用于治疗心血管疾病的人类G蛋白偶联受体及其调节剂

具体实施方式

定义

围绕受体展开研究的科学文献已采用许多术语来表示对受体具有各种效应的配体。为清晰及一致性起见，本专利案全文中将使用下列定义。当这些定义会与这些术语的其它定义相冲突时，应以下列定义为准：

激动剂意指当其与受体结合时可活化一胞内反应的物质(例如，配体、候选化合物)。在一些实施例中，激动剂是那些先前不知当其与受体结合时可活化胞内反应(例如可增强GTPγS与膜的结合或可提高胞内IP3含量)的物质。

本文所用氨基酸缩写词列于表A中：

            表A

拮抗剂意指可在激动剂相同位点竞争性结合受体的物质(例如，配体、候选化合物)，但其不能活化一胞内反应且因此可抑制由激动剂引发的胞内反应。拮抗剂在不存在一激动剂情况下不会减弱胞内基线反应。在一些实施例中，拮抗剂是那些先前不知当其与受体结合时可与一激动剂相竞争来抑制细胞反应的物质，例如，其中所述细胞反应是GTPγS与膜结合或胞内IP3含量的提高。

本文中抗体意欲包括单克隆抗体和多克隆抗体。抗体进一步意欲包括IgG，IgA、IgD、IgE和IgM。抗体包括全抗体(包括单链全抗体)和其抗原结合片段片段(包括Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2)。抗体可来自任何动物来源。较佳地，抗体来自人类、鼠类、兔子、山羊、豚鼠、仓鼠、骆驼、驴子、绵羊、马或鸡。较佳地，抗体结合亲和性的离解常数或Kd值低于5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M、10^-8M、5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M和10^-15M。本发明抗体可通过业内已知的任何适宜方法来制备。

生物活性片段意指一保留全长多肽或氨基酸序列的部分或全部功能性的所述全长多肽或氨基酸序列的片段。在特定实施例中，一全长GPCR多肽或氨基酸序列的活性片段保留所述全长GPCR多肽或氨基酸序列的部分或全部功能性。认为所述GPCR功能性包括但不限于配体结合、G蛋白偶联和由配体促进的G蛋白偶联。在一些实施例中，所述GPCR功能性是G蛋白偶联。在一些实施例中，所述GPCR功能性是由配体促进的G蛋白偶联。仅为阐明而非限制性目的，本文中生物活性片段意欲包括缺少N-末端甲硫氨酸的全长GPCR多肽。

候选化合物意指一可由筛选技术检验的分子(例如且不限于一化学化合物)。一候选化合物可以是(例如)一多肽、一脂质、一小分子、一抗体、一多核苷酸。

心射血分数用来意指来自一次收缩时左心室的射血分数。例如，如果左心室中有100ml血液而收缩时射出90ml，那么心射血分数就是90％。

心脏肥大用来意指心脏肌肉(心肌)的扩大。心脏肥大通常是但不总是对施加于心肌上的较高血液动力学负荷的适应性反应。

心瓣膜病用来意指心脏中一或多个瓣膜的异常结构或功能，其由致病性心脏血液动力学引起。

密码子意指由三个核苷酸(或核苷酸的等效物)构成的一组，其一般包括一偶联于磷酸根基团上的核苷[腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)]且当转译时可编码一氨基酸。

组合物意指一包括至少一种组份的物质。一“医药组合物”是一组合物的实例。

化合物功效意指一化合物抑制或刺激受体功能性的能力(即：活化/抑制一信号转导途径的能力(与受体结合亲和性相反))的量度。检测化合物功效的实例性方法于本专利案的实例部分揭示。

本文中包含、基本由……构成和由……构成根据其标准含义来界定。一示于M.P.E.P.中的界定含义优先于一业内界定含义，且一示于支配性联邦巡回法院判例法中的界定含义优先于一示于M.P.E.P中的含义。

先天性心脏缺陷意指一出生时就出现(即便在较晚时候发现)的心脏循环结构或功能方面的异常。

充血性心力衰竭意指一其中心脏丧失其有效泵血能力的疾病。随着年龄的增长充血性心力衰竭变得更为普遍。局部缺血性心脏病是充血性心力衰竭最为常见的病因，占所有病例的60至70％。静脉压增加至大于12mmHg是诊断充血性心力衰竭的主要Framingham标准之一，如同相当于循环时间大于25秒的心输出量的降低。

组成型活性受体意指一通过不同于借助受体与其配体或其一化学等效物结合的方式而稳定在一活性状态下的受体。一组成型活性受体可以是内源的或是非内源的。

组成型活化受体意指一已得到修饰使得其具组成型活性的内源受体。

组成型受体活化意指一受体在未与其配体或其一化学等效物相结合的情况下的活化。

接触意指将至少2个部分放在一起，不管是在一活体外系统中还是在一活体内系统中。

下降用来意指一可测量量的减少，且在使用时与术语“减少”、“减小”、“降低”和“减轻”同义。

超声心动描记术用来意指一使用声波测量活动物中心脏结构和功能的方法。仅为阐明而非限制，超声心动描记术可用于测定一扩大的心脏。

内源物意指一哺乳动物天然产生的物质。有关(举例说明但不限于)术语“受体”的内源物意指可由一哺乳动物(举例说明但不限于人类)天然产生者。认为内源物将包括一基因的等位基因变体以及其所编码的等位多肽变体。相反，在本文上下文中术语非内源物意指并非由一哺乳动物(举例说明但不限于人类)天然产生者。最佳地(举例说明但不限于)，将本文中一呈其内源形式时不具组成型活性但当得到改造时具有组成型活性的受体称为“组成型活化的非内源受体”。

扩大的心脏用来意指心室腔壁厚度的增加(超过基于身体大小的正常范围)。

本文中将表达载体定义为在一适于所述表达载体的宿主细胞重组体中进行经克隆DNA的转录和经转录mRNA的转译所需的DNA序列。一经适当构建的表达载体应包含一用于在宿主细胞中自主复制的复制起始点、选择标记基因、有限数量的可用限制酶切位点、可产生高拷贝数的潜力和活性启动子。以可操作方式使所述有待转录的经克隆DNA与一所述表达载体内经组成型或条件型活化的启动子相连接。仅为阐明而非限制性目的，pCMV是一表达载体。

在本文所揭示的本发明上下文中，G蛋白偶联受体融合蛋白质和GPCR融合蛋白质分别意指一非内源蛋白质，其包含与至少一个G蛋白(最佳地，是所述G蛋白的α亚基(此亚基是可结合GTP的亚基))融合的组成型活性内源GPCR或组成型活化非内源GPCR，较佳地，其中所述G蛋白与内源GPCR可天然偶联的G蛋白是同一类型。举例说明但不限于，在一内源状态下，如果G蛋白“Gsα”是与GPCR偶联的主要G蛋白，那么，以一特异性GPCR为基础的GPCR融合蛋白质会就是一包含与Gsα融合的GPCR的非内源蛋白质；在一些情况下(如下文所示)，一非主要G蛋白也可与GPCR融合。所述G蛋白可直接融合到组成型活性GPCR的C末端或可在二者间存在间隔子。

血液动力学的应理解为与整个循环系统的血液运动和其中所涉及的力相关。仅为阐明而非限制性目的，可导致对心肌需求增加的持续性血液动力学干扰会导致心脏肥大。或者，心肌细胞内的基因异常可导致与血液动力学无关的心脏肥大。仅为阐明而非限制性目的，遗传疾病(诸如肌节蛋白突变)会导致家族性肥大性心肌病[参见例如，Bashyam等人，J Hum Genet(2003)48：55-64]。

宿主细胞意指一能够将一表达载体纳入其中的细胞。所述纳入可贯穿发生于(仅为阐明而非限制)转化、转染或感染过程中。在一些实施例中，所述宿主细胞是真核细胞，更佳地，是哺乳动物细胞，且更佳地，选自由293、293T、CHO和COS-7细胞组成的群组。在一些实施例中，所述宿主细胞是心肌细胞。在其它实施例中，所述宿主细胞是真核细胞，更佳地，是载黑色素细胞。

肥大性心肌病用来意指由于构成心肌的细胞大小增加而引起的心脏扩大。

如本文所用的有预防或治疗需要意指由一护理者[例如，在人类的情形下为医师、护士、职业护理师等等；在动物(包括非人类哺乳动物)的情形下为兽医]做出的下列判断：一个体或动物需要或将受益于治疗。该判断是基于护理者专业知识范围内的多种因素且包括对下述情况的了解作出的：所述个体或动物是因为一可由本发明化合物治疗的病症而生病或将要生病。

静脉压增加用来意指由于血液集中在静脉系统(静脉)中(由循环系统削弱而引起)而在其中形成的血压升高。

本文所用个体意指任何动物，包括哺乳动物，较佳是小鼠、大鼠、其它啮齿类动物、兔子、狗、猫、猪、牛、羊、马或灵长类动物，但最佳是人类。

抑制与术语“反应”有关时意指一反应在一化合物存在时与所述化合物不存在时相比有所降低或受到阻碍。

反向激动剂意指可结合内源形式或组成型活化形式的受体以降低所述受体的胞内基线反应(此现象可在激动剂不存在时观测到)的物质(例如，配体、候选化合物)。

局部缺血性心脏病意指一由心脏组织缺氧而引起的病症，其中心肌受到影响且心脏不能将血液正常泵出。局部缺血性心脏病是美国最常见的心肌病。

经分离的意指物质可离开其原始存在的环境(例如，天然环境，如果其是天然存在的)。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是，如果与天然系统中一些或全部共存物质分离开来，那么同样的多核苷酸或DNA或多肽就是分离的。此一多核苷酸可以是一载体的一部分及/或此一多核苷酸或多肽可以是一组合物的一部分，但其仍旧是分离的，因为所述载体或组合物并不是其天然环境的一部分。

配体意指一可特异性结合一GPCR的分子。配体可以是(例如)一多肽、一脂质、一小分子、一抗体。内源配体是一种对于天然GPCR为一内源天然配体的配体。配体可以是一GPCR“拮抗剂”、“激动剂”、“部分激动剂”或“反向激动剂”，及诸如此类。

如本文所用术语调节或改进拟意指一特定活性、功能或分子的数量、品质或效应的增加或降低。

心肌梗塞意指一定区域的心肌由于所述区域供氧不足而导致的损伤或死亡。心肌梗塞常由血凝块阻塞一冠状动脉(将血液和氧气运至心肌的血管)而引起。血凝块会妨碍血液和氧气到达心脏的所述区域，从而引起所述区域心脏细胞的死亡。

心肌炎用来指由细菌、病毒或未知病因引起的心肌炎症。

孤儿受体意指一内源受体，其中所述内源受体的特异性内源配体仍未得到鉴定或未知。

部分激动剂意指当其结合受体时可活化胞内反应但在程度/范围上不及完全激动剂的物质(例如，配体、候选化合物)。

药剂意指可用作一医药组合物中一活性成份的化合物。

医药组合物意指一包含至少一种活性成份的组合物，藉此所述组合物适于研究在哺乳动物(举例说明但不限于人类)中产生的特定效果。所属技术领域的技术人员应理解并了解适用于测定一活性成份是否具有符合技术人员需要的期望效果的技术。

多核苷酸意指具有不只一个核苷酸呈单链或双链形式的RNA、DNA或RNA/DNA杂交序列。本发明多核苷酸可通过任一已知方法(包括合成、重组、体内产生和其一组合)以及使用业内已知的任何纯化方法来制备。

多肽意指一氨基酸聚合物，而不考虑所述聚合物的长度。因此，肽、寡肽和蛋白质皆包含在多肽定义中。本术语也不限定或排除多肽表达后修饰。例如，术语多肽明确涵盖包括共价连接物(糖基、乙酰基、磷酸基、脂基，及诸如此类)的多肽。

心肌梗塞后重塑.归因于心肌梗塞的心肌组织损耗会造成施加于心室的持续性过度血液动力学负担。心室肥大是心脏用来补偿增加负荷的主要机制之一。然而，这种维持心脏面对血液动力学超负荷时性能的适应能力是有限的，当长期保持这种状态时将变成不适应。伴随着扩大的心室日益扩张且收缩功能日益减弱，适应性肥大表型逐渐转变成明显的心脏衰竭。对心脏中心肌梗塞的适应性和不适应性反应的自然经历被称为“重塑”。

本文用引物表示一特异性寡核苷酸序列，其互补于一目标核苷酸序列并可用来杂交所述目标核苷酸序列。引物可作为由DNA聚合酶、RNA聚合酶或反转录酶催化的核苷酸聚合的起始点。

