一种丹参酮ⅡA微乳制剂、丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂以及它们的制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种丹参酮ⅡA微乳制剂、丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂以及它们的制备方法。

背景技术

丹参属于唇形科植物，是我国传统的中药材，最早见于《神农本草经》，其被列为上品。丹参酮ⅡA是从丹参中提取的脂溶性成分，为樱红色针状结晶，熔点为209-210℃，微溶于水，易溶于二甲基亚砜、乙醇、丙酮、乙醚和苯等有机溶剂。丹参酮IIA在高温和光照条件下不稳定，容易发生降解反应，但溶液的pH基本对丹参酮IIA的稳定性无影响。丹参酮ⅡA的水溶性较差，在水中的溶解度约7.0μg/mL，透膜性差，自身易受P-糖蛋白作用及肝脏首过效应的影响。石远等的研究结果表明注射用丹参酮ⅡA在体内代谢和排泄较快，平均体内滞留时间(MRT)为29.14min，平均分布半衰期(t_1/2α)为11.64min。由此可见，丹参酮ⅡA的胃肠道吸收差、体内消除快、生物利用度低。但丹参酮ⅡA可参与体内多种生化反应而具有广泛的药理活性，如能够较好的保护心脑血管、抗肿瘤、抗炎、抑菌等作用，具有较高的应用价值。

中药微乳凝胶(microemulsion-based gels,MBGs)是将药材提取物与适宜的油相、乳化剂、助乳化剂、水所制得的微乳液加入至凝胶基质中形成的透明、均质、稳定的凝胶网状结构，网状结构中含有微乳液滴。众多研究表明，微乳具有增加药物的溶解度、促进吸收、提高药物稳定性、延长药物作用时间、维持恒定的血药浓度等特点，因此日益受到研究者的重视，但微乳流动性强，作为外用制剂载体生物黏附性差，滞留时间短，因而限制了其实际应用。微乳凝胶作为新型给药系统兼具微乳和凝胶的双重优点，继承了微乳提高难溶性药物的溶解度，提高药物的生物利用度、提高药物稳定性、延长药物作用时间、维持恒定的血药浓度的优点，同时可克服微乳因长期贮存，水分易蒸发而导致的表面活性剂浓度升高、皮肤刺激性强的缺点；又继承了凝胶能较长时间地与作用部位黏附，有较好的生物相容性，可以产生持久、恒定并容易控制的血药浓度，避免峰谷现象的出现，减少用药次数，提高药物的安全性、有效性和稳定性，不污染衣物的优点。

丹参酮ⅡA具有许多的药理活性，在临床上应用的较为广泛，现将其药理作用及临床应用进行了简单的总结。

目前丹参酮ⅡA在临床的应用主要有以下方面：①用于治疗心血管方面的疾病如慢性心衰、老年肺心病、不稳定型心绞痛等；②慢性肝炎肝纤维化；③抗恶性肿瘤；④急性脑出血。

目前有关丹参酮ⅡA的剂型研究主要有注射和口服两种剂型，包括注射剂、口服的固体分散体、注射用亚微乳和微乳、口服微囊、口服脉冲微丸、注射用脂微球、口服固体脂质纳米粒和口服纳米囊。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何克服现有制剂中丹参酮ⅡA的胃肠道吸收差、体内消除快、生物利用度低的缺陷，将丹参酮ⅡA制备成生物利用度高的剂型；以及如何克服丹参酮ⅡA的溶解度低，通过现有技术难以制成生物利用度高的微乳制剂和微乳凝胶制剂的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丹参酮ⅡA微乳制剂及其制备方法。

本发明所提供的丹参酮ⅡA微乳制剂，由下述组分组成：丹参酮ⅡA、乳化剂、助乳化剂、油相和水。

所述乳化剂为质量比为6-8:3(如7:3)的Solutrol HS-15与吐温80的混合物。

所述助乳化剂为无水乙醇。

所述油相为由薰衣草精油、迷迭香精油、葡萄柚精油和茶树精油以质量比为2:2:1:1组成的复方植物精油。

所述乳化剂与助乳化剂的质量比为8/2-6/4，如8/2、7/3或6/4，具体可为6/4。

所述乳化剂与助乳化剂的混合物与所述油相的质量比为9/1－4/1，如9/1、8/1、7/1、6/1、5/1或4/1，具体可为6/1。

在所述丹参酮ⅡA微乳制剂中，水的质量百分含量为≥40％，如46％。

所述丹参酮ⅡA微乳制剂中，丹参酮ⅡA的质量浓度为0.55mg/mL-1.02mg/mL。

所述丹参酮ⅡA微乳制剂是按照下述1)、2)或3)进行制备的：

1)先将所述乳化剂、助乳化剂、油相和水进行混合得到空白微乳，再将丹参酮ⅡA加入到所述空白微乳中，搅拌均匀后，得到丹参酮ⅡA微乳制剂；

2)搅拌下先用所述助乳化剂将丹参酮ⅡA溶解，再加入所述乳化剂、油相和水，得到丹参酮ⅡA微乳制剂；

3)搅拌下先用所述油相、乳化剂和助乳化剂将丹参酮ⅡA溶解，再加入水，得到丹参酮ⅡA微乳制剂。

上述方法中，所述搅拌的速度均为250r/min-500r/min，具体可为250r/min，时间均为0.5h-1.5h，具体可为0.5h。

优选采用所述1)来制备所述丹参酮ⅡA微乳制剂。

本发明还提供了一种丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂及其制备方法。

本发明所提供的丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂由下述组分组成：丹参酮ⅡA、乳化剂、助乳化剂、油相、水、卡波姆940和三乙醇胺。

