的任何适合量来稀释样品。可以通过常规实验来确定将要 使用的适当稀释剂的标识和最佳量。通常，将样品稀释到按体积或重 量计约1-1000倍，尤其是约10-20倍。在一些环境中，如果由于组合 物的粘度，难以进行体积的精确配制，则按重量稀释是更方便的。

SES基质是具有表面的基质，该表面能够增强接近该表面或与其 接触的分子的光谱反应，即它能够促进表面增强光谱学。SES基质可 以是任何能够增强光谱学、特别是振动和拉曼光谱学的物质。SES基 质通常包括金属，例如银、金和铜。也可以使用其他SES基质，特别 是金属，包括Na和Al和过渡金属如Pt、Ni、Ru、Rh、Pd、Co、Fe、 Cr。随着研发出新的表面增强光谱学方法，不同的SES促进基质可能 变得可获得，并且可以用于本发明的方法。SES基质可以为小颗粒的 形式，通常为纳米颗粒，典型地用作胶体溶液，尤其是含水的胶体溶 液。可选地，SES基质可以为平面材料的形式，该平面材料具有包括 固定的金属胶体形式的微结构的金属表面，或者由例如金、银或铜的 金属制成或涂覆的图案化表面。适合的SES基质可广泛地商购，作为 胶态的金、银或铜溶液，或者作为用于具有等离子体激元表面的SES 的专门平面材料，例如Klarite^TM。作为另外的可选项，SES基质可以 包括SES膜或涂层，例如iFyber^TM，其是涂覆有金或银纳米颗粒的吸 收剂膜。也可以使用其他纳米颗粒涂覆的基质，例如纤维或二氧化硅 或玻璃球。

在优选的形式中，光谱学增强表面包括分散于液体(其通常为含水 液体)中的金、银或铜的胶态纳米颗粒。通常，在与原始组合物中存在 的任何固体分离后，将液体样品添加到金属颗粒的胶态溶液中，或者 相反，并搅拌以使液体样品中存在的化合物与金属颗粒接触。公知当 纳米颗粒聚集成簇时，金属纳米颗粒的光谱学增强效果得到提高。优 选向胶体颗粒和液体的混合物添加聚集剂，以促进金属颗粒聚集，从 而提高金属表面的光谱学增强效果。已经发现，选择特定的聚集剂可 以促进获自样品的SES信号。可以在液体与胶态纳米颗粒混合之前或 之后，向液体添加聚集剂。已经发现，在一些环境中，在液体样品与 胶态颗粒混合之后添加聚集剂是有利的，特别是因为如此该方法可以 更加可再现。聚集剂尤其是可以选自酸例如HCl、HNO₃，和碱例如 有机胺，和盐溶液例如金属氯化物、硝酸盐或硫酸盐。除了选择特定 化合物作为聚集剂之外，已经发现聚集剂的浓度和/或聚集剂的用量也 会对获自胶态金属混合物中的样品的SES信号的强度具有显著影响。 已知相对于其他模式，使用SES的一些拉曼散射模式的检测得到增强。 优选地，选择SES基质和聚集剂(如果使用的话)，以使得示踪剂的选 择性谱带或峰得到增强，从而进一步增大获自低示踪剂浓度的信号。

相对于组合物的至少一种原始液体成分的浓度，计算样品中示踪 剂的浓度。

该至少一种原始液体成分可以是组合物的主要或唯一成分，例如 在液体燃料组合物的情况中，原始液体成分可以是燃料化合物本身。 当液体组合物含有多于一种成分时，原始液体成分可以是那些成分中 的任一种。原始液体成分可以是化合物的溶解形式(该化合物本是固 体，但为了包含在液体组合物中)。术语原始液体成分不用于包括示踪 剂化合物，即添加到组合物中仅为识别目的的化合物。原始液体成分 不用于包括且优选不包括添加到组合物中用于分析目的的液体化合 物，例如分析目的所需的溶剂或内标物。原始液体成分是示踪剂添加 到组合物时液体组合物的一种组分。原始液体成分易于通过SES检测。