本文中用纯化的来描述已经同其它化合物(包括但不限于其它核酸、碳水化合物、脂质和蛋白质(诸如用于多核苷酸合成的酶))分离开来的本发明多核苷酸或多核苷酸载体。当一样品的至少约50％、至少约60％、至少约75％或至少约90％包含单一多核苷酸序列时该多核苷酸是实质纯的。一实质纯的多核苷酸通常占一核酸样品的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％(重量/重量)。多核苷酸纯度或同质性可由业内熟知的多种方法指示，诸如对一样品实施琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据对凝胶的染色来肉眼观察单个多核苷酸条带。

同样，本文中术语纯化的可用于描述已经同其它化合物(包括但不限于核酸、脂质、碳水化合物和其它蛋白质)分离开来的本发明多肽。在一些较佳实施例中，当一样品多肽分子的至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％具有单一氨基酸序列时，多肽是实质纯的。在一些较佳实施例中，一实质纯的多肽通常占一蛋白质样品的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％(重量/重量)。多肽纯度或同质性可由业内熟知的多种方法指示，诸如对一样品实施琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据对凝胶的染色来肉眼观察单个多肽条带。

同样，本文中术语纯化的可用于描述一由表达载体转化、转染或感染的宿主细胞群体。在一些较佳实施例中，所述群体占所述经转化、转染或感染的宿主细胞的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。

同样，本文中术语纯化的可用于描述一表达重组多肽的宿主细胞群体。在一些较佳实施例中，所述群体占所述表达所述重组多肽的宿主细胞的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。

此外，本文所用术语纯化的并不需要绝对纯化，而是拟作为一相对定义。

受体功能性意指一受体接收刺激并调节细胞效应(包括但不限于调节基因转录、调节离子流入或流出、实现催化反应及/或通过G-蛋白调节活性)的正常作用。

心输出量降低用来指衰竭心脏泵血能力的降低，以致于心脏心室每次收缩泵入循环系统(动脉)的血液减少。

第二信使意指由于受体活化而产生的胞内反应。第二信使可包括(例如)三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)、环化AMP(cAMP)、环化GMP(cGMP)、MAP激酶活性、MAPK/ERK激酶激酶-1(MEKK1)活性和Ca2+。可通过测量第二信使反应来测定受体活化。此外，可通过测量第二信使反应来鉴定候选化合物(包括(例如)反向激动剂、部分激动剂、激动剂和拮抗剂)。

信噪比意指响应活化、放大或刺激而产生的信号，其中所述信号超过背景噪音或超过响应未活化、未放大或未刺激的基线水平。

小分子用来指具有低于约10,000克/摩尔分子量的化合物，包括肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、有机化合物或无机化合物(即，包括杂有机化合物或有机金属化合物)和盐、酯和其医药上可接受的其它形式。在某些较佳实施例中，小分子是具有低于约5,000克/摩尔分子量的有机或无机化合物。在某些较佳实施例中，小分子是具有低于约1,000克/摩尔分子量的有机或无机化合物。在某些较佳实施例中，小分子是具有低于约500克/摩尔分子量的有机或无机化合物。

间隔子意指位于一基因(例如，感兴趣的GPCR)最后一个密码子或最后一个氨基酸之后但在感兴趣G蛋白的起始密码子或起始区域之前的一定数量的转译氨基酸，其中将所述一定数量的转译氨基酸置于感兴趣G蛋白起始区域的框内。转译出的氨基酸数量可以是1、2、3、4等等，且最多为12。

刺激与术语“反应”有关时意指化合物存在时相对于化合物不存在时反应有所增加。

受试者意指灵长类动物，包括但不限于人类和狒狒，以及宠物动物(诸如狗和猫)、实验室动物(诸如大鼠和小鼠)和农场动物(诸如马、羊和牛)。

持续性心脏后负荷。后负荷是血流从心脏流出进入循环系统时所受阻力的量度。高的系统血压或主动脉异常狭窄(缩窄)皆会增加施加于心脏的后负荷。

本文所用治疗有效量意指可在组织、系统、动物、个体或人类中引起为研究者、兽医、内科医生或其它临床医生所寻求的生物或药物反应的活性化合物或药剂的量，所述反应包括下面的一或多个：

(1)预防疾病；例如，预防一可能易患一疾病、病症或失调症但还未经历或显示所述疾病病状或症状的个体中的所述疾病、病症或失调症；

(2)抑制疾病；例如，抑制一正经历或显示一疾病、病症或失调症病状或症状的个体的所述疾病、病症或失调症(即，阻止病状及/或症状的进一步发展)，和

(3)改善疾病；例如，改善一正经历或显示一疾病、病症或失调症病状或症状的个体的所述疾病、病症或失调症(即，逆转病状及/或症状)。

本文所用术语变体是一分别不同于一参照多核苷酸或多肽但保留基本性质的多核苷酸或多肽。一典型多核苷酸变体在核苷酸序列上不同于另一参照多核苷酸。变体核苷酸序列的变化可能会或可能不会改变由参照多核苷酸编码的多肽氨基酸序列。一典型多肽变体在氨基酸序列上不同于另一参照多肽。可通过一或多个取代、添加、删除的任何组合而使变体和参照多肽在氨基酸序列上有所不同。多核苷酸变体或多肽变体可以是天然存在的变体，诸如等位基因变体，或其可以是一未知可天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在变体可通过诱变技术或通过直接合成来产生。

心室腔体积用来指心脏左或右心室腔内部尺寸的量度。在衰竭心脏中，存在心室腔的扩大。

A.介绍

所示下面各部分的顺序仅起说明效用，而并非意欲也不应将其理解成对本文揭示内容或随附权利要求的限制。

B.受体表达

1.感兴趣的GPCR多肽

一本发明RUP40 GPCR可包括一自下列组成群组选出的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1至990；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346；

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸954至997；

(e)由一编码一内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列，所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对一人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得；

(f)SEQ ID NO：4的氨基酸1至1,349；

(g)SEQ ID NO：4的氨基酸1至993；

(h)SEQ ID NO：4的氨基酸994至1,349；

(i)SEQ ID NO：4的氨基酸954至1,000；和

(j)SEQ ID NO：6的氨基酸1至141。

一本发明RUP40 GPCR可包括一所述SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的生物活性片段。一本发明RUP40 GPCR可包括一具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列或具有所述SEQ ID NO：2或4氨基酸序列生物活性片段的组成型活化突变体。

在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2或4的RUP40 GPCR的生物活性片段选自由式“n1-n2”至“c”提供的群组，其代表一组片段，所述片段具有一自全长RUP40 GPCR的氨基酸区间“n1至n2”内选出的N-末端氨基酸和一固定在全长RUP40 GPCR的氨基酸“c”上的C-末端氨基酸。在一些实施例中，“n1”是全长RUP40 GPCR的第2位氨基酸，“n2”是预测的GPS结构域内蛋白酶切近似位点的C-末端氨基酸，且“c”是全长RUP40 GPCR的C-末端氨基酸。在一些实施例中，对于具有SEQ ID NO：2的RUP40 GPCR，n1＝2，n2＝991，且c＝1,346。在一些实施例中，对于具有SEQ ID NO：4的RUP40 GPCR，n1＝2，n2＝994，且c＝1,349。在一些实施例中，所述RUP40 GPCR的生物活性片段选自SEQ ID NO：2的氨基酸2至1,346、22至1,346、227至1,346和991至1,346，其中认为氨基酸22是预测的信号肽切割近似位点，认为氨基酸227是预测的SEA组件内蛋白酶切近似位点，且认为氨基酸991是预测的GPS结构域内蛋白酶切近似位点。在一些实施例中，所述RUP40 GPCR的生物活性片段选自SEQ IDNO：4的氨基酸2至1,349、25至1,349、224至1,349和994至1,349，其中认为氨基酸25是预测的信号肽切割近似位点，认为氨基酸224是预测的SEA组件内蛋白酶切近似位点，且认为氨基酸994是预测的GPS结构域内蛋白酶切近似位点。在一些实施例中，对于具有SEQ ID NO：2的RUP40 GPCR，n1＝22，n2＝991，且c＝1,346。在一些实施例中，对于具有SEQ ID NO：2的RUP40 GPCR，n1＝227，n2＝991，且c＝1,346。在一些实施例中，对于具有SEQ ID NO：4的RUP40 GPCR，n1＝25，n2＝994，且c＝1,349。在一些实施例中，对于具有SEQ ID NO：4的RUP40 GPCR，n1＝224，n2＝994，且c＝1,349。

制备GPCR的组成型活化突变体的方法为所属技术领域的技术人员所熟知(参见例如，于1998年10月22日以WO 98/46995公开的PCT申请案第PCT/US98/07496号和美国专利第6,555,339号；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中)。

具有SEQ ID NO：2、4或6的RUP40 GPCR的等位基因变体皆欲涵盖于本发明范围中。仅为阐明而非限制性目的，一在SEQ ID NO：2的氨基酸位置604处包含一苏氨酸代替甲硫氨酸的取代、在SEQ ID NO：2的氨基酸位置801处包含一异亮氨酸代替缬氨酸的取代，或在SEQ ID NO：2的氨基酸位置856处包含一甲硫氨酸代替苏氨酸的取代的具有SEQ ID NO：2的RUP40 GPCR的等位基因变体皆欲涵盖于本发明范围中。在某些实施例中，一可用于标题方法的GPCR可包括一所述SEQ ID NO：2氨基酸序列的等位基因变体。在某些实施例中，一所述SEQ ID NO：2氨基酸序列的等位基因变体由一内源RUP40 GPCR核苷酸序列编码，所述核苷酸序列可通过使用特异性引物SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8对一人类DNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得。在一些实施例中，一所述SEQ ID NO：2氨基酸序列的等位基因变体由一内源RUP40 GPCR核苷酸序列编码，所述核苷酸酸序列可通过使用一包含SEQ ID NO：7的特异性引物和一包含SEQ ID NO：8的特异性引物对一人类DNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得。

具有SEQ ID NO：2的人类RUP40 GPCR的哺乳动物直向同源物皆欲涵盖于本发明范围中。在一些实施例中，所述哺乳动物直向同源物包括小鼠RUP40、大鼠RUP40、猪RUP40和非人类灵长类动物RUP40。

所述RUP40 GPCR的变体皆欲涵盖于本发明范围中，所述变体包含一与自下列组成的群组选出的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％一致性的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1至990；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346；

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸954至997；

(e)由一编码一内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列，所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ IDNO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得；

(f)SEQ ID NO：4的氨基酸1至1,349；

(g)SEQ ID NO：4的氨基酸1至993；

(h)SEQ ID NO：4的氨基酸994至1,349；

(i)SEQ ID NO：4的氨基酸954至1,000；和

(j)SEQ ID NO：6的氨基酸1至141。百分比一致性可按惯例使用已知计算机程序确定。

在某些实施例中，一可在标题方法中使用的RUP40 GPCR可包含一同SEQ IDNO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％的一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ IDNO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约95％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约96％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约97％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约98％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ IDNO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.1％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.2％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2氨基酸1至1346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ IDNO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.3％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.4％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.5％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.6％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.7％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.8％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或同由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)具有至少约99.9％一致性的氨基酸序列。一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346具有至少(例如)95％“一致性”的氨基酸序列意指，除去其可能在SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346或由编码内源RUP40受体的核酸编码的氨基酸序列(所述核酸序列可通过使用一包含示于SEQ ID NO：7中的核苷酸序列的特异性引物和一包含示于SEQ ID NO：8中的核苷酸序列的特异性引物对人类cDNA样品实施聚合酶链反应(PCR)来获得)中的每100个氨基酸中包括至多5个氨基酸改变外，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346相同。因此，为获得(例如)一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346具有至少95％一致性的氨基酸序列，所述序列可具有至多在SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346中占5％(100个中有5个)的氨基酸残基插入、删除或另一氨基酸取代。这些改变可出现在氨基末端或羧基末端或所述末端位置之间的任意处，或可个别分散于所述序列中的残基中或所述序列中的一或多个连续基团中。

在某些实施例中，一可在标题方法中使用的RUP40 GPCR可包含一同SEQ IDNO：2的氨基酸991至1,346具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约95％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约96％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约97％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约98％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.1％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.2％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.3％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.4％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.5％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.6％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.7％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.8％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，一可在标题方法中使用的GPCR可包含一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少约99.9％一致性的氨基酸序列。一同SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346具有至少(例如)95％“一致性”的氨基酸序列意指，除去其可能在SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346的氨基酸中的每100个氨基酸中包括至多5个氨基酸改变外，所述氨基酸序列同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346相同。因此，为获得一同SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346具有至少95％一致性的氨基酸序列，所述序列可具有至多在SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346中占5％(100个中有5个)的氨基酸残基插入、删除或另一氨基酸取代。这些改变可出现在氨基末端或羧基末端或所述末端位置间的任意处，或可个别分散于所述序列中的残基中或所述序列中的一或多个连续基团中。