所述乳化剂为质量比为7:3的Solutrol HS-15与吐温80的混合物。

所述助乳化剂为无水乙醇。

所述油相为由薰衣草精油、迷迭香精油、葡萄柚精油和茶树精油以质量比为2:2:1:1组成的复方植物精油。

所述丹参酮ⅡA与所述乳化剂、助乳化剂、油相和水的质量比为0.055-0.102:27.8:18.5:7.4:46.3。

卡波姆940的质量为丹参酮ⅡA、乳化剂、助乳化剂、油相和水的总质量的0.5％-0.9％，如0.5％。

所述丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂是按照包括下述步骤的方法制备得到的：用处方量一半的水溶胀卡波姆940，得到溶胀的卡波姆940；将丹参酮ⅡA、乳化剂、助乳化剂、油相与余下的水混合，得到混合液；将所述溶胀的卡波姆940与所述混合液混合，最后加入三乙醇胺调节体系的pH值在6.5-7.5之间，得到丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂。

上述丹参酮ⅡA微乳制剂和/或丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂在治疗痤疮中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明筛选出合适的乳化剂、助乳化剂和油相及其配比，考察了搅拌时间、搅拌速度及加入药物的顺序对微乳载药量的影响，将丹参酮ⅡA制成含药效剂量的丹参酮ⅡA的微乳制剂，所述微乳制剂稳定性好。本发明通过体外渗透试验确定卡波姆940的含量，将所述丹参酮ⅡA微乳制剂制成了微乳凝胶制剂，在经皮给药的剂型中，微乳凝胶不仅在保留生物活性方面有一定的优势，而且携带方便，使用简单。初步药效学研究证明，所述参酮ⅡA微乳制剂和微乳凝胶制剂具有抑菌活性，可用于痤疮的治疗，相比与抗生素类药物，丹参酮ⅡA微乳制剂和微乳凝胶制剂不易产生耐药性。

本发明制备丹参酮ⅡA微乳凝胶，为丹参酮ⅡA的临床应用提供一条新的给药途径，同时也为痤疮治疗找到一种新的方法。

附图说明

图1为丹参酮ⅡA标准品的紫外吸收光谱图。

图2为丹参酮ⅡA的标准曲线图。

图3为不同介质中丹参酮ⅡA溶解度的柱状图。其中，a表示30wt％乙醇-生理盐水，b表示40wt％乙醇-生理盐水，c表示50wt％乙醇-生理盐水，d表示40wt％PEG-400-生理盐水，e表示50wt％PEG-400-生理盐水。

图4为不同油相中丹参酮ⅡA溶解度的柱状图。其中，OA表示油酸，EO表示油酸乙酯，IPM表示肉豆蔻酸异丙酯，LEO表示薰衣草精油，REO表示迷迭香精油，TTEO表示茶树精油，GEO表示葡萄柚精油，CEO表示复方精油。

图5为不同乳化剂中丹参酮ⅡA溶解度的柱状图。

图6为不同助乳化剂中丹参酮ⅡA溶解度的柱状图。其中，E代表乙醇，O代表1,2-丙二醇，G代表甘油。

图7A为Km＝8/2条件下形成的微乳的伪三元相图。

图7B为Km＝7/3条件下形成的微乳的伪三元相图。

图7C为Km＝6/4条件下形成的微乳的伪三元相图。

图7D为Km＝5/5条件下形成的微乳的伪三元相图。

图8为搅拌时间对微乳载药量的影响图。

图9为不同搅拌速度对微乳载药量的影响图。

图10为丹参酮ⅡA微乳(左图)和空白微乳(右图)的粒径分布图。

图11为丹参酮ⅡA微乳(左图)和空白微乳(右图)的电镜图。

图12为丹参酮ⅡA标准品HPLC(A图)、空白微乳凝胶透皮HPLC(B图)、丹参酮ⅡA微乳凝胶透皮HPLC(C图)。

图13为丹参酮ⅡA的标准曲线图。

图14为丹参酮ⅡA体外累积渗透量曲线。

图15为空白微乳凝胶(左图)和载药微乳凝胶(右图)的粒径图。

图16为空白微乳凝胶(左图)和载药微乳凝胶(右图)的透射电子显微镜图，其中，左图和右图是同一放大倍数×50000。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的仪器和材料：

Cary50紫外分光光度计(美国瓦里安)；

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦)；

LD5-10低速离心机(北京医用离心机厂)；

SHA水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)；

JA4003精密电子天平(上海良天仪器仪表有限公司)；

BSA224S精密电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)