优选地，原始液体成分是组合物的功能性成分。功能性成分是指 出于与组合物的计划用途相关的目的而存在于组合物中的化合物，与 此相反，示踪剂化合物处于识别的目的而添加到组合物中，通常对组 合物的计划用途没有贡献。功能性成分可以是活性化合物，例如杀虫 剂组合物中的杀生物化合物或柴油排放添加剂中的尿素，或者辅助成 分，例如防腐剂、消泡剂、溶剂、表面活性剂、稀释剂、着色剂、香 料或其他在组合物中起作用的化合物，该作用与组合物中的活性化合 物的物理掺入或者其活性的增强和延长有关。当相对于原始液体成分 计算示踪剂的浓度时，不需计算它在组合物中的绝对浓度。原始液体 成分优选使用本发明的方法获得SES光谱，和优选在与示踪剂化合物 相同的SES光谱中获得可测量的但明显的峰。优选地，选择SES基质、 聚集剂(如果使用的话)和分析条件，以使得SES光谱获得清楚的光谱， 显示与示踪剂化合物相关联的明显的和可测量的峰，以及与原始液体 成分相关联的明显的和可测量的峰。优选地，选择SES基质和聚集剂 (如果使用的话)，以使得示踪剂的选择性谱带或峰得到增强，从而进 一步增大获自低示踪剂浓度的信号。在这样的情况中，仅需要使用本 发明的方法，计算获得的光谱中与示踪剂相关联的单峰的强度相对于 与原始液体成分相关联的一个或多个峰的强度之比。可以将示踪剂和 原始液体成分的多于一个峰进行比较和用来计算示踪剂的相对浓度。 作为另外的可选项，可以使用示踪剂和原始液体成分的合并光谱的特 性作为组合物中示踪剂浓度的指标。可以将SES光谱中存在的与示踪 剂相关联的一个或多个峰的强度或其他特性与使用类似或不同光谱方 法获得的光谱中的与原始液体成分相关联的一个或多个峰的特性相比 较。不同的光谱方法可以为与用来获得示踪剂化合物光谱的方法不同 的SES方法。可选地，它可以为非SES方法，例如红外光谱学或非 SES拉曼光谱学。

SERS活性示踪剂化合物与原始液体成分的相对量可以由(i)响应 SERS活性示踪剂化合物的拉曼光谱学检测器与(ii)响应原始液体成分 的光谱学检测器之比来计算。检测器响应值之比可以为SES光谱和非 SES光谱(如果使用的话)的所选峰(峰高、峰面积)之比。可以使用获自 仅含有目标SES活性示踪剂或原始液体成分的参照样品的SES光谱来 识别适合的峰，该峰为示踪剂或原始液体成分的特性，并且可以选择 用来比较化合物的相对响应值。相对响应值可以由属于各化合物的一 个峰或多于一个峰的相对强度来计算。作为可选项，可以将获自与SES 基质接触的样品的拉曼光谱学的整个光谱或它的一部分，优选以矢量 形式，与获自与SES基质接触的、含有已知浓度的SES活性示踪剂化 合物的参照样品的光谱，和获自与SERS基质接触的、含有已知浓度 的原始液体成分的参照样品的光谱相比较。可以使用光谱的经计算的 性质，例如与存在的一种或各种化合物的参照光谱相比的相对响应值， 来代表对于SERS活性示踪剂和/或原始液体成分的检测器响应值。不 总是需要收集和显示拉曼光谱。测量在一个或多个预定的拉曼偏移波 数或波数范围的检测器响应值，和由测得的响应值计算示踪剂浓度， 可以是足够的。可以将计算结果显示给使用者，作为浓度值、“通过/ 失败”结果，或者作为品质或相似性基于对于含有标准量示踪剂的溶 液的值的随机值。比较光谱和计算相对响应值和峰之比的方法是公知 的，通常使用由光谱数据处理软件进行程序控制的适当计算机来进行。 SERS活性示踪剂化合物的浓度和拉曼检测器响应值之比之间的关系 是线性的，可以通过校准来确定。

本发明的方法可以快速地且使用紧凑型装置进行，因此它可以用 作测试来在组合物销售、运输或储存的“现场”确认该组合物的标识。 如果需要，可以使用标准实验室方法例如色谱法和质谱法进行证实分 析，以确认通过本发明的方法获得的结果。证实分析可以测量示踪剂 的浓度或组合物其他组分(例如第二示踪剂或组合物的功能性成分)的 浓度。

附图说明

图1是实施例1中描述的示踪剂、产品和示踪剂-产品混合物的拉 曼光谱。

图2是实施例2中描述的示踪剂、产品和示踪剂-产品混合物的拉 曼光谱。

图3是实施例2的示踪剂浓度相对于原始液体成分和示踪剂的 SES响应值之比的图。

图4是实施例3中描述的示踪剂、产品和示踪剂-产品混合物的拉 曼光谱。

图5是实施例3的示踪剂浓度相对于原始液体成分和示踪剂的 SES响应值之比的图。

图6是实施例4中描述的示踪剂、产品和示踪剂-产品混合物的拉 曼光谱。

实施例1

将130μl银胶体和130μl高纯水添加到(96孔板)的一个孔中，并 充分混合。将含有100ppb w/v(10^-7M)示踪剂化合物的经标记的杀虫 剂的30μl样品添加到该孔中。通过移液管吸取来充分混合孔板的内容 物。然后将10μl 0.01M的精胺添加到该混合物中并混合。然后使用 Renishaw^TM inVia拉曼显微镜，使用5×物镜，在532nm激发波长对 该样品进行SERS测量。