在一些实施例中，一可在标题方法中使用的RUP40 GPCR包含一G蛋白偶联受体的氨基酸序列，所述氨基酸序列由一可在严谨性条件下与结合于滤膜上的DNA(具有示于SEQ ID NO：1中的序列)杂交的多核苷酸序列的互补序列编码。杂交技术为所属技术领域的技术人员所熟知。较佳严谨性杂交条件包括在一包含下列各物的溶液中于42℃下过夜培育：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性经剪切的鲑鱼精DNA；然后用0.1至0.2×SSC在约65℃下洗涤滤膜。

a.序列一致性

在一些实施例中，用于确定两个氨基酸序列间百分比一致性的方法是一种使用基于Brutlag等人的演算法的FASTDB计算机程序来确定一查询序列(例如，SEQ IDNO：2的氨基酸序列)和一拟询问序列之间的最优总体匹配(亦称为整体序列比对)的方法[Comp App Biosci(1990)6：237-245；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。在一序列比对中，查询和询问序列二者皆是氨基酸序列。所述整体序列比对的结果以百分比一致性表示。一FASTDB氨基酸比对中使用的较佳参数是：矩阵＝PAM 0，k-tuple(短序列片断)＝2，失配罚分＝1，连接罚分＝20，随机区组＝25，长度＝0，截断分值＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗口大小＝247或询问氨基酸序列的长度(以较短者为准)。

如果询问序列由于N或C-末端删除而非由于内部删除而短于查询序列，那么，以百分比一致性表示的结果就必须经人工校正，因为当计算整体百分比一致性时FASTDB程序并未考虑询问序列的N-和C-末端截短。在N和C-末端截短的询问序列相对于查询序列的百分比一致性需通过计算查询序列中位于询问序列N-和C-末端的与相应询问序列残基不相匹配/对准的残基数占查询序列全部碱基的百分比来校正。一残基是否匹配/对准需由FASTDB序列比对结果确定。然后自百分比一致性(由上述FASTDB程序使用规定参数计算得出)中减去此百分比以得到一最终的百分比一致性得分。此最终的百分比一致性得分是用于本发明目的的得分。就人工调整百分比一致性得分的目的而言仅仅需要考虑与查询序列不相匹配/对准的询问序列N-和C-末端残基。即仅考虑询问序列最远的N-和C-末端残基之外的查询氨基酸残基。

例如，使一90个氨基酸残基的询问序列与一100个残基的查询序列相比对以确定百分比一致性。删除出现在询问序列的N-末端，因此，FASTDB比对不与N-末端前面几个残基相匹配/对准。10个不配对残基占序列的10％(不匹配N-和C-末端残基数/查询序列中残基总数)，所以需从由FASTDB程序计算的百分比一致性得分中减去10％。如果其余90个残基完全匹配，那么，最终的百分比一致性就是90％。

在另一实例中，使一90个残基的询问序列与一100个残基的查询序列相比较。这次删除位于内部，所以在询问序列的N-或C-末端不存在与查询序列不相匹配/对准的残基。在此情况下，不需对FASTDB计算的百分比一致性进行人工校正。再一次，仅需对不与查询序列相匹配/对准的目标序列N-和C-末端之外的残基位置(如FASTDB比对中显示)进行人工校正。对于本发明目的而言不需进行其它校正。

b.融合蛋白质

在某些实施例中，一感兴趣的多肽是一融合蛋白质，并可包含(例如)一亲和性标签结构域或一报告子结构域。适宜亲和性标签包括任一可特异性结合另一部分(通常为另一多肽，最常为一抗体)的氨基酸序列。适宜亲和性标签包括表位标签，例如，V5标签、FLAG标签、HA标签(来自流感病毒血凝素)、myc标签，及诸如此类，其为业内已知。适宜亲和性标签也包括与其结合的底物为已知的结构域(例如，HIS、GST和MBP标签，如业内所知)及来自其它蛋白质(可使用其特异性结合伙伴，例如，抗体，特别是单克隆抗体)的结构域。适宜亲和性标签也包括任一蛋白质-蛋白质相互作用结构域，诸如IgG Fc区，其可特异性结合一适宜结合伙伴(例如IgG Fc受体)并可用其来检测。本发明明确涵盖，此一融合蛋白质可包含一与一GPCR(其N-末端甲硫氨酸残基或被删除或由一替代氨基酸所取代)融合在一个框内的异源N-末端结构域(例如，一表位标签)。

适宜报告子结构域包括任何可报告一多肽存在的结构域。虽然了解可用一亲和性标签通过使用(例如)一可与所述标签特异性结合的经标记抗体来报告一多肽的存在，但更为常用的是发光报告子结构域。适宜发光报告子结构域包括萤光素酶(来自，例如萤火虫、Vargula、海参(Renilla reniformis)或Renilla muelleri)或其发光变体。其它适宜报告子结构域包括荧光蛋白(例如来自水母、珊瑚虫和其它腔肠类动物，诸如来自水母(Aequoria)、海肾(Renilla)、Ptilosarcus海笔、Stylatula海笔物种)或其发光变体。这些报告蛋白的发光变体为业内所熟知并可以是发光器、调光器，或与一天然报告蛋白相比具有不同的激发及/或发射光谱。例如，一些变体经改造后使得其不再呈现绿色，而可呈现蓝色、青色、黄色、增强的黄红色(分别命名为BFP、CFP、YFPeYFP和RFP)或具有其它发射光谱，其为业内已知。其它适宜报告子结构域包括可通过生物化学或颜色变化报告一多肽存在的结构域，诸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和可分泌的胚胎碱性磷酸酶。

同时为业内已知的是，亲和性标签或报告子结构域可存在于一感兴趣多肽的任一位置上。然而，在大部分实施例中，其存在于一感兴趣多肽C-或N-末端。

2.可编码感兴趣GPCR多肽的核酸

由于已知用于核酸操作的遗传密码和重组技术，且感兴趣的GPCR多肽的氨基酸序列已在上文阐述，因此对于编码一感兴趣GPCR多肽的核酸的设计和产生可为所属技术领域的技术人员所熟知。在某些实施例中使用标准重组DNA技术方法(Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。例如，可使用任一或多种重组方法(本文中不需再予以阐述)的组合从GPCR编码序列文库中分离GPCR编码序列。也可使用标准重组DNA技术对所述编码一蛋白质的核酸序列实施后续的核苷酸取代、删除及/或添加。

例如，可使用定点诱变和亚克隆在一编码一感兴趣多肽的多核苷酸中引入/删除/取代核酸残基。在其它实施例中，可使用PCR。编码一感兴趣多肽的核酸也可通过化学合成完全自寡核苷酸来制备(例如，Cello等人，Science(2002)297：1016-8)。

在一些实施例中，可对编码感兴趣多肽的核酸密码子进行最优化以使其能够在特定物种(特别是一哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、非人类灵长类动物或人类等物种)细胞中表达。在一些实施例中，可对编码感兴趣多肽的核酸密码子进行最优化以使其能够在特定物种(尤其是两栖动物种类)细胞中表达。

a.载体

本发明进一步提供包含标题核酸的载体(也称作“构筑体”)。在许多本发明实施例中，以可操作方式将标题核酸序列连至一表达控制序列(包括，例如一启动子)上之后，所述标题核酸序列就可在一宿主中表达。通常也可将标题核酸置于一可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主细胞中复制的表达载体中。通常，表达载体会含有选择标记基因(例如，四环素或新霉素基因)以使得能够检测那些由所需DNA序列转化的细胞(参见例如，美国专利第4,704,362号，其以引用方式并入本文中)。载体(包括单个或两个表达序列盒载体)为业内所熟知(Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。适宜载体包括病毒载体、质粒、粘粒、人工染色体(人类人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体等等)、微型染色体，及诸如此类。可采用逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒载体。

对于所属技术领域的技术人员可采用多种表达载体来达成在一细胞中产生感兴趣多肽的目的。一适宜载体是pCMV，其可用于某些实施例中。这种载体根据微生物保存专利程序的国际认可的布达佩斯协议(Budapest Treaty for the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)条款于1998年10月13日存入美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209USA)。由ATCC测试DNA并确定其具有活力。ATCC已对pCMV指定了下列保存号：ATCC#203351。

标题核酸通常包含编码一标题感兴趣多肽的单个开放阅读框，然而，在某些实施例中，由于表达所述感兴趣多肽的宿主细胞可能是一真核细胞(例如，哺乳动物细胞，诸如人类细胞)，因此开放阅读框可能由内含子中断。标题核酸通常是转录单元的一部分，所述转录单元除包含标题核酸外还可包含3′和5′非转译区(UTR)(岂可负责RNA稳定性、转译效率等等)。所述标题核酸也可以是一表达序列盒的一部分。所述表达序列盒除包含标题核酸外还可包含一可指导感兴趣多肽转录和表达的启动子和一转录终止子。

真核启动子可以是任一可在一真核宿主细胞中行驶功能的启动子，包括病毒启动子和源自真核基因的启动子。实例性真核启动子包括但不限于下列启动子：小鼠金属硫蛋白I基因序列启动子(Hamer等人，J.Mol.Appl.Gen.，1：273-288，1982)、疱疹病毒TK启动子(McKnight，Cell 31：355-365，1982)、SV40早期启动子(Benoist等人，Nature(London)290：304-310，1981)、酵母gall基因序列启动子(Johnston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6971-6975，1982)；Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：5951-59SS，1984)、CMV启动子、EF-1启动子、蜕皮激素反应性启动子)、四环素反应性启动子，及诸如此类。尤其感兴趣的是病毒启动子，原因在于其通常是特别强的启动子。在某些实施例中，所用启动子是一目标病源体的启动子。选择用于本发明的启动子应能够在拟将其导入的细胞类型(及/或动物)中行使功能。在某些实施例中，启动子是一CMV启动子。

在某些实施例中，标题载体也可提供用于表达选择标记基因。适宜载体和选择标记基因为业内所熟知并在下列出版物中论述：Ausubel等人，(Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995)和Sambrook等人，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.)。已将多种不同基因用作选择性标记基因，且主要根据方便性来选择在标题载体中用作一选择标记物的特定基因。已知的选择标记基因包括：胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因、CAD、腺苷脱胺酶基因、天冬酰胺合成酶基因、抗生素抗性基因，例如，tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(氨基糖苷类磷酸转移酶基因)、潮霉素B磷酸转移酶基因，及诸如此类。

如上所述，感兴趣多肽可以是包含一亲和性结构域及/或一报告子结构域的融合蛋白质。用于使报告子或标签与一GPCR之间(例如，在GPCR的C-或N-末端)进行融合的方法为所属技术领域的技术人员所熟知(例如McLean等人，Mol.Pharma.MolPharmacol.199956：1182-91；Ramsay等人，Br.J.Pharmacology，2001，315-323)，而本文不再作进一步阐述。本发明明确涵盖，此一融合蛋白质可包含一与一GPCR(其N-末端甲硫氨酸残基或被删除或由一替代氨基酸所取代)融合在同一框内的异源N-末端结构域(例如，一表位标签)。应了解，一感兴趣多肽可首先由一天然多肽制备且随后以可操作方式与一如上所述的适宜报告子/标签相连接。

标题核酸也可包含限制酶切位点、多克隆位点、引物结合位点、可连接末端、重组位点，等等，通常是为了简化对编码一感兴趣多肽的核酸的构建。

b.宿主细胞

本发明进一步提供包含一载体(包含一标题核酸)的宿主细胞。适宜宿主细胞包括原核细胞(例如，细菌细胞(例如大肠杆菌)、以及真核细胞(例如动物细胞(例如昆虫、哺乳动物、鱼、两栖动物、鸟或爬行动物细胞)、植物细胞(例如玉米或拟南芥细胞)或真菌细胞(例如酿酒酵母细胞))。在某些实施例中，任何适用于表达一感兴趣多肽编码核酸的细胞皆可作为一宿主细胞。通常，使用一动物宿主细胞系，其实例如下：猴肾细胞(COS细胞)、由SV40转化的猴肾CVI细胞(COS-7，ATCCCRL 165 1)；人类胚肾细胞(HEK-293[“293”]，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；HEK-293T[“293T”]细胞；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216，(1980)；叙利亚黄金仓鼠细胞MCB3901(ATCC CRL-9595)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci 383：44-68(1982))；NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)和小鼠L细胞(ATCCCCL-1)。在某些实施例中，使用载黑色素细胞。载黑色素细胞是在低等脊椎动物中发现的皮肤细胞。相关材料和方法遵循美国专利第5,462,856号和美国专利第6,051,386号所揭示的内容。这些专利揭示内容的全文以引用方式并入本文中。所属技术领域的技术人员会易知其它细胞系，且大量细胞系可自美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209获得。