78-1型磁力加热搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；

IKAC-MAGHS4加热磁力搅拌器(广州仪科实验室技术有限公司)；

pHS-25型数显pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；

DDS-11C电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)；

JEM-100CXⅡ型透射电子显微镜(JEOL日本电子)；

Zetasizer 3000马尔文激光散射粒径测定仪(英国马尔文公司)；

丹参酮ⅡA标准品(中国食品药品检定研究所，110766-200619)；

丹参酮ⅡA原料药(西安鸿生生物技术有限公司)；

Solutrol HS-15(德国BASF公司)；

薰衣草精油、迷迭香精油、葡萄柚精油、茶树精油(法国家美乐)；

正辛醇(分析纯，天津市兴复精细化工研究所)；

聚乙二醇400(分析纯，天津市兴复精细化工研究所)；

油酸(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；

油酸乙酯(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；

肉豆蔻酸异丙酯(分析纯，上海喜润化学工业有限公司)；

吐温80(化学纯，天津市兴复精细化工研究所)；Solutrol HS-15(德国BASF公司)；EL-35(德国BASF公司)；

无水乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，

1,2-丙二醇(分析纯，天津市风船化学试剂有限公司)，

甘油(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；

甲醇(分析纯，天津市进丰化学试剂有限公司)；

水为蒸馏水；

痤疮丙酸杆菌(广东省微生物菌种保藏中心，ATCC11817)；

金黄色葡萄球菌(由山西大学第二附属医院提供)；

MH琼脂培养基(济南百博生物技术股份有限公司，14061701)；

胰蛋白胨大豆肉汤干粉培养基(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司，1024004)；

血琼脂培养基(济南百博生物技术股份有限公司)；

注射用乳糖酸红霉素干粉(大连美罗大药厂)；

注射用青霉素钠(日本文可信)。

实施例1、丹参酮ⅡA微乳制剂的处方及其制备方法的确定

1、丹参酮ⅡA浓度测定方法的建立

1)测定波长的选择

取丹参酮ⅡA标准品2.72mg，用25mL甲醇溶解定量，以甲醇作为空白介质，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，得丹参酮ⅡA标准品的紫外吸收光谱图(图1)。

由图1可知丹参酮ⅡA在270nm处有最大吸收，故选择270nm为检测波长。

2)HPLC色谱条件

色谱柱：DiamonsilC₁₈柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇：水(85:15)，流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：270nm；进样量：10μL。

3)标准曲线和线性范围

精密量取丹参酮ⅡA标准品2.72mg，置于25mL棕色容量瓶内，加甲醇溶解并定容到刻度。得到浓度为108.8μg/mL的储备液。从储备液中依次量取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL于10mL棕色容量瓶中用甲醇定容至刻度，得一系列浓度的标准溶液。按照上述HPLC色谱条件依次进样。测得的丹参酮ⅡA标准溶液的峰面积与浓度值见表1。

以测得的峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制丹参酮ⅡA的标准曲线图(见图2)。

以测得的峰面积A与浓度C进行线性回归，得回归方程为y＝51.274x-11.646(x代表浓度，y代表峰面积)，R²＝0.9991，结果表明丹参酮ⅡA在1.088μg/mL～43.52μg/mL范围内线性关系良好。

表1、丹参酮ⅡA标准品的峰面积与浓度表(n＝3)

4)精密度实验

取同一定浓度的丹参酮ⅡA标准溶液(21.76μg/mL)，连续重复进样6次，测其峰面积，测得的实验结果见表2。

表2、精密度实验结果表(n＝6)

由表2可知，仪器的精密度良好。

5)稳定性实验

取同一标准溶液(其中，丹参酮ⅡA的浓度为10.88μg/mL)，于室温下分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h各进样一次进行检测，测得实验结果见表3。

表3、稳定性实验结果表

由表3可知，丹参酮ⅡA在0～12h范围内稳定。

6)回收率实验

配制低、中、高三个浓度的样品溶液，分别为1.90μg/mL、2.55μg/mL、5.25μg/mL，测定的结果带入回归方程得出实测浓度，与实际浓度比较，计算方法回收率，见表4。

表4、回收率实验结果表

由表4可知：丹参酮ⅡA的回收率为98.24％～100.43％。

2、丹参酮ⅡA基本理化性质的研究

1)油/水分配系数的测定

油/水分配系数(LogP)是表征药物极性及脂溶性的参数，其中P＝油相中的药物浓度/水相中的药物浓度，是影响药物经皮吸收的重要因素之一。角质层类似于脂膜，脂溶性大的药物易通过角质层；药物穿过角质层后，需分配进入活性表皮层继而被吸收，因活性表皮层是水溶性组织，脂溶性太大的药物难以分配进入活性表皮层，所以经皮给药的药物需要具有适宜的油/水分配吸系数。

选用常规的正辛醇/水体系，采用摇瓶法测定丹参酮ⅡA的LogP。

采用被蒸馏水饱和的正辛醇作为油相，蒸馏水作为水相。先取一定量的丹参酮ⅡA加入到油相中使之完全溶解，取此丹参酮ⅡA溶液3mL置于10mL EP管中，再加入3mL的水，于遮光的条件下37℃水浴中震荡72h，然后静置使之分层，然后用注射器分别吸取油相和水相，测定两相中的丹参酮ⅡA的浓度，平行测量三次取平均值。

测定结果为LogP＝LogC_油相/C_水相＝2.11，即丹参酮ⅡA在正辛醇-水体中的油水分配系数为2.11。

2)溶解度的测定

Potts等提出药物的稳态累积渗透速率受到接收液的影响，这主要是因为当选择的接收液对药物的溶解性能很差时，在扩散进行一段时间后即达饱和或趋向饱和，使透皮过程停止或减慢，从而与体内的实际情况不符，造成实验偏差。因此，体外接受介质的选择是描述药物体外经皮渗透的关键。为了更好的模拟体内过程，体外实验使用的接收液应具有接收透皮药物的能力，常用的接收液有生理盐水、林格氏液和等渗的磷酸盐缓冲液等，对于难溶性药物，可以加入乙醇、聚乙二醇、丙二醇等非生理性成分，以增加药物的溶解度。

丹参酮ⅡA的水溶性差，选择含有一定浓度乙醇、PEG-400的生理盐水为备选介质。取适量的丹参酮ⅡA于10mL离心管中，加适量的溶媒配制成过饱和溶液，将离心管置于(37±1)℃恒温水浴震荡器中平衡72h，在此过程中始终保持有固体药物存在，在规定的时间取样，用0.45μm微孔滤膜保温过滤后，用高效液相色谱仪进行测量。

图3为不同介质中丹参酮ⅡA溶解度的柱状图。其中，a表示30wt％乙醇-生理盐水，b表示40wt％乙醇-生理盐水，c表示50wt％乙醇-生理盐水，d表示40wt％PEG-400-生理盐水，e表示50wt％PEG-400-生理盐水。