获自该样品的拉曼光谱示于图1中，作为光谱的粗线。水中示踪 剂化合物的光谱(虚线)和未经标记的杀虫剂产品的光谱(点划线)也示 于图1中用于比较。

比较光谱，显然在经标记的产品光谱中存在几个峰，它们属于示 踪剂或产品，这些峰可用来确定产品中示踪剂的相对量。

实施例2

使用拉曼活性示踪剂化合物(选自允许添加到食品中的化合物的 现有列表)来标记商购的农用化学品配制物。制备去离子水中含有 100mg/l拉曼活性示踪剂化合物的溶液。使用该溶液的部分来标记该 农用化学产品的样品，拉曼活性化合物在该农用化学品配制物中的浓 度为0mg/l至5mg/l。

用去离子水将经标记的和未经标记的农用化学产品的样品稀释到 至少1/10浓度，然后进行分析。将经稀释的农用化学产品(<10毫升) 添加到2ml顶部有螺纹的玻璃瓶中的水(130毫升)中。添加银胶体(130 毫升)，然后还添加精胺(10毫升，0.01M)作为聚集剂。对该瓶进行充 分搅拌。在Sierra 532nm拉曼光谱计(来自Snowy Range Instruments) 上，以0.5秒的采集时间，以40mW激光功率进行平均超过50次扫描， 获得拉曼光谱。

获得未经标记的农用化学产品的光谱，记录其拉曼信号的位置。 也获得经标记的农用化学产品的光谱，记录由示踪剂产生的那些信号。 图2中的竖线显示了光谱中示踪剂信号(如果存在的话)的位置。出于 说明的目的，光谱经过了彼此人工偏移。

在图3中，对示踪剂的峰高与农用化学产品的峰高之比作为示踪 剂的函数作图。该比随示踪剂的浓度线性变化。知晓信号比和示踪剂 浓度之间的关系，操作者拥有了确定未知来源的农用化学产品的样品 中示踪剂浓度的手段。

实施例3

使用拉曼活性示踪剂化合物来标记商购无光白漆。制备去离子水 中含有4mg/l拉曼活性化合物的溶液。使用该溶液的部分来标记该漆 的样品，拉曼活性化合物在该漆中的浓度为0mg/l至50mg/l。

进行分析前，用去离子水将被测试的漆的样品稀释到1/10浓度。 将经稀释的漆(30毫升)添加到2ml顶部有螺纹的玻璃瓶中的90nm胶 态金(500毫升，0.01％w/vol)中。将其充分搅拌，然后添加盐溶液(500 毫升，10％w/vol)。以2500rpm对样品离心5分钟。在785nm QE65000 拉曼光谱计(来自Ocean Optics Inc)上，以1秒的采集时间和180mW 的激光功率获得拉曼光谱。

图4比较了经标记的和未经标记的漆的拉曼光谱。在图5中，对 示踪剂的两个峰高各自相对于漆的峰(超出图4中所示的波数范围)之 比作为示踪剂浓度的函数作图。知晓信号比和示踪剂浓度之间的关系， 操作者拥有了确定未知来源的漆的样品中示踪剂浓度的手段。

实施例4

含水溶液中含有32.5重量％尿素的柴油机废液的样品是待标记的 产品。将拉曼活性示踪剂化合物添加到该柴油机废液中，以提供 1.1×10^-6M的示踪剂最终浓度。不进行任何事先稀释，将该柴油机废液 用于随后的分析。

将经标记的柴油机废液(30毫升)添加到2ml顶部有螺纹的玻璃瓶 中的水(130毫升)中。然后添加银胶体(130毫升)，通过超声处理(15 分钟)混合内容物。将精胺(10毫升，0.01M)添加到该混合物中，再次 通过超声处理混合该瓶。在Sierra 532nm拉曼光谱计(来自Snowy  Range Instruments^TM Inc)上，以0.5秒的采集时间，以40mW激光功 率进行平均超过10次扫描，获得拉曼光谱。

获得未经标记的柴油机废液的光谱，记录其拉曼信号的位置。也 获得经标记的柴油机废液的光谱，记录由示踪剂产生的那些信号。

对示踪剂的峰与柴油机废液的峰之比进行解释，以确定样品中示 踪剂的量。知晓示踪剂与尿素信号之比和示踪剂浓度之间的关系，操 作者拥有了确定未知来源的柴油机废液的样品中示踪剂浓度的手段。