B.候选化合物的筛选

1.GPCR的一般性筛选分析技术

当一G蛋白受体活化时，其可结合一G蛋白(例如，Gq、Gs、Gi、Go、Gz)并刺激GTP与G蛋白的结合。G蛋白因而可担当一鸟苷三磷酸酶并将GTP缓慢水解成GDP，藉此所述受体在正常条件下会失去活性。然而，活化受体可继续将GDP转变成GTP。一不可水解的GTP类似物([³⁵S]GTPγS)可用于监测对可表达活化受体的膜的结合的增强。据报导，[³⁵S]GTPγS可用于监测存在和不存在配体情况下G蛋白对所述膜的偶联。在其它实例中，Traynor和Nahorski在1995年报导了为所属技术领域的技术人员所熟知且可供其使用的一种此监测的实例。所述分析系统的较佳用途是用于候选化合物的初期筛选，因为所述系统对所有G蛋白偶联受体通用，而与可与受体胞内结构域相互作用的特定G蛋白无关。

2.GPCR的特异性筛选分析技术

一旦使用“一般性”G蛋白偶联受体分析(即，选择出是激动剂、反向激动剂或拮抗剂的化合物的分析)对候选化合物加以鉴定，那么较佳的是可在一些实施例中进行进一步筛选以确认所述化合物可在受体位点相互作用。例如，由“一般性”分析鉴定的化合物不一定与所述受体结合，而是代之以仅仅“不偶联”来自胞内结构域的G蛋白。

在替代实施例中，可通过使用“特异性”G蛋白偶联受体分析的初期筛选来鉴定候选化合物，如下文所提供内容(仅为阐明而非限制)。

a.Gs、Gi、Go和Gz

Gs可刺激酶——腺苷酰环化酶。另一方面，Gi(和Gz和Go)可抑制腺苷酰环化酶。腺苷酰环化酶可催化ATP向cAMP的转化；因此，可偶联Gs蛋白的活化的GPCR与cAMP胞内含量增加有关。另一方面，可偶联Gi(或Gz、Go)蛋白的活化的GPCR与胞内cAMP含量降低有关。一般参见，“Indirect Mechanisms of SynapticTransmission，”第8章，From Neuron To Brain(第3版)Nichols.J.G.等人编辑，SinauerAssociates，Inc.(1992)。因此，检测cAMP的分析可用来确定一候选化合物是否是(例如)一所述受体的反向激动剂(即，此一化合物会降低cAMP含量)。可使用多种用于测量cAMP的业内已知方法；在一些实施例中，较佳方法依赖于抗-cAMP抗体在ELISA方法中的应用。可采用的另一类分析是一全细胞第二信使报告系统分析。基因上的启动子可驱动由一特定基因编码的蛋白质的表达。环化AMP可通过促进cAMP反应性DNA结合蛋白或转录因子(CREB)(其随后可在称作cAMP反应元件的特异性位点结合启动子并驱动所述基因表达)的结合来驱动基因表达。可构建如此报告系统：其在报告基因(例如，β-半乳糖苷酶或萤光素酶基因)之前具有一包含多个cAMP反应元件的启动子。因此，活化的连有Gs的受体可引起cAMP积累(其随后可活化基因和报告蛋白质的表达。然后可使用标准生物化学分析检测报告蛋白质(诸如β-半乳糖苷酶或萤光素酶)(Chen等人1995)。

b.Gq

Gq与酶——磷脂酶C的活化有关，所述磷脂酶C又可水解磷脂PIP2，同时释放两种胞内信使：二酰甘油(DAG)和1，4，5三磷酸肌醇(IP3)。IP3积累增加与连有Gq和连有Go的受体活化有关。一般参见，“Indirect Mechanisms of SynapticTransmission，”第8章，From Neuron To Brain(第3版)Nichols，J.G.等人编辑，SinauerAssociates，Inc.(1992)。可使用能够检测IP3积累的分析来确定候选化合物是否是(例如)一连有Gq受体的反向激动剂(即，此一化合物会降低IP3含量)。也可使用API报告子分析来检测与Gq相关的受体，因为Gq依赖性磷脂酶C可活化含有API元件的基因；因此，经活化的与Gq相关的受体会显示所述基因表达的增加，藉此与其结合的反向激动剂会显示所述表达的降低，且激动剂会显示所述表达的增加。可使用市售分析进行所述检测。

3.GPCR融合蛋白质

使用组成型活性内源GPCR或组成型活化非内源GPCR进行候选化合物筛选以将其直接鉴定为反向激动剂或激动剂会带来一令人感兴趣的筛选挑战，因为根据定义，即使不存在结合至其上的内源配体，所述受体也具有活性。因此，为区分(例如)候选化合物存在下的非内源受体和所述化合物不存在下的非内源受体(此一区分的目的在于能够对所述化合物是一反向激动剂还是激动剂或是否对此一受体产生影响有所了解)，在一些实施例中较佳采用一可增强所述区分的方法。在一些实施例中，较佳方法是使用GPCR融合蛋白质。

一般而言，一旦使用上述分析技术(以及为所述领域技术人员所熟知的其它技术)确定一非内源GPCR已得到组成型活化，就有可能确定与内源GPCR偶联的主要G蛋白。G蛋白与GPCR偶联会提供一可得到评定的信号转导途径。在一些实施例中，较佳是使用一哺乳动物表达系统进行筛选，因为预计此一系统中具有内源G蛋白。因此，根据定义，在此一系统中，所述组成型活化非内源GPCR会连续发出信号。在一些实施例中，较佳是使所述信号得到增强，以使得在(例如)所述受体的反向激动剂存在下，当所述受体与反向激动剂接触时更有可能更为容易地区分受体(尤其在筛选情况下)。

预计GPCR融合蛋白质可增强G蛋白与非内源GPCR的偶联功效。GPCR融合蛋白质较佳用于筛选组成型活性内源GPCR或组成型活化非内源GPCR，因为此一方法可增强在此筛选技术中产生的信号。这点对于促使产生一显著“信噪比”很重要；此一显著比值对于如本文揭示的候选化合物筛选较佳。

可用于表达GPCR融合蛋白质的构筑体的构建为所属技术领域的技术人员所熟知。市售表达载体和系统可提供多种能够符合研究者特定需要的方法。此一GPCR融合蛋白质构筑体构建的重要标准包括但不限于，所述GPCR序列和G蛋白序列二者需在同一框内(较佳地，内源GPCR序列位于G蛋白序列的上游)，且GPCR“终止”密码子经删除或经取代以使得表达GPCR同时也能够表达G蛋白。GPCR可直接与G蛋白连接，或在二者之间存在间隔子残基(较佳地，不超过约12个，但这个数目可易于由所属技术领域的技术人员确定)。为方便起见，较佳使用一间隔子。在一些实施例中，较佳是先鉴定可与非内源GPCR偶联的G蛋白，然后再构建GPCR融合蛋白质构筑体。因为仅有数个G蛋白得到鉴定，所以较佳是使用一可用来在其中插入一内源GPCR序列的包含G蛋白序列的构筑体(即：一通用G蛋白构筑体，参见下文实例4(a))；这可在多种不同内源GPCR(具有不同序列)的大规模筛选情况下提供进一步效率。

如上所述，预计可偶联Gi、Go和Gz的活化GPCR能够抑制cAMP形成，此使得进行基于这些类型的GPCR分析富于挑战[即：当活化时cAMP信号降低，因此使得对(例如)激动剂(可进一步降低所述信号)的直接鉴定富于挑战]。如将在本文中揭示，已确定对于这些类型的受体，有可能创建一并非基于GPCR内源G蛋白的GPCR融合蛋白质，从而努力建立一可行的基于环化酶的分析。因此，例如，可使一内源Gi偶联受体与一Gs蛋白融合——当此一融合构筑体表达时，可“驱动”或“推动”内源GPCR与(例如)Gs偶联而非与“天然”Gi蛋白偶联，以使得能够建立基于环化酶的分析。因此，对于Gi、Go和Gz偶联受体，在一些实施例中，较佳是当使用GPCR融合蛋白质且分析基于对腺苷酰环化酶活性的检测时，融合构筑体可用Gs(或一可刺激形成酶腺苷酰环化酶的等效G蛋白)构建。

                                       表B

使用与一Gs、Gi、Go或Gz蛋白融合的Gq蛋白的G蛋白融合构筑体同样有效。在一些实施例中，一较佳融合构筑体可用一Gq蛋白实现，其中G蛋白α亚基(“Gαq”)前六(6)个氨基酸被删除且Gαq C-末端后五(5)个氨基酸由相应感兴趣G蛋白的Gα氨基酸取代。例如，一融合构筑体可具有与一Gi蛋白融合的Gq(6个氨基酸删除)，得到一“Gq/Gi融合构筑体”。这个融合构筑体将推动内源Gi偶联受体与非内源G蛋白——Gq的偶联，以使得能够测量第二信使(例如，三磷酸肌醇或二酰甘油)而非cAMP的产生。

4.一目标Gi偶联GPCR与一信号增强子Gs偶联GPCR的共转染(基于cAMP的分析)

已知Gi偶联受体可抑制腺苷酰环化酶，并因此可降低cAMP产生水平，此使得对cAMP含量的评定富于挑战。在一些实施例中，测量cAMP产生降低(可作为主要偶联Gi受体活化时的活化指示)的有效技术可通过共转染一信号增强子(例如，一活化时主要与Gs偶联的组成型活化非内源受体(例如，TSHR-A623I；参见下文)和连有Gi的GPCR来实现。显而易见，可根据cAMP产生的增加来确定Gs偶联受体的活化。Gi偶联受体活化会导致cAMP产生的降低。因此，预计共转染方法将有利于探究这些“相反”影响。例如，组成型活化的非内源Gs偶联受体(“信号增强子”)与单独表达载体的共转染可提供一基线cAMP信号(即：尽管Gi偶联受体会降低cAMP含量，但这种“降低”是相对于由组成型活化Gs偶联信号增强子建立的cAMP含量的显著增加而言)。那么通过共转染信号增强子和“目标受体”，一Gi偶联目标受体的反向激动剂将会增加所测量的cAMP信号，而一Gi偶联目标受体的激动剂将会降低所述信号。

应该对使用这种方法直接鉴定的候选化合物进行独立评定以确保这些化合物不是靶向信号增强受体(所述评定可在进行针对共转染受体的筛选之前或之后实施)。

C.医药化学

候选化合物

可对任何业内已知分子加以测试以确定其调节(增加或降低)本发明GPCR的能力。为鉴定一可调节活性的化合物，可直接将候选化合物提供给一表达所述受体的细胞。

本发明这一实施例可很好地适用于筛选化学文库以鉴定出可调节(例如，抑制、拮抗或激动)受体数量或活性的分子。所述化学文库可以是肽文库、拟肽文库，化学合成文库、重组(例如噬菌体展示文库)和活体外基于转译的文库、其它非肽类合成有机文库，等等。本发明这一实施例也可很好地适用于筛选内源候选化合物(包含生物材料(包括但不限于血浆和组织提取物))并适用于筛选已知具有生物活性的内源化合物文库。

在一些实施例中，候选化合物的直接鉴定可与经由组合化学技术产生的化合物的鉴定一起进行，藉此可随机制备用于此种分析的数千种化合物。所述候选化合物可以是一化学文库的成员。这可包括任何适宜数目的单独组成部分(例如数十个到数百个到数千个到数百万个适宜化合物)，例如肽、类肽和其它寡聚化合物(环状或线性)和基于模板的较小分子，例如，苯并二氮呯类、乙内酰脲类、联芳基类、碳环和多环化合物(例如，萘类、吩噻嗪类、吖啶类、类固醇类，等等)、碳水化合物和氨基酸衍生物、二氢吡啶类，二苯甲基类和杂环类(例如，三嗪类、吲哚类、噻唑烷类，等等)。所引用数目和所列化合物类型仅为阐明而非限制。较佳化学文库包括低分子量化学化合物和潜在治疗剂。

实例性化学文库可自数个来源购得(ArQule、Tripos/PanLabs、ChemDesign、Pharmacopoeia)。在一些情形中，这些化学文库可使用组合策略产生，所述策略将文库各成员的识别身份编码在所述成员化合物所连接的底物上，因此使得能够直接并立即鉴定出作为一有效调节剂的分子。因此，在许多组合方法中，一化合物在一板上的位置可指定所述化合物的组成。同样，在一实例中，单个板位置可含有1至20种化学制剂，所述化学制剂可通过将其施用至含有感兴趣相互作用的孔中来筛选。因此，如果检测到调节作用，就可对越来越小的相互作用对库进行分析以确定调节活性。通过这些方法，可对许多候选分子加以筛选。

许多适用的不同文库为业内已知，并可用于提供可本发明测试的化合物。或者，可使用标准方法构建文库。此外，更为普遍的是，也可使用结构上受约束的有机多样性(例如，非肽类)文库。举例说明，可使用一苯并二氮呯文库(参见例如，Bunin等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4708-4712)。

在本发明另一实施例中，可使用组合化学方法来鉴定本发明GPCR调节剂。组合化学方法能够用来构建包含数十万化合物的文库，其中许多具有类似结构。虽然高通量筛选程序能够筛选这些大容量文库以确定对已知目标的亲和性，但已开发出能够获得更小尺寸的文库但可提供最大化学多样性的新颖方法(参见例如，Matter，1997，Journal of Medicinal Chemistry 40：1219-1229)。