由图3可知：丹参酮ⅡA在50wt％乙醇-生理盐水中的溶解度最大，因此选择50％乙醇-生理盐水为接受介质。

3、微乳成分的筛选

1)油相的选择

为了提高药物的溶解度、增大形成微乳的区域，一般选择对药物有较大溶解度且无毒无刺激性的短链油相。常用的有脂肪酸、天然植物油、结构修饰后的植物油，特别是中等链长的甘油酯类。薰衣草精油(LEO)具有消炎、抗菌、抗病毒，促进细胞再生、加速伤口愈合，减轻牛皮癣、皮炎和湿疹等皮肤病症状的药理活性；迷迭香精油(REO)具有抗菌、消炎，改善皮肤肿胀和浮肿，收敛皮肤、减少皱纹、去除斑纹等功效；葡萄柚精油GEO)具有抗菌、深层净化暗疮及充血的肌肤，紧实皮肤与组织的功效，但葡萄柚精油有一定的光敏毒性，用量不宜大；茶树精油(TTEO)具有抑菌，收敛毛细孔、清洁皮肤，改善伤口感染化脓现象的功效。

本研究结合了药剂学中常用的油相及痤疮的特点选择了以下几种油相，考察了丹参酮ⅡA在各油相中的溶解度。分别配置丹参酮ⅡA的油酸(OA)、油酸乙酯(EO)、肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、薰衣草精油(LEO)、迷迭香精油(REO)、葡萄柚精(GEO)、茶树精油(TTEO)和植物复方精油(根据各种精油的功效采用薰衣草∶迷迭香∶葡萄柚∶茶树＝2∶2∶1∶1的复方精油)的过饱和溶液，在37±0.5℃水浴震荡72h，然后4000r/min离心10min，取上清夜过0.45μm的微孔滤膜，用甲醇稀释到适宜的浓度后用HPLC测定药物的浓度，每种油相测量3次，求其平均值，结果见图4。

由图4可知，丹参酮ⅡA在OA、EO、IPM中的溶解度较小，在植物精油中的溶解度较大，综合考虑植物精油的价格、功效及毒性，初步选用复方精油(薰衣草精油、迷迭香精油、葡萄柚精油和茶树精油以质量比为2∶2∶1∶1制得的复方精油)作为油相。

2)乳化剂的选择

乳化剂是形成微乳的基本物质之一，它的主要作用是降低油水两相之间的界面张力形成界面膜，促使微乳的形成。一种好的乳化剂应该具备以下优点：①具有较强的乳化能力。乳化能力是指乳化剂能显著降低油水两相之间的表面张力，并能在乳滴周围形成牢固的乳化剂膜的能力。②有一定的生理适应能力，无毒，无刺激性，可以口服、外用或注射给药。③受各种因素的影响较小，稳定性好。常用的乳化剂的种类有阳离子型乳化剂、阴离子型乳化剂、两性离子型乳化剂、非离子型乳化剂和天然的乳化剂，常用的乳化剂有Span类、Tween类、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚氧乙烯蓖麻油化合物，単硬脂酸甘油酯类等。它的选择应该先考虑乳化剂的亲水亲油平衡值(HLB)，再考虑乳化剂的安全性。一般认为乳化剂的HLB在4～7时可形成W/O型微乳，在14～20时可形成O/W型微乳，在7～14时根据工艺条件可形成可转相的微乳。

综合外用药、痤疮的特点及乳化剂的毒性，选择Tween-80、HS-15、EL-35为备选乳化剂，考察了丹参酮ⅡA在各种乳化剂中的溶解度，实验结果如图5所示。

由图5可知：丹参酮ⅡA在不同乳化剂中的溶解度为HS-15＞Tween-80＞EL-35，因此，初步选用HS-15为乳化剂。

3)助乳化剂的选择

助乳化剂主要是指能与乳化剂合并并增加乳剂稳定性的物质。助乳化剂的乳化能力一般很弱或无乳化能力，但可以提高乳剂的黏度，或调节乳化剂的HLB值，与乳化剂形成复合凝聚膜，增强乳化膜的强度，防止乳滴合并。

常用的增加水相黏度的助乳化剂包括：羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、琼脂、阿拉伯胶等；常用的增加油相黏度的助乳化剂包括：単硬脂酸甘油酯、硬质酸、硬质醇、鲸蜡醇、蜂蜡等；常用的形成复合凝聚膜的辅助乳化剂包括：乙醇、丙二醇、正丁醇、甘油、PEG400等。

图6为不同助乳化剂中丹参酮ⅡA溶解度的柱状图。其中，E代表乙醇，O代表1,2-丙二醇，G代表甘油。

由图6可知：丹参酮ⅡA在不同助乳化剂中的溶解度为无水乙醇＞1,2-丙二醇＞甘油。且乙醇具有消炎、收缩毛孔的作用，还可以消毒去除皮肤上的部分细菌，对痤疮的治疗有一定的辅助作用，因此，初步选用乙醇为助乳化剂。

4、丹参酮ⅡA微乳处方的确定

1)乳化剂组成确定

在初步尝试时发现：单独使用Solutrol HS-15并不能使以上所选配方制成微乳，须将Tween80与Solutrol HS-15两种乳化剂混合使用才能在三角相图中产生O/W微乳区，且在同等条件下Solutrol HS-15:吐温80＝7:3时微乳效果最佳。