先前已将一组合化学方法——亲和性指纹法用于测试一小分子不连续文库以确定对限定组蛋白质的结合亲和性。由筛选获得的指纹图谱可用于预测逐个文库组成部分对其它感兴趣蛋白质或受体(在本发明中，为本发明受体)的亲和性。将所述指纹与从已知可与感兴趣蛋白质作用的其它化合物获得的指纹进行比较以预测文库化合物是否会同样起作用。例如，并非测试大文库中的每一配体与一复合物或蛋白质组份的相互作用，而是仅测试那些与已知具有所述活性的其它化合物具有类似指纹图谱的配体(参见例如，Kauvar等人，1995，Chemistry and Biology 2：107-118；Kauvar，1995，Affinity fingerprinting，Pharmaceutical Manufacturing International.8：25-28；和Kauvar，Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in AgrochemicalImmunoassay，D.Kurtz.L.Stanker和J.H.Skerritt编辑，1995，AOAC：Washington，D.C.，305-312)。

鉴定为调节剂的候选化合物

一般而言，所述筛选结果会是具有唯一核心结构的化合物；此后，可使这些化合物接受围绕一或多个较佳核心结构的额外化学修饰以进一步增强其药用性质。所述技术为所属技术领域的技术人员所已知，因此不在本专利案中予以详述。

在一些实施例中，所述经鉴定调节剂具有生物利用度。已开发出可为所属技术领域的技术人员使用的许多计算方法以用于预测一药物的口服生物利用度[Ooms等人，Biochim Biophys Acta(2002)1587：118-25；Clark和Grootenhuis，Curr OpinDrug DiscovDevel(2002)5：382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23：172-83；Norinder和Haeberlein，Adv Drug Deliv Rev(2002)54：291-313；Matter等人，Comb Chem HighThroughput Screen(2001)4：453-75；Podlogar和Muegge，Curr Top Med Chem(2001)1：257-75；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中)。而且，许多小组已成功使用正电子发射断层显像(PET)达成对药物分布的直接测量，包括口服施用药物后哺乳动物体内(包括非人类灵长类动物和人类体内)口服生物利用度的评定[Noda等人，J Nucl Med(2003)44：1058；Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)29：1031-8：Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)145：76-81；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。也可参见下文，包括实例18。

D.医药组合物

本发明提供治疗(和预防)方法，所述方法通过施用给有所述治疗(和预防)的个体一治疗有效量的本发明调节剂来实现[也可参见例如，于2002年8月29日以WO02/066505公开的PCT申请案第PCT/IB02/01461号；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。在一较佳方面中，所述调节剂是纯化的。所述个体较佳地是一动物，其包括但不限于下列动物，诸如牛、猪、马、鸡、猫、狗、兔子、大鼠、小鼠，等等，且较佳地是一哺乳动物，且最佳是人类。

可将本发明调节剂施用给非人类动物[参见下文实例]及/或人类，其可单独施用或以医药或生理上可接受的组合物形式施用，其中可使用所属技术领域的技术人员熟知的技术将其与适宜载剂或赋形剂混合。所属技术领域的技术人员可使用适宜的医药上可接受的载剂；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，1980，MackPublishing Co.，(Oslo等人编辑)。

因而可以治疗有效剂量提供医药上或生理上可接受的组合物。治疗有效剂量意指足以使心脏病症状或生理状况得到预防或改善的调节剂的量。所述心脏病包括但不限于充血性心力衰竭、充血性心肌病、心脏肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、室间隔破裂、心内膜炎(包括细菌性)、心脏动脉瘤、肺心病、风湿性心脏病和心室功能障碍。所述心脏病还包括心瓣膜病，其包括但不限于主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄和三尖瓣狭窄。所述心脏病进一步包括心肌疾病，其包括但不限于肥大性心肌病、充血性心肌病、主动脉瓣下狭窄、肺动脉瓣下狭窄、限制性心肌病和Chagas心肌病。在其它实施例中，治疗有效剂量意指足以使肥大性心肌病症状或生理状况得到预防或改善的调节剂的量，所述肥大性心肌病由一自下列组成的群组选出的疾病引起：心肌梗塞后重塑、心瓣膜病、持续性心脏后负荷、心肌炎和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，治疗有效剂量意指足以使先天性心脏缺陷症状或生理状况得到预防或改善的调节剂的量。所述先天性心脏缺陷包括但不限于主动脉缩窄、主动脉肺动脉间隔缺损、法洛三联症、室心间隔缺损和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，治疗有效剂量意指足以使表现为心脏扩大的疾病症状或生理状况得到预防或改善的调节剂的量。

明确认为，本发明调节剂可单独或与其它医药上或生理上可接受的化合物联合提供。用于治疗本发明疾病的其它化合物通常为业内熟知。本发明一个方面包括本文中所揭示实施例的用途，其进一步包含一或多种自下列组成的群组选出的药剂：卡托普利(aptopril)、马来酸依那普利(enalapril maleate)、赖诺普利(lininopril)、雷米普利(ramipril)、培哚普利(perindopril)、呋塞米(furosemide)、托拉塞米(torasemide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、盐酸阿米洛利(amiloridehydrochloride)、螺内酯(spironolactone)、阿替洛尔(atenolol)、比索洛尔(bisoprolol)、卡维地洛(carvedilol)、酒石酸美托洛尔(metoprolol tartrate)和地高辛(digoxin)。在一些实施例中，所述本发明疾病是一心脏病。所述心脏病包括但不限于充血性心力衰竭、充血性心肌病、心脏肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、室间隔破裂、心内膜炎(包括细菌性)、心脏动脉瘤、肺心病、风湿性心脏病和心室功能障碍。所述心脏病还包括心瓣膜病，其包括但不限于主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄和三尖瓣狭窄。所述心脏病进一步包括心肌疾病，其包括但不限于肥大性心肌病、充血性心肌病、主动脉瓣下狭窄、肺动脉瓣下狭窄、限制性心肌病和Chagas心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是由血液动力学或遗传疾病引起的肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一由一自下列组成的群组选出的疾病引起的肥大性心肌病：心肌梗塞后重塑、心瓣膜病、持续性心脏后负荷、心肌炎和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一先天性心脏缺陷。先天性心脏缺陷包括但不限于主动脉缩窄、主动脉肺动脉间隔缺损、法洛三联症、室心间隔缺损和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一表现为心脏扩大的疾病。

施用途径

适宜施用途径包括经口、经鼻、经直肠、经粘膜或经肠施用；非经肠递送，包括肌内、皮下、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜腔内、鼻内、肺内(吸入)或眼内注射，上述施用皆通过使用业内已知方法实施。其它尤其较佳施用途径是气溶胶和储积调配物。本发明药物的缓释调配物(尤其为储积调配物)明确涵盖于本发明中。在一些实施例中，施用途径是口服。

组合物/调配物

用于本发明用途的医药或生理上可接受的组合物和药剂可通过一常规方法使用一或多种生理上可接受的载剂(包括赋形剂和辅助剂)来调配。适宜调配物需根据所选施用途径而定。

某些本文所述药物会包括一医药上或生理上可接受的载剂和至少一种本发明调节剂。对于注射，可将本发明作用剂调配在水溶液中，较佳调配在生理相容性缓冲液中(诸如汉克氏溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液(诸如磷酸盐或碳酸氢盐缓冲液))。对于经粘膜施用，适宜透过障蔽的渗透剂可用于调配物中。所述渗透剂一般为业内已知。

可口服施用的医药或生理上可接受的制剂包括由明胶制成的配合插入式胶囊，以及由明胶和一增塑剂(诸如甘油或山梨醇)制成的软封闭胶囊。所述配合插入式胶囊可包含与填充剂(诸如乳糖)、粘和剂(诸如淀粉)及/或润滑剂(诸如滑石粉或硬酯酸镁)和(视情况)稳定剂混合在一起的活性成份。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮于适宜液体(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。另外，可添加稳定剂。所有用于口服施用的调配物应具有适用于所述施用的剂量。

对于口腔施用，组合物可呈以常规方法调配的锭剂或含锭形式。

对于吸入施用，根据本发明使用的化合物可方便地以来自喷雾器加压包装的气溶胶喷雾呈现形式递送，同时借助于一适宜气态推进剂，例如，二氧化碳。在加压气溶胶的情形中，可通过提供一能够递送可计量数量的阀来确定剂量单位。可调配用于吸入器或吹入器的(例如)明胶胶囊和药筒，其包含所述化合物和适宜粉剂基质(诸如乳糖或淀粉)的粉剂混合物。

可调配通过注射(例如，浓注或连续输注)以非经肠施用的化合物。用于注射的调配物可按存于(例如)安瓿或多剂量容器中的单位剂量呈现，其中添加有防腐剂。组合物可呈现如存于水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液形式，且可包含调配剂，诸如悬浮剂、稳定剂及/或分散剂。

用于非经肠施用的医药或生理上可接受的调配物包括呈水溶性形式活性化合物的水溶液。水性悬浮液可包含能够增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。视情况，悬浮液也可包含适宜稳定剂或可增加化合物溶解度以使得能够制备高度浓缩溶液的试剂。

或者，活性成份可呈粉剂或低压冻干形式，其可在使用前使用一适宜媒剂(诸如无菌无致热源水)构成。

除先前所述调配物外，也可将化合物调配成储积制剂。此长效作用调配物可通过植入(例如经皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，(例如)可将化合物与适宜聚合或疏水材料(例如作为一存入可接受油中的乳液)或离子交换树脂调配在一起，或作为可减少用量的可溶衍生物(例如，作为可减少用量的可溶盐)。

在一特定实施例中，化合物可经由一控制释放系统递送。在一实施例中，可使用泵(Langer，上述文献；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201-240；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507-516；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321：574-579)。在另一实施例中，可使用聚合材料(Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise编辑，CRC Press，Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball编辑，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chera 23：61；Levy等人，1985，Science 228：190-192；During等人，1989，Ann.Neural.25：351356；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：858-863)。其它控制释放系统在Langer的评论文章(1990，Science249：1527-1533)中论述。

另外，化合物可使用一缓释系统递送，诸如含有治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质。已确定多种缓释材料并为所属技术领域的技术人员所熟知。视其化学性质而定，缓释胶囊对化合物的释放可持续数周直至100天以上。

根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，可采用用于稳定调节剂的其它策略。

医药上或生理上可接受的组合物也可包括适宜固体或凝胶相载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物(诸如聚乙二醇)。

有效剂量

适用于本发明的医药或生理上可接受的组合物包括其中所含活性成份的有效量能够达成其预期目的的组合物。更具体而言，治疗有效量意指可有效预防拟治疗患者现有症状发展或减轻该等症状的量。有效量的确定在所属技术领域的技术人员能力范围之内，尤其可根据本文所提供的详细揭示内容确定。

对于本发明方法中所用的任一化合物而言，最初可根据细胞培养物分析来评估治疗有效剂量。例如，可在动物模型中调配一剂量以达成一循环浓度范围，所述循环浓度范围包括或涵盖一在活体外系统中显示出防止细胞死亡的浓度点或范围。(参见下文实例的活体外分析和活体内动物模型)。使用所述信息可更为准确地确定用于人类的剂量。

治疗有效剂量意指可在患者中引起症状改善的化合物量。所述化合物的毒性和疗效可根据标准医药程序在细胞培养物或实验动物中加以测定，例如，测定LD₅₀(50％测试群体的致死剂量)和ED₅₀(在测试组50％中达到疗效的剂量)。毒性效应和疗效间的剂量比值是治疗指数且可将其表示为LD₅₀和ED₅₀间的比值。展现高治疗指数的化合物较佳。

从这些细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可用于调配用于人类的剂量范围。所述化合物剂量较佳位于一循环浓度范围(包括ED₅₀)内，具有较低毒性或没有毒性。所述剂量可在此范围内变化，视所采用剂量形式和所用施用途径而定。适当调配物、施用途径和剂量可由各个医师根据患者状况来选择(参见例如，Fingl等人，1975，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章)。

可根据特定情况对剂量数量和间隔作个别调整以提供足以预防或治疗一本发明疾病的活性化合物血浆含量。达成这些效应所必需的剂量将视个体特征和施用途径而定。

同样可使用最低有效浓度值来确定剂量间隔。应按一可在10至90％时间内、较佳在30至99％时间内且最佳在50至90％时间内将血浆含量维持在最低有效浓度以上的治疗方案来施用化合物。在局部施用或选择性吸收的情形中，药物有效局部浓度可与血浆浓度无关。

当然，所施用组合物量应视拟治疗受试者、受试者体重、患病严重程度、施用方式和处方医师的判断而定。

可按每日或规律性方式施用以达成期望结果(预防或治疗本发明一疾病)的本发明调节剂数量的一较佳剂量范围是0.1至100mg/kg体重。其它较佳剂量范围是0.1-30mg/kg体重。其它较佳剂量范围是0.1-10mg/kg体重。其它较佳剂量范围是0.1-3.0mg/kg体重。当然，所述每日剂量可在一天过程中按小量定时递送或施用。应注意的是，这些剂量范围仅是较佳范围并非意欲限制本发明。在一些实施例中，所述本发明疾病是一心脏病。所述心脏病包括但不限于充血性心力衰竭、充血性心肌病、心脏肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、室间隔破裂、心内膜炎(包括细菌性)、心脏动脉瘤、肺心病、风湿性心脏病和心室功能障碍。所述心脏病还包括心瓣膜病，其包括但不限于主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄和三尖瓣狭窄。所述心脏病进一步包括心肌疾病，其包括但不限于肥大性心肌病、充血性心肌病、主动脉瓣下狭窄、肺动脉瓣下狭窄、限制性心肌病和Chagas心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是由血液动力学或遗传疾病引起的肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一由一自下列组成的群组选出的疾病引起的肥大性心肌病：心肌梗塞后重塑、心瓣膜病、持续性心脏后负荷、心肌炎和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一先天性心脏缺陷。先天性心脏缺陷包括但不限于主动脉缩窄、主动脉肺动脉间隔缺损、法洛三联症、室心间隔缺损和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一表现为心脏扩大的疾病。

E.治疗方法

本发明尤其涉及预防或治疗本发明疾病的方法，所述方法包括向一有所述治疗需要的个体提供一本发明调节剂。在一些实施例中，所述本发明疾病是一心脏病。所述心脏病包括但不限于充血性心力衰竭、充血性心肌病、心脏肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、室间隔破裂、心内膜炎(包括细菌性)、心脏动脉瘤、肺心病、风湿性心脏病和心室功能障碍。所述心脏病还包括心瓣膜病，其包括但不限于主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄和三尖瓣狭窄。所述心脏病进一步包括心肌疾病，其包括但不限于肥大性心肌病、充血性心肌病、主动脉瓣下狭窄、肺动脉瓣下狭窄、限制性心肌病和Chagas心肌病。在一些实施例中，所述调节剂是一反向激动剂或一拮抗剂。在一些实施例中，所述本发明疾病是由血液动力学或遗传疾病引起的肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一由一自下列组成的群组选出的疾病引起的肥大性心肌病：心肌梗塞后重塑、心瓣膜病、持续性心脏后负荷、心肌炎和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一先天性心脏缺陷先天性心脏缺陷包括但不限于主动脉缩窄、主动脉肺动脉间隔缺损、法洛三联症、室心间隔缺损和家族性肥大性心肌病。在一些实施例中，所述本发明疾病是一表现为心脏扩大的疾病。在一些实施例中，所述调节剂是一反向激动剂或一拮抗剂。在一些实施例中，所述调节剂具有口服生物利用度。在一些实施例中，以一可口服投予的医药组合物形式将所述调节剂提供给个体。所述个体较佳是一哺乳动物，且最佳是人类。

F.其它用途

可通过使一候选化合物与RUP40受体接触并测定所述候选化合物对RUP40受体功能性的影响来鉴定可调节(即：增加、降低或阻止)RUP40受体功能性的作用剂。可通过比较其对RUP40受体的影响和其对复数个不是RUP40受体的G蛋白偶联受体的影响来评估可调节RUP40受体功能性的化合物的选择性。在一些实施例中，可通过比较其对人类内源RUP40受体的影响和其对复数个不是RUP40受体的人类内源G蛋白偶联受体的影响来评估可调节人类内源RUP40受体功能性的化合物的选择性。鉴定出可调节RUP40受体功能性的化合物之后，可进一步在其它分析(包括但不限于，活体内模型)中测试所述候选化合物以确认或定量其活性。RUP40受体功能性调节剂在治疗上可用于预防或治疗疾病和生理状况(其中包括正常或异常的RUP40受体功能性)。

可通过使一候选化合物与一RUP40受体接触并测定所述候选化合物对RUP40受体功能性的影响来鉴定为心血管疾病调节剂(即：增加、降低或阻止)的作用剂。可通过比较其对RUP40受体的影响和其对多数不是RUP40受体的G蛋白偶联受体的影响来评估可调节RUP40受体功能性的化合物的选择性。在一些实施例中，可通过比较其对人类内源RUP40受体的影响和其对大多数不是RUP40受体的人类内源G蛋白偶联受体的影响来评估可调节人类内源RUP40受体功能性的化合物的选择性。鉴定出可调节RUP40受体功能性的化合物之后，可进一步在其它分析(包括但不限于，活体内模型)中测试所述候选化合物以确认或定量其活性。RUP40受体功能性调节剂可在治疗上用于预防或治疗心脏病，所述心脏病包括肥大性心肌病和充血性心力衰竭，特别是由心肌梗塞后重塑、心瓣膜病、持续性心脏后负荷、心肌炎和家族性肥大性心肌病引起的肥大性心肌病。

在其它实施例中，可通过使一候选化合物与一RUP40受体接触并测定所述候选化合物对RUP40受体表达的影响来鉴定为为心脏病调节剂(即：增加、降低或阻止)的作用剂。在一些实施例中，所述作用剂可降低RUP40受体在一细胞中的表达。在一些实施例中，所述作用剂可降低RUP40受体在一心肌细胞中的表达。在一些实施例中，所述作用剂可降低RUP40受体在一人类心肌细胞中的表达。在一些实施例中，所述RUP40受体可由所述细胞或心肌细胞内源表达。在一些实施例中，使用抗-RUP40受体抗体测量RUP40受体表达水平。举例说明但不限于，所述抗-RUP40受体抗体可以是实例12中所述者。相信所属技术领域的技术人员有能力制备针对人类、大鼠或小鼠RUP40受体的抗体以便可用于测量RUP40在一细胞中的表达水平。在一些实施例中，可使用放射性标记的对RUP40受体具有特异性的配体测量RUP40受体表达水平(参见下文)。在一些实施例中，可通过北方印迹或RT-PCR测量RUP40受体表达水平。

本发明还涉及一鉴定一候选化合物是否是一可降低RUP40受体在一细胞中表达的作用剂的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)使复数个含有RUP40受体的细胞与一候选化合物接触或不接触；

(b)测量接触所述候选化合物的所述细胞中的RUP40受体表达水平和未接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平；和

(c)对接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平和未接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平加以比较；其中接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平较未接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平的降低表示所述候选化合物是一可降低RUP40受体在一细胞中表达的作用剂。

本发明还涉及一鉴定一候选化合物是否是一可降低或阻止心脏病的作用剂的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)使复数个含有RUP40受体的细胞与一候选化合物接触或不接触；

(b)测量接触所述候选化合物的细胞中的RUP40受体表达水平和未接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平；和

(c)对接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平和未接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平加以比较；其中接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平相比于未接触所述候选化合物的细胞中RUP40受体表达水平的降低表示所述候选化合物是一可降低或阻止心脏病的作用剂。

本发明涉及所述可降低RUP40在一细胞(例如，一心肌细胞)中表达的作用剂，涉及一包含所述作用剂的组合物(例如，一医药组合物)，并涉及使用所述组合物(例如，用于预防或治疗一心脏病，诸如用于肥大性心肌病或充血性心力衰竭)的方法，其中所述化合物是反义核酸(例如，反义RNA)。本发明涉及所述可降低RUP40在一细胞(例如，一心肌细胞)中表达的作用剂，涉及一包含所述作用剂的组合物(例如，一医药组合物)，并涉及使用所述组合物(例如，用于预防或治疗一心脏病，诸如用于肥大性心肌病或充血性心力衰竭)的方法，其中所述化合物是一小干涉RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子，其包含一根据标准程序衍生自RUP40 GPCR编码基因核苷酸序列的核苷酸序列。如为所属技术领域的技术人员已知的是，siRNA、shRNA和反义RNA通常能够调节目标基因的表达[参见例如，Holmlund JT，Ann NYAcad Sci(2003)1002：244-251；和Devroe等人，Expert Opin Biol Ther(2004)4：319-327；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

本发明还涉及鉴定为RUP40调节剂或配体的本发明化合物的放射性同位素标记形式，其不仅可用于放射成像也可用于在分析(活体外和活体内二者)中定位和定量组织样品(包括人类)中的RUP40和通过抑制放射性同位素标记的化合物的结合来鉴定RUP40配体。本发明的进一步目标是研发其中包含所述放射性同位素标记的化合物的新颖RUP40分析。仅为阐明而非限制性目的，预想可通过放射成像观察到的高于正常范围的心室RUP40可用于鉴定一处于本发明心血管疾病(例如，肥大性心肌病或充血性心力衰竭)风险中或发展成所述病症的个体。

本发明包括经鉴定为RUP40调节剂或配体的本发明化合物的放射性同位素标记形式。

在一些实施例中，如果不是一或多个原子经一具有不同于通常天然发现(即：天然存在)的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子置换或取代，则一化合物的放射性同位素标记形式与所述化合物相同。可掺入本发明化合物的适宜放射性核素包括但不限于²H(氘)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、¹⁸F、³⁵S、³⁶Cl、⁸²Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。可掺入本发明放射性标记化合物的放射性核素将视所述放射性标记化合物的具体应用而定。例如，对于活体外RUP40标记和竞争分析而言，掺入³H、¹⁴C、⁸²Br、¹²⁵I、¹³¹I或³⁵S的化合物通常最为有用。对于放射成像应用而言，¹¹C、¹⁸F、¹²⁵I、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、⁷⁵Br、⁷⁶Br或⁷⁷Br通常最为有用。在一些实施例中，放射性核素选自由³H、¹¹C、¹⁸F、¹⁴C、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³¹I、³⁵S和⁸²Br组成的群组。

用于向有机化合物掺入放射性同位素的合成方法可应用于本发明化合物中且为业内所熟知。这些合成方法(例如，向目标分子中掺入活性水平的氚)如下：

A.使用氚气的催化还原反应——本程序通常会生成具有高比活性的产物并需要卤化的或不饱和前体。

B.使用硼氢化钠[³H]的还原反应——本程序相当便宜并需要含有可还原官能团(诸如醛、酮、内酯、酯，及诸如此类)的前体。

C.使用氢化铝锂[³H]的还原反应——本程序提供的产物的比活性几乎为理论值。其也需要含有可还原官能团(诸如醛、酮、内酯、酯，及诸如此类)的前体。

D.氚气暴露标记——本程序包括在一适宜催化剂存在下将含有可交换质子的前体暴露于氚气中。

E.使用碘甲烷[³H]的N-甲基化反应——通常采用本程序通过用高比活性碘甲烷(³H)处理适宜前体来制备O-甲基或N-甲基(³H)产物。本方法通常会得到更高的比活性，诸如例如，约70至90Ci/mmol。

向目标分子中掺入活性水平¹²⁵I的合成方法包括：

A.桑德迈尔(Sandmeyer)反应和类似反应——本程序将一芳基或杂芳基胺转化成重氮盐(诸如四氟硼酸盐)且随后用Na¹²⁵I将其转化成¹²⁵I标记的化合物。Zhu，D.-G.及其同事在J.Org.Client.2002，67，943-948中报导了代表性程序。

B.苯酚的邻位¹²⁵碘化——本程序涉及在苯酚的邻位上掺入¹²⁵I，如Collier，T.L.及其同事在J.Labeled Compd Radiopharm.1999，42，S264-S266中报导。

C.芳基和杂芳基溴化物与¹²⁵I的交换——本方法通常是一两步法。第一步是在三烷基锡卤化物或六烷基二锡[例如，(CH₃)₃SnSn(CH₃)₃]存在下使用(例如)Pd催化的反应[即Pd(Ph₃P)₄]或通过一芳基或杂芳基锂将芳基或杂芳基溴转化成相应的三烷基锡中间物。Bas，M.-D.及其同事在J.Labeled Compd Radiopharm.2001，44，S280-S282中报导了一代表性程序。

在一些实施例中，如果不加入一或多个包含一放射性核素的取代基，则化合物的一放射性同位素标记形式与所述化合物相同。在一些其它实施例中，所述化合物是一多肽。在一些其它实施例中，所述化合物是一抗体或其一抗原结合片段。在一些其它实施例中，所述抗体是单克隆抗体。适宜的所述放射性核素包括但不限于²H(氘)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、¹⁸F、³⁵S、³⁶Cl、⁸²Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。可掺入本发明放射性标记化合物的放射性核素将视所述放射性标记化合物的具体应用而定。例如，对于活体外RUP40标记和竞争分析而言，掺入³H、¹⁴C、⁸²Br、¹²⁵I、¹³¹I或³⁵S的化合物通常最为有用。对于放射成像应用而言，¹¹C、¹⁸F、¹²⁵I、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、⁷⁵Br、⁷⁶Br或⁷⁷Br通常最为有用。在一些实施例中，放射性核素选自由³H、¹¹C、¹⁸F、¹⁴C、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³I、³⁵S和⁸²Br组成的群组。