2)配方的初步确定

以乳化剂(Solutrol HS-15∶吐温80＝7：3)与无水乙醇的混合物、精油、蒸馏水为相图的三个顶点来绘制伪三元相图。

分别将所述乳化剂(Solutrol HS-15∶吐温80＝7：3)与乙醇以质量比(Km)值为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合，然后将混合物与油相按质量比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9在室温混合，以滴定法向各混合物中滴加水相，达到平衡后观察澄明度和流动性，判断是否形成空白微乳。

在按以上比例逐步操作的过程中发现：当Km值小于5∶5时，无论油相的比例为多少整个过程中只有粘度大的胶体和乳白色的乳液出现，没有出现O/W微乳区，所以Km值小于5：5的情况不予考虑；Km值为9∶1时乳化剂含量过大，也可以排除。直接绘制Km值为8∶2、7∶3、6∶4、5∶5的伪三元相图(见图7A，图7B，图7C，图7D)，从中找出O/W微乳区。

图7A为Km＝8/2条件下形成的微乳的伪三元相图。

图7B为Km＝7/3条件下形成的微乳的伪三元相图。

图7C为Km＝6/4条件下形成的微乳的伪三元相图。

图7D为Km＝5/5条件下形成的微乳的伪三元相图。

从图7A、图7B、图7C和图7D可知：Km＝8/2、7/3时微乳的区域相对Km＝6/4、5/5的微乳区域面积大，但乳化剂和助乳化剂的含量大。

3)O/W微乳区中确定配方范围

优选的原则：1、成乳后透明度好，黏度较小；2、微乳在室温下稳定，所选点不能在微乳区边缘，否则微乳不稳定；3、配成的微乳可以用水无限稀释。

依据以上原则初步确定配方的范围是：9/1≥Km≥1/1，9/1≥乳化剂与乙醇的混合物/油相≥8/2，水相≥40％。

4)配方优选

综合考虑混合乳化剂、乙醇、油相以及载药量进行优选。

(1)Km值的优选

混合乳化剂具有微量的细胞毒性，用量应尽量少，乙醇长时间用可使皮肤干燥,所以Km值应选中间值，实验得出：Km＝8/2、Km＝7/3、Km＝6/4为理想比例；

(2)混合乳化剂与乙醇的混合物与油相的比例优选

由于丹参酮ⅡA溶于油不溶于水，所以在其他条件允许的情况下，应考虑增加油相的比例。从上述实验结果中可知乳化剂与乙醇的混合物/油相的最小值为8/2，在相同的Km值的情况下，不断增加油的使用量，使乳化剂与乙醇的混合物/油相分别为9/1、8/1、7/1、6/1、5/1、4/1做成六个微乳样品，通过观察透明度和稳定性可发现：乳化剂与乙醇的混合物/油相＝6/1时样品的透明度和稳定性明显优于其他。

(3)水相的比例优选

①丹参酮ⅡA在水中的溶解度较小；

②由上述可知水的最少用量为40％。

在其他三相用量固定且符合以上原则的情况下，水的含量每增加1％做一个样品观察微乳中丹参酮ⅡA的稳定性。

结果显示水的含量为46％的样品在三天后没有产生沉淀，且透明度要好于其他含水量的微乳。

综合以上的实验结果优选的微乳配方有：(1)Km＝8/2，混合乳化剂与乙醇的混合物/油相＝6/1，水为46％；(2)Km＝7/3，混合乳化剂与乙醇的混合物/油相＝6/1，水为46％；(3)Km＝6/4，混合表面活性剂/油相＝6/1，水为46％。

然后制作以上三个空白微乳样品，久置后观察透明度进行比较，结果显示：配方三透明度最好。故优选的配方为：Km＝6/4，混合乳化剂与乙醇的混合物/油相＝6/1，水为46％。

5、丹参酮ⅡA微乳的制备工艺的确定

搅拌时间、搅拌速度及加入药物的顺序对微乳载药量均有一定的影响，以单因素实验来考察以上三个条件对微乳载药量的影响，然后通过正交设计实验优化制备工艺。所有试验均进行三次，取其平均值。

1)单因素试验结果

Ⅰ、搅拌时间对微乳载药量的影响

搅拌时间对微乳的载药量有一定的影响，而搅拌乳化的时间是根据油相、水相的体积比、乳化剂的种类及用量、两相的黏度等因素来确定的。因此，称取处方中各成分(薰衣草0.074g、迷迭香0.074g、葡萄柚0.037g、茶树0.037g、无水乙醇0.555g，Solutrol HS-15 0.5838g，吐温80 0.2502g，水1.389g)，在搅拌速度为250r/min、无水乙醇溶解药物的条件下，考察不同搅拌时间对微乳载药量的影响，每个时间样品为3个。不同搅拌时间对微乳载药量的影响如图8所示。

由图8可知，在一定时间内载药量随搅拌的时间延长而增加，到特定的时间点后再增加时间也不会增加载药量。

Ⅱ、搅拌速度对微乳载药量的影响

适宜的搅拌速度可以使油相、水相充分混合均匀而达到最佳的载药量。因此，称取处方中各成分(薰衣草精油0.074g、迷迭香精油0.074g、葡萄柚精油0.037g、茶树精油0.037g、无水乙醇0.555g，Solutrol HS-15 0.5838g，吐温80 0.2502g，水1.389g)，在搅拌时间为0.5h、无水乙醇溶解药物的条件下，考察不同搅拌速度对微乳载药量的影响，每个搅拌速度样品为3个。

不同搅拌速度对微乳载药量的影响如图9所示。

由图9可知，在一定搅拌速度范围内，随着搅拌速度的增大载药量增加。

Ⅲ、加药方式对微乳载药量的影响

药物加入方式对微乳载药量有一定的影响，研究3种药物加入方式，即：A、先制备空白微乳再加入药物；B、将药物溶解于无水乙醇，再加入处方中的其他成分；C、用油相、乳化剂、助乳化剂将药物溶解，再加入处方中的其他成分。