用于添加一或多个取代基(包含一放射性核素)的方法为所属技术领域的技术人员所熟知并包括但不限于，通过酶促法[Marchalonic JJ，Biochemical Journal(1969)113：299-305；Thorell JI和Johansson BG，Biochimica et Biophysica Acta(1969)251：363-9；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]及/或通过氯胺-T/Iodogen/Iodobead法[Hunter WM和Greenwood FC，Nature(1962)194：495-6；Greenwood FC等人，Biochemical Journal(1963)89：114-23；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]添加放射性同位素碘。

根据对本专利案下文的参阅，所属技术领域的技术人员将易知所揭示受体和方法的其它用途。

                                 实例

提供下列实例仅为阐明而非限制本发明。尽管本文揭示出具体的核酸和氨基酸序列，但相信所属技术领域的技术人员有能力对这些序列稍加修改同时获得与下文报告的结果相同或实质类似的结果。

提供下列实例仅为阐明而非作为限制手段。所属技术领域的技术人员能够根据本文揭示内容设计等效分析和方法，其全部构成本发明的一部分。

所属技术领域的技术人员可用多种表达载体来达成在一细胞中产生一感兴趣多肽的目的。一适宜载体是pCMV，其在某些实施例中使用。这种载体根据微生物有机体保存专利程序的国际认可的布达佩斯协议((Budapest Treaty for the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure))条款于1998年10月13日存入美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。由ATCC测试DNA并确定其具有活力。ATCC已对pCMV指定了下列保存号：ATCC#203351。在一些实施例中，所采用的载体较佳是一腺病毒表达载体。实例性腺病毒表达载体包括那些可自QBiogene(Carlsbad，CA)购得的载体或美国专利第5,922,576号中所述的载体。

涉及本发明标题物并为所属技术领域的技术人员熟知的重组DNA技术可见(例如)Maniatis T等人，Molecular Cloning：A Laboratorv Manual(1989)Cold Spring HarborLaboratory；美国专利第6,399,373号和于2002年8月29日以WO 02/066505公开的PCT申请案第PCT/IB02/01461号；上述文献和专利的各自揭示内容的全文皆以引用方式并入本文中。

实例1

人类内源RUP40的全长克隆

从Clontech Multiple Tissue cDNA Panel，目录号K1425-1(尤其是人胎脾第一链cDNA的互补序列)中克隆编码人类内源RUP40的多核苷酸。

通过聚合酶链反应产生所述克隆，其中使用Advantage HF-2聚合酶(Clontech目录号K1914-y)并使用下列基因特异性引物：

5′-ATATGGTACCATGAAATCCCCAAGGAGAACCACTTTGTGCC-3′(SEQ IDNO：7；反义)

5′-ATATGCGGCCGCTTAGTTGAGCAACGAAGAAGCACTGGATGAG-3′(SEQID NO：8；有义)。

反义引物包含以下划线表示的KpnI限制酶切位点，和以粗体/斜体表示的起始密码子。有义引物包含以下划线表示的NotI限制酶切位点，和以粗体/斜体表示的终止密码子。

在50μl反应物中使用Advantage HF-2聚合酶通过下列循环实施扩增，所述循环中步骤2至3重复35次：步骤1：94.0℃，15秒；步骤2：94.0℃，15秒；步骤3：68.0℃，6.0分钟；步骤4：68.0℃，3.0分钟。从一1％琼脂糖凝胶中分离近似4.1kb的PCR片段，并克隆至pcr4-TOPO载体(Invitrogen)中，并使用ABI Big Dye Terminator试剂盒(P.E.Biosystems)将其完全测序。核酸序列见SEQ ID NO：1，推导的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。

所属技术领域的技术人员熟知如何以类似方法克隆编码大鼠内源RUP40的多核苷酸(使用产生自(例如)大鼠心脏、肺或脂肪组织的cDNA作为模板)。

实例2

受体表达

尽管对于蛋白质表达业内可采用多种细胞，但最佳是使用哺乳动物细胞或载黑色素细胞。其主要原因在于其实用性，即，使用(例如)酵母细胞进行GPCR表达(尽管可行)会向方案中引入一不会包括(在酵母的情况下的确不包括)受体偶联、遗传机制和分泌途径(其已出现于哺乳动物系统中)的非哺乳动物细胞——因此从非哺乳动物细胞获得的结果(尽管具潜在用途)不会与从哺乳动物细胞或载黑色素细胞获得的结果同样较佳。在哺乳动物细胞中，CHO、COS-7、293和293T细胞尤其较佳，但所采用的具体哺乳动物细胞可根据技术人员的实际需要而定。在一些实施例中，心肌细胞较佳。参见下文涉及载黑色素细胞的部分，包括实例8。

a.瞬时转染

第1天，以每个10cm培养皿6×10⁶个293细胞进行适当铺板。第2天，制备2个反应管(遵循的比例是一管对应一个平板)：通过将4μgDNA(例如，pCMV载体、含受体cDNA的pCMV载体，等等)混合于0.5ml无血清DMEM(Gibco BRL)中来制备管A；通过将24μl Lipofectamine(Gibco BRL)混合于0.5ml无血清DMEM中来制备管B。将管A和B倒转混合(数次)，然后于室温下培育30至45分钟。将所述混合物称作“转染混合物”。用1×PBS洗涤经铺板的293细胞，然后添加5ml无血清DMEM。将1ml转染混合物添加至细胞中，然后在37℃/5％CO₂下培育4小时。通过抽吸去除转染混合物，然后添加10ml DMEM/10％胎牛血清。将细胞在37℃/5％CO₂下培育。培育48小时后，收集细胞并用于分析。

b.稳定细胞系

将约12×10⁶个293细胞铺板于一15cm组织培养板上。使其生长在含10％胎牛血清和1％丙酮酸钠、L-谷胺酰胺和抗生素的DME高葡萄糖培养基中。293细胞铺板后24小时(或长至～80％铺满时)，用12μgDNA(例如，含受体cDNA的pCMV载体)转染所述细胞。将12μgDNA与60μl Lipofectamine和2mL无血清的DME高葡萄糖培养基合并。从平板上抽吸出培养基并用无血清培养基洗涤细胞一次。将DNA、Lipofectamine和培养基混合物连同10mL无血清培养基一起添加至平板中。在37℃下培育4至5小时后，抽吸出培养基并添加25ml含血清培养基。转染后24小时，再抽吸出培养基，并添加含血清的新鲜培养基。转染后48小时，抽吸出培养基并添加含血清培养基，所述含血清培养基中含终浓度为500μg/mL的遗传素(G418药物)。现在对转染细胞加以选择以选出含G418抗性基因的阳性转染细胞。当进行选择时每4至5天更换一次培养基。选择期间，使细胞生长以建立稳定库，或分开以进行稳定克隆选择。

实例3

评定GPCR活化的分析

可使用多种方法进行哺乳动物GPCR的活化评定。下列实例仅为阐明性；相信所属技术领域的技术人员有能力确定那些适应技术人员需要的优先有利技术。

1.膜结合分析：[³⁵S]GTPγS分析

当一G蛋白偶联受体处于其活性状态时(或由于配体结合或由于组成型活化)，则所述受体可偶联一G蛋白并刺激GDP的释放和随后GTP与G蛋白的结合。G蛋白α亚基-受体复合物可充当一鸟苷三磷酸酶并缓慢地将GTP水解成GDP，此时所述受体通常是未活化的。活化受体继续将GDP转变为GTP。可使用不可水解的GTP类似物——[³⁵S]GTPγS来证明[³⁵S]GTPγS对表达活化受体的膜结合的增强。使用[³⁵S]GTPγS结合测量活化的优点在于：(a)其一般可用于所有G蛋白偶联受体；(b)其最接近膜表面使得其基本不可能结合可影响胞内级联的分子。

本分析利用G蛋白偶联受体刺激[³⁵S]GTPγS与表达相应受体的膜结合的能力。因此本分析可用于筛选候选化合物是否为内源GPCR和组成型活化非内源GPCR的直接鉴定方法中。本分析具通用性并可应用于针对所有G蛋白偶联受体的药物发现中。

[³⁵S]GTPγS分析物可于下列物质中培育1小时：20mM HEPES和1至约20mM之间的MgCl₂(可对这个数量加以调整以获得最优化结果，但20mM较佳)pH 7.4；含约0.3至约1.2nM之间的[³⁵S]GTPγS的结合缓冲液(可对这个数量加以调整以获得最优化结果，但1.2较佳)和12.5至75μg膜蛋白(例如，293细胞表达的Gs融合蛋白质；可对这个数量加以调整以获得最优化结果)和10μM GDP(可对这个数量加以改变以获得最优化结果)。然后添加麦胚凝集素珠粒(25μl；Amersham)并将混合物再于室温下培育30分钟。然后将各管于室温下以1500×g离心5分钟且随后在闪烁计数器中计数。

2.腺苷酰环化酶

可对设计用于基于细胞分析的Flash Plate^TM腺苷酰环化酶试剂盒(New EnglandNuclear；目录号SMP004A)加以修改以使其适用于粗制质膜。Flash Plate孔可包含一闪烁涂层，所述闪烁涂层也可包含一能够识别cAMP的特异性抗体。可通过放射性cAMP示踪剂对cAMP抗体结合的直接竞争来定量各孔中产生的cAMP。下文可作为一测量表达所述受体的完整细胞中cAMP含量变化的简要方案。

可大约在瞬时转染后24小时收集转染细胞。小心抽吸出培养基并弃去。向每一细胞板中轻轻添加10ml PBS，然后小心将其抽吸出。向每一板中添加1ml Sigma细胞离解缓冲液和3ml PBS。用移液管将细胞移出平板并将细胞悬浮液收集至一50ml锥形离心管中。然后可将细胞于室温下以1,100rpm离心5分钟。将细胞沉淀小心地重悬至适宜体积的PBS中(约3ml/板)。然后使用血细胞计数器对细胞进行计数并添加额外的PBS以得到适宜数目的细胞(终体积约50μl/孔)。

可根据厂商说明书制备和保存cAMP标准物和检测缓冲液{11ml检测缓冲液中包含1μCi示踪剂[¹²⁵I]cAMP(50μl))。用于筛选的分析缓冲液须新鲜制备，且包含50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM的分析终浓度)和50μl细胞。分析缓冲液在使用前保存于冰上。分析可由向适宜孔中添加50μl cAMP标准物然后向孔H11和H12中添加50μl PBSA起始。向所有孔中添加50μl刺激缓冲液。用一能够分配3μl化合物溶液的针形工具将DMSO(或所筛选候选化合物)添加至适宜孔中，分析终浓度为12μM测试化合物且分析总体积为100μl。然后可将细胞添加至各孔中并于室温培育60分钟。然后向各孔中添加100μl含示踪剂cAMP的检测混合物。随后可将各板再培育2小时，接着在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。然后根据一标准cAMP曲线(其包含在每一分析板中)来推知每孔的cAMP值。

3.用于Gi偶联靶标GPCR的基于细胞的cAMP

TSHR是一经活化时可引起cAMP积累的Gs偶联GPCR。通过使氨基酸残基623突变(即，将一丙氨酸残基变成一异亮氨酸残基)可对TSHR进行组成型活化。预计一Gi偶联受体可抑制腺苷酰环化酶并因此可降低cAMP产生水平，此可使得评定cAMP含量富于挑战。一用于测量cAMP产生降低(作为一Gi偶联受体组成型活化的指征)的有效技术最佳可通过共转染作为一“信号增强子”的组成型活化非内源TSHR(TSHR-A623I)(或一具组成型活性的内源Gs偶联受体)和一连有Gi的靶标GPCR(建立一cAMP基线水平)来达成。一旦建立了所述Gi偶联受体的非内源形式，就可将靶标GPCR的所述非内源形式与所述信号增强子共转染，且其就是这种可用于筛选的物质。当使用一cAMP分析时我们将使用这种方法来有效产生一信号；较佳地，可使用这种方法直接鉴定针对的Gi偶联受体的候选化合物。应注意的是，对于一Gi偶联GPCR，当这种信号增强子的方法与一内源或组成型活化的Gi偶联GPCR联合使用时，那么，所述靶标GPCR的一反向激动剂将增加cAMP信号而一激动剂将降低cAMP信号。