按照处方称取各成分(薰衣草精油0.074g、迷迭香精油0.074g、葡萄柚精油0.037g、茶树精油0.037g、无水乙醇0.555g，Solutrol HS-15 0.5838g、吐温80 0.2502g、水1.389g)，在搅拌时间为0.5h、搅拌速度为250r/min的条件下，考察不同加药方式对微乳载药量的影响，每种加药方式样品为3个。不同加药方式对微乳载药量的影响如表5所示。

表5、加药顺序对微乳载药量的影响表

由表5可知，不同的加药顺序微乳的载药量不同，其中采用C法制备的微乳载药量最大。

2)正交试验

为获得微乳最佳载药量的工艺条件，在单因素考察的基础上，对搅拌时间、搅拌速度、及药物的加入方式3个因素进行正交试验，以微乳中丹参酮ⅡA的含量为指标，优化制备工艺的试验因素水平表见表6，正交试验结果见表7，正交试验方差分析见表8。

表6、正交试验因素水平表

注：所述空白微乳通过将所述乳化剂、助乳化剂、油相和水混合后制得。

表7、正交试验设计方案及结果表

表8正交试验方差分析表

注：F_0.05(2，2)＝19.00，F_0.01(2，2)＝99.00

由方差分析可知，各因素对微乳载药量影响大小顺序为B＞C＞A，A因素较其他影响小一些，故以A项为误差进行方差分析，结果表明B因素具有显著性意义，C因素无显著性意义。综合以上分析及生产成本等，得丹参酮ⅡA微乳制备的最佳工艺为搅拌时间为0.5h、搅拌速度为250r/min、用空白微乳溶解药物时微乳的载药量最佳。

验证实验：按照搅拌时间为0.5h、搅拌速度为250r/min、用空白微乳溶解药物的工艺制备三批样品，测其载药量，实验结果如下：

实施例2、丹参酮ⅡA微乳性质研究

按照下述配方：丹参酮ⅡA28mg、薰衣草精油1.230g、迷迭香精油1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树精油0.61g、无水乙醇9.25g，Solutrol HS-15 9.73g、吐温80 4.17g、水23.15g。搅拌时间为0.5h、搅拌速度为250r/min、用空白微乳溶解药物来制备丹参酮ⅡA微乳(丹参酮ⅡA的质量浓度为0.54mg/mL)

1)丹参酮ⅡA微乳为均一、透明的淡红色液体。

2)丹参酮ⅡA微乳类型的判断

取相同体积的微乳两份，分别同时加入两滴苏丹红染料和亚甲基蓝染料溶液，静止放置，蓝色的扩散速度大于红色的扩散速度。

3)丹参酮ⅡA微乳pH值的测定

取10mL所述丹参酮ⅡA微乳用pHS-25pH计测得丹参酮ⅡA微乳的pH值为6.34。

4)丹参酮ⅡA微乳粒径的测定

分别取0.5mL空白微乳(组成为：薰衣草精油0.074g、迷迭香0.074g、葡萄柚精油0.037g、茶树精油0.037g、无水乙醇0.555g、Solutrol HS-15 0.5838g，吐温800.2502g和水1.389g)和所述丹参酮ⅡA微乳(丹参酮ⅡA微乳的配方为丹参酮ⅡA28mg,薰衣草精油1.230g、迷迭香精油1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树精油0.61g、无水乙醇9.25g，Solutrol HS-15 9.73g，吐温80 4.17g和水23.15g，搅拌时间为0.5h、搅拌速度为250r/min、用空白微乳溶解药物来制备)，分别加9.5mL水进行稀释，用马尔文激光粒度测其粒径，实验结果图10所示。测得空白微乳的粒径为12.15nm、载药微乳的粒径为12.78nm。

5)丹参酮ⅡA微乳的形态

采用负染色法制备样品：取0.5mL步骤4)中所述空白微乳及0.5mL步骤4)中所述丹参酮ⅡA微乳用蒸馏水稀释20倍即为待测样品，将载有Formvar支持膜的铜网置于蜡板上，在膜上加上少许待测样品，自然晾干30min，再滴加2％磷钨酸一滴，自然晾干10min，用滤纸吸走多余的液体，置于TEM-100XⅡ型透射电子显微镜下观察微乳的形态。结果如图11所示。

由图11可知，所述丹参酮ⅡA微乳及空白微乳在电镜下呈圆球形分布，且大小均匀、圆整，载药后形态无明显变化。

实施例3、丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂的处方的确定

通过体外渗透试验确定卡波姆940的含量

1)卡波姆用量的筛选

卡波姆(Carbopol)又名卡波普，是一种由丙烯酸与烯丙基蔗糖交联而成的高分子聚合物。最早由美国Goodrich公司生产，现已被美、英、中等多国的药典收入。目前被广泛的应用于皮肤、眼用、口腔、超声诊断用凝胶剂。卡波姆为白色、疏松、酸性、具吸湿性和特殊臭味的粉末，溶于水、乙醇和甘油，无毒、无刺激性，遇水可形成凝胶，平均含水量为8％，分子结构中含有56％～58％羧基基团，当介质pH<4时，羧基几乎不解离；当pH<3或pH>12时粘稠度下降，在pH6～12时最粘稠可形成均匀透明的稳定水凝胶，具有释药快、无油腻性、易涂布、易清洁、对皮肤及黏膜无刺激性的特点。

丹参酮ⅡA微乳的配方：丹参酮ⅡA0.08质量份、植物精油(薰衣草：迷迭香：葡萄柚：茶树＝2：2：1：1)7.4质量份；助乳化剂无水乙醇18.5质量份，乳化剂(SolutrolHS-15：Tween80＝7:3)27.8质量份，水46.3质量份。基于上述丹参酮ⅡA微乳的配方考察卡波姆基质浓度，前期预实验发现：当卡波姆基质浓度为＞1％时，制备时卡波姆不易溶胀均匀且凝胶黏稠度较高，不易涂布，而当浓度＜0.4％时，凝胶粘度过小，不易在皮肤表面保留，因而选择0.5％～0.9％的基质浓度通过体外释药实验进一步考察。

2)分析方法的建立

见实施例1中“丹参酮ⅡA浓度测定方法”，在此色谱条件下，卡波姆940及三乙醇胺不干扰丹参酮ⅡA检测测定(见图12)。

图12为丹参酮ⅡA标准品溶液HPLC(A图)、空白微乳凝胶透皮HPLC(B图)、丹参酮ⅡA微乳凝胶透皮HPLC(C图)。

其中，所述丹参酮ⅡA微乳凝胶的组成为：丹参酮ⅡA28mg,薰衣草精油1.230g、迷迭香精油1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树精油0.61g、无水乙醇9.25g，SolutrolHS-15 9.73g，吐温80 4.17g和水23.15g，卡波姆940 0.25g，三乙醇胺0.5g。

所述空白微乳凝胶的组成为：薰衣草精油1.230g、迷迭香精油1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树精油0.61g、无水乙醇9.25g，Solutrol HS-15 9.73g，吐温80 4.17g和水23.15g，卡波姆940 0.25g，三乙醇胺0.5g。

所述丹参酮ⅡA微乳凝胶透皮HPLC、空白微乳凝胶透皮HPLC分别为将透析袋固定于Franz立式扩散池的供给池与接受池之间，接受池内装满50％的乙醇生理盐水溶液，内含一个搅拌子，转速为200r/min，供给池内分别加入丹参酮ⅡA微乳凝胶0.250g、空白微乳凝胶0.25g将整个装置置于(37±0.5)℃的药物透皮扩散试验仪中，分别于1时将接受池内的液体全部倒出，进行HPLC检测。

所述丹参酮ⅡA标准品溶液为浓度为23.06μg/mL的丹参酮ⅡA标准品的甲醇溶液。

体外释药时药物的浓度低，因此需要对参酮ⅡA进行低浓度的线性范围进行考察。

配制浓度为0.057μg/mL、0.115μg/mL、0.230μg/mL、1.148μg/mL、2.297μg/mL的丹参酮ⅡA标准品溶液(标准品溶液的溶剂是甲醇)，按照上述色谱条件依次进样。测得的丹参酮ⅡA标准品溶液的峰面积与浓度值见表9。

以测得的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制丹参酮ⅡA的标准曲线图(见图13)。结果表明丹参酮ⅡA在0.057μg/mL～2.297μg/mL范围内线性关系良好

以测得的峰面积与浓度进行线性回归，得回归方程为y＝53.84x-0.0138，R²＝0.9992。

表9丹参酮ⅡA对照品的峰面积与浓度表(n＝3)

3)体外释药实验研究

为选择合适的基质浓度，我们采用Franz扩散池法，以透析袋为渗透的屏障膜，50％的乙醇生理盐水溶液为接收介质，在(37±0.5)℃、200r/min条件下，测定丹参酮ⅡA微乳凝胶6小时累积释放量。

将用处方量一半的水溶胀卡波姆940，得到溶胀的卡波姆940；将丹参酮ⅡA、乳化剂、助乳化剂、油相与余下的水混合，得到混合液；将所述溶胀的卡波姆940与所述混合液混合，最后加入三乙醇胺调节体系的pH值在6.5-7.5之间，得到丹参酮ⅡA微乳凝胶制剂，分别配制卡波姆含量为0.5％、0.7％、0.9％，每个样品为3个。将透析袋固定于Franz立式扩散池的供给池与接受池之间，接受池内装满50％的乙醇生理盐水溶液，内含一个搅拌子，转速为200r/min，供给池内加入丹参酮ⅡA微乳凝胶0.250g、微乳0.25mL将整个装置置于(37±0.5)℃的药物透皮扩散试验仪中，分别于0.5、1、2、3、4、5、6h时将接受池内的液体全部倒出，同时加入同体积同等温度的50％的乙醇溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱仪测定。带入标准曲线计算出药物的浓度，再分别计算药物的单位累积透过量Q_n、稳态渗透速率常数Js。

$>Q_n=\frac{V_0(C_n+\frac{V}{V_0}\underset{i=1}{\overset{n=1}{\Sigma }}\mathrm{Ci})}{A}=\frac{V_0{C}_n+V\underset{i=1}{\overset{n=1}{\Sigma }}\mathrm{Ci}}{A}$>

其中，Cn为t时间点的药物测定浓度，C_i为t时间点前一点的药物测定浓度，V₀为接受池中介质的总体积(6.5mL)，V为取样体积(6.5mL)，A为有效扩散面积(2.54cm²)。以Q对时间t作线性回归，所得直线的斜率即为稳态渗透速率常数Js(μg·cm^-2·h^-1)。

图14为丹参酮ⅡA体外累积渗透量曲线。

各体系体外渗透吸收如表10所示。

表10各体系体外渗透吸收表(n＝3)

由表10和图14可知，在相同的时间内，卡波姆的用量为0.5％时，药物的累积透过量最多，因此选用卡波姆的用量为0.5％；在相同的时间内丹参酮ⅡA微乳的累积透过量大于微乳凝胶的累积透过量。

实施例4、丹参酮ⅡA微乳凝胶性质的初步考察

丹参酮ⅡA微乳凝胶的配方为丹参酮ⅡA25mg,薰衣草精油1.230g、迷迭香1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树0.61g、无水乙醇9.25g、Solutrol HS-15 9.73g、吐温80 4.17g、水23.15g、卡波姆940 0.25g和三乙醇胺0.5g。

1)丹参酮ⅡA微乳凝胶的外观性状

本品为淡红色透明胶状物质。

2)pH值的测定

取1.0g上述丹参酮ⅡA微乳凝胶，加入10mL蒸馏水，溶解混匀，用pH计测定，测得pH值为7.08。

3)粘度的测定

选择合适的转子与转速，测得丹参酮ⅡA微乳凝胶的粘度为104.2Pa·s。

4)离心实验

取丹参酮ⅡA微乳凝胶放入离心管中，以4000r/min离心30min，凝胶无分层现象。

5)粒径的测定

取丹参酮ⅡA微乳凝胶(丹参酮ⅡA25mg,薰衣草精油1.230g、迷迭香1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树0.61g、无水乙醇9.25g、Solutrol HS-15 9.73g、吐温80 4.17g、水23.15g、卡波姆940 0.25g和三乙醇胺0.5g)，加水稀释20倍数，用Nanophox纳米粒度分析仪测定，测得载药微乳凝胶的粒径为29.94nm。

取空白微乳凝胶(薰衣草精油1.230g、迷迭香1.230g、葡萄柚精油0.61g、茶树0.61g、无水乙醇9.25g、Solutrol HS-15 9.73g、吐温80 4.17g、水23.15g、卡波姆940 0.25g和三乙醇胺0.5g)，加水稀释20倍数，用Nanophox纳米粒度分析仪测定，测得空白微乳凝胶的粒径为20.63nm。

6)丹参酮ⅡA微乳凝胶的微观形态观察

采用负染色法制备样品：分别取上述空白微乳凝胶和上述丹参酮ⅡA微乳凝胶用蒸馏水稀释20倍即为待测样品，将载有Formvar支持膜的铜网置于蜡板上，在膜上加上少许待测样品，自然晾干30min，再滴加2％磷钨酸一滴，自然晾干10min，用滤纸吸走多余的液体，置于TEM-100XⅡ型透射电子显微镜下观察微乳凝胶的形态。

图16为空白微乳凝胶(左图)和载药微乳凝胶(右图)的透射电子显微镜图。其中，左图和右图是同一放大倍数×50000。

由图16可以看出，丹参酮ⅡA微乳凝胶乳滴在电镜下呈圆球形分布，且大小均匀、圆整，载药后形态无明显变化，粒径增大。

实施例5、微乳凝胶的初步药效学研究

1)菌种复苏

用一次性无菌接种环取一定量的痤疮丙酸杆菌菌种于血琼脂培养基上，在37℃厌氧条件下培养48h；用一次性无菌接种环取一定量的金黄色葡萄球菌菌种于琼脂培养基上，在37℃需氧条件下培养24h。

2)药敏板的制备

采用二倍稀释法将青霉素钠、乳糖酸红霉素、空白微乳及微乳凝胶、载药微乳及微乳凝胶配制成一定浓度含药肉汤。

取无菌的48孔板，每孔加入肉汤0.5mL，在第1孔中加入抗菌药物原液0.5mL混匀，然后吸取0.5mL至第2孔中，混匀后吸取0.5mL至第3孔中，如此连续倍比稀释，使青霉素钠、乳糖酸红霉素为终浓度是1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL(共14个浓度梯度)的含药肉汤，最后2孔不加药液为空白对照；空白微乳及微乳凝胶、载药微乳及微乳凝胶为终浓度是512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/mL(共13个浓度梯度)的含药肉汤，最后3孔不加药液为空白对照。

3)菌悬液的制备

将37℃厌氧条件下培养48h的痤疮丙酸杆菌及37℃需氧条件下培养24h的金黄色葡萄球菌用灭菌的生理盐水校正至0.5麦氏比浊标准(约1.5×10⁸cfu/mL)，然后再用肉汤培养基稀释至1.0×10⁶cfu/mL。

4)接种

将制备好的菌液加入到药敏板中，每孔加入肉汤0.5mL，使每孔中菌的终浓度为1.0×10⁵cfu/mL，青霉素钠、乳糖酸红霉素终浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，空白微乳及空白微乳凝胶、载药微乳及载药微乳凝胶终浓度(以丹参酮ⅡA计)为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL。

5)菌株的培养

将痤疮丙酸杆菌药敏板置于厌氧袋中，放入厌氧产气袋、厌氧指示条，将袋口密封，置于37℃厌氧条件下培养48h；将金黄色葡萄球菌药敏板置于37℃需氧条件下培养24h。结果见表11所示。

表11丹参酮ⅡA对痤疮丙酸杆菌及金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)

由上表可知，对于金黄色葡萄球菌，青霉素钠的MIC为32μg/mL、乳糖红霉素的MIC为256μg/mL、丹参酮ⅡA微乳及微乳凝胶的MIC为256μg/mL；对于痤疮丙酸杆菌，青霉素钠的MIC为0.0625μg/mL、乳糖红霉素的MIC为0.5μg/mL、丹参酮ⅡA微乳及微乳凝胶的MIC为64μg/mL。

相比于青霉素钠和乳糖红霉素等抗生素类药物，虽然丹参酮ⅡA微乳及微乳凝胶的抑菌活性略低，但丹参酮ⅡA微乳及微乳凝胶较抗生素类药物不会产生耐药性。