第1天，可按每孔2×10⁴个293细胞铺板。第2天，制备2个反应管(遵循的比例是一管对应一个平板)：通过将每一受体(已转染至哺乳动物细胞中)的2μg DNA(总共4μgDNA)(例如，pCMV载体、含突变THSR(TSHR-A623I)、TSHR-A623I和GPCR的pCMV载体，等等)混合于1.2ml无血清DMEM(Irvine Scientific，Irvine，CA)中来制备管A；通过将120μl Lipofectamine(Gibco BRL)混合于1.2ml无血清DMEM中来制备管B。随后将管A和B倒转混合(数次)，然后于室温下培育30至45分钟。将所述混合物称作“转染混合物”。用1×PBS洗涤经铺板的293细胞，然后添加10ml无血清DMEM。随后将2至4ml转染混合物添加至细胞中，然后在37℃/5％CO₂下培育4小时。随后通过抽吸去除转染混合物，然后添加25ml DMEM/10％胎牛血清。然后可将细胞在37℃/5％CO₂下培育。培育24小时后，收集细胞并用于分析。

然而，可根据熟练技术人员的需要对设计用于基于细胞分析的Flash Plate^TM腺苷酰环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)加以修改以使其适用于粗制质膜。Flash Plate孔可包含一闪烁涂层，所述闪烁涂层也可包含一能够识别cAMP的特异性抗体。可通过放射性cAMP示踪剂对cAMP抗体结合的直接竞争来定量各孔中产生的cAMP。下文可作为一测量表达所述受体的完整细胞中cAMP含量变化的简要方案。

可大约在瞬时转染后24小时收集转染细胞。小心抽吸出培养基并弃去。向每一细胞板中轻轻添加10ml PBS，然后小心将其抽吸出。向每一板中添加1ml Sigma细胞离解缓冲液和3ml PBS。用移液管将细胞移出平板并将细胞悬浮液收集至一50ml锥形离心管中。然后可将细胞于室温下以1,100rpm离心5分钟。将细胞沉淀小心地重悬至适宜体积的PBS中(约3ml/板)。然后使用血细胞计数器对细胞进行计数并添加额外的PBS以得到适宜数目的细胞(终体积约50μl/孔)。

可根据厂商说明书制备和保存cAMP标准物和检测缓冲液{11ml检测缓冲液中包含1μCi示踪剂[¹²⁵I]cAMP(50μl))。用于筛选的分析缓冲液须新鲜制备，且包含50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM的分析终浓度)和50μl细胞。分析缓冲液在使用前保存于冰上。分析可由向适宜孔中添加50μl cAMP标准物然后向孔H-11和H12中添加50μl PBSA起始。可向所有孔中添加50μl刺激缓冲液。用一能够分配3μl化合物溶液的针形工具将所筛选候选化合物(例如，TSH)添加至适宜孔中，分析终浓度为12μM测试化合物且分析总体积为100μl。然后可将细胞添加至各孔中并于室温培育60分钟。然后向各孔中添加100μl含示踪剂cAMP的检测混合物。随后可将各板再培育2小时，接着在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。然后根据一标准cAMP曲线(其包含在每一分析板中)来推知每孔的cAMP值。

4.基于报告子的分析

a.CRE-LUC报告分析(连有Gs的受体)

以每孔2×10⁴个细胞的密度将293和293T细胞铺于96孔板上，并在第二天根据厂商说明书使用Lipofectamine试剂(BRL)进行转染。如下制备一供每6孔转染用的DNA/脂质混合物：轻轻地将存于100μlDMEM中的260ng质粒DNA与存于100μlDMEM中的2μl脂质相混合{260ng质粒DNA包括200ng 8xCRE-Luc报告子质粒、50ng包含内源受体或非内源受体的pCMV或单独的pCMV和10ng GPRS表达质粒[GPRS存于pcDNA3(Invitrogen)中]}。8xCRE-Luc报告子质粒如下制备：通过将大鼠生长抑素启动子(-71/+51)克隆至pβgal-基本载体(Clontech)的BglV-HindIII位点来获得载体SRIF-β-gal。通过PCR自腺病毒模板AdpCF126CCRE8获得八(8)拷贝的cAMP反应元件[参见，Suzuki等人，Hum Gene Ther(1996)7：1883-1893；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]，并将其克隆至SRIF-β-gal载体的Kpn-BglV位点，得到8xCRE-β-gal报告子载体。通过用自pGL3-基本载体(Promega)HindIII-BamHI位点获得的萤光素酶基因代替8xCRE-β-gal报告子载体中的β-半乳糖苷酶基因而得到8xCRE-Luc报告子质粒。于室温培育30分钟后，用400μl DMEM将DNA/脂质混合物稀释并将100μl稀释的混合物添加至各孔中。在一细胞培养箱中培育4小时后向各孔中添加100μl含10％FCS的DMEM。第二天，将转染细胞更换为200μl/孔的含10％FCS的DMEM。八(8)小时后，用PBS洗涤一次后将各孔更换为100μl/孔的不含酚红的DMEM。第二天使用LucLite^TM报告基因分析试剂盒(Packard)根据厂商说明书来测量萤光素酶活性并在一1450MicroBeta^TM闪烁发光计数器(Wallac)上读数。

b.AP1报告分析(连有Gq的受体)

[OS07]一种检测Gq刺激作用的方法基于下述已知性质：Gq依赖性磷脂酶C可引起在其启动子中包含AP1元件的基因的活化。可根据上述有关CREB报告分析所示方案来使用Pathdetect^TM AP-1cis-Reporting System(Stratagene，目录号219073)，不同的是磷酸钙沉淀物组份是410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-受体表达质粒和20ngCMV-SEAP。

c.SRF-LUC报告分析(连有Gq的受体)

一种检测Gq刺激作用的方法基于下述已知性质：Gq依赖性磷脂酶C可引起在其启动子中包含血清应答因子的基因的活化。可使用Pathdetect^TM SRF-Luc-ReportingSystem(Stratagene)在(例如)COS7细胞中分析Gq偶联活性。根据厂商说明书使用Mammalian Transfection^TM试剂盒(Stratagene，目录号200285)，用所述系统的质粒组份和指定的编码内源或非内源GPCR的表达质粒转染细胞。简言之，即按照厂商说明书将410ng SRF-Luc、80ng pCMV-受体表达质粒和20ng CMV-SEAP(分泌型碱性磷酸酶表达质粒；于转染细胞培养基中测量碱性磷酸酶活性以控制样品间转染效率的变化)合并在磷酸钙沉淀物中。将沉淀物的一半等分在96-孔板的3个孔中，将细胞于无血清培养基中放置24小时。在最后5小时将细胞与测试化合物或适宜对照(若指定)一起培育。然后将细胞裂解并用来分析萤光素酶活性，分析时按照厂商说明书使用Luclite^TM试剂盒(Packard，目录号6016911)和“Trilux 1450Microbeta”液体闪烁发光计数器(Wallac)进行。可使用GraphPad Prism^TM 2.0a(GraphPad Software Inc.)分析数据。

5.胞内IP3积累分析(连有Gq的受体)

第1天，将包含受体(内源及/或非内源)的细胞铺于24孔板上，通常为1×10⁵个细胞/孔(但这个数目可经最优化)。第2天，首先可通过混合0.25μgDNA(存于50μl无血清DMEM中)/孔和2μl Lipofectamine(存于50μl无血清DMEM中)/孔来转染细胞。轻轻地混合溶液并于室温培育15至30分钟。细胞用0.5ml PBS洗涤，且将400μl无血清培养基与转染培养基混合并将其添加至细胞中。然后将细胞在37℃/5％CO₂下培育3至4小时，且随后去除转染培养基并更换成1ml/孔的正常生长培养基。第3天，用³H-肌醇标记细胞。简言之，去除培养基并用0.5ml PBS洗涤细胞。然后向各孔中添加含0.25μCi ³H-肌醇/孔的0.5ml无肌醇/无血清培养基(GIBCOBRL)，并将细胞在37℃/5％CO₂下过夜培育16至18小时。第4天，用0.5ml PBS洗涤细胞并添加0.45ml分析培养基[包含无肌醇/无血清培养基、10μM帕吉林(pargyline)、10mM氯化锂]或添加0.4ml分析培养基和50μl 10×酮色林(ketanserin)(ket)至终浓度为10μM。随后将细胞在37℃下培育30分钟。然后用0.5mlPBS洗涤细胞，且每孔添加200μl新鲜/冰冷的终止溶液(1M KOH；18mM硼酸钠；3.8mMEDTA)。将溶液于冰上放置5至10分钟或直至细胞裂解，且随后用200μl新鲜/冰冷的中和液(7.5％HCL)中和。然后将裂解物转移至1.5ml Eppendorf管中并向每管中添加1ml氯仿/甲醇(1∶2)。将溶液涡旋15秒并将上层相加于Biorad AG1-X8^TM阴离子交换树脂(100至200目)中。首先用水以1∶1.25W/V洗涤树脂，然后将0.9ml上层相加样至柱子上。用10ml 5mM肌醇和10ml 5mM硼酸钠/60mM甲酸钠洗涤柱子。将三磷酸肌醇洗脱至含10ml闪烁混合剂(2ml 0.1M甲酸/1M甲酸铵)的闪烁瓶中。通过用10ml 0.1M甲酸/3M甲酸铵洗涤来再生柱子并用dd H₂O冲洗2次然后于4℃下保存在水中。

实例4

融合蛋白质的制备

a.GPCR：Gs融合构筑体

可如下达成组成型活化的GPCR-G蛋白融合构筑体的设计：将大鼠G蛋白Gsα(详细形式参见：Itoh，H.等人，83 PNAS 3776(1986))的5′和3′末端都改造成在其上包括一HindIII(5′-AAGCTT-3′)序列。确认为正确序列(包括侧翼的HindIII序列)之后，使用所述载体的HindIII限制酶切位点进行亚克隆从而将整个序列插入pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目录号V795-20)中。亚克隆至pcDNA3.1(-)后确定Gsα序列的正确方向。然后验证经改造的pcDNA3.1(-)(在HindIII序列处包含大鼠Gsa基因)：此时这个载体可用作一“通用”Gsα蛋白质载体。所述pcDNA3.1(-)载体在HindIII位点的上游包含多种为人熟知的限制酶切位点，因此有利于提供在Gs蛋白上游插入具组成型活性的内源GPCR编码序列的能力。可采用与此相同的方法来构建其它“通用”G蛋白载体，且当然可以使用为技术人员所已知的市售或专利载体——重要标准是GPCR的序列应位于上游且与G蛋白序列同在一框内。

b.Gq(6氧基酸删除)/Gi融合构筑体

可如下达成Gq(del)/Gi融合构筑体的设计：将删除具有TLESIM Gqα-亚基序列的N-末端六个(6)氨基酸(氨基酸2至7)，并用相应具有序列DCGLF的Giα蛋白氨基酸取代具有序列EYNLV的C-末端五个(5)氨基酸。将通过PCR以质粒63313(包含带有血凝素标签的小鼠Gqα-野生型形式)作为模板并使用下列引物获得这个融合构筑体：

5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3′(SEQ ID NO：9)和5′-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ ID NO：10)。以小写字母表示的核苷酸作为间隔子。

可使用TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)通过下列循环进行扩增，步骤2至4重复35次：95℃，2分钟；95℃，20秒；56℃，20秒；72℃，2分钟；和72℃，7分钟。可将PCR产物克隆至pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中并使用ABI BigDye Terminator试剂盒(P.E.Biosystems)测序。可通过2步克隆法将来自包含融合构筑体序列的TOPO纯系的插入片段插入到表达载体pcDNA3.1(+)的HindIII/BamHI位点处。也可参见，于2002年9月6日以WO02068600公开的PCT申请案第PCT/US02/05625号，其揭示内容的全文以引用方式并入本文中。

实例5

[³⁵S]GTPγS分析

膜的制备

在一些实施例中，较佳地可如下制备膜，所述膜包含感兴趣的靶标GPCR并可用于直接将候选化合物鉴定为(例如)反向激动剂、激动剂或拮抗剂：

a.材料

“膜研磨缓冲液”包含20mM HEPES和10mM EDTA，pH 7.4；“膜洗涤缓冲液”包含20mM HEPES和0.1mM EDTA，pH 7.4；“结合缓冲液”包含20mM HEPES、100mM NaCl和10mM MgCl₂，pH 7.4。

b.程序

在整个程序中将所有材料都置于冰上。首先，从一铺满的单层细胞中抽吸出培养基，然后用10ml冷PBS漂洗，接着抽吸出PBS。此后，添加5ml膜研磨缓冲液以研磨细胞；这之后将细胞提取物转移至50ml离心管中(在4℃下以20,000rpm离心17分钟)。然后，抽吸出上清液并将沉淀重悬于30ml膜洗涤缓冲液，接着在4℃下以20,000rpm离心17分钟。然后抽吸出上清液并将沉淀重悬于结合缓冲液中。这之后使用Brinkman Polytron^TM匀浆器进行匀浆(15至20秒的脉冲，直至所有材料都处于悬浮液中)。本文中将此称作“膜蛋白”。

Bradford蛋白质分析

匀浆之后，可使用Bradford蛋白质分析来测定膜蛋白浓度(可将蛋白质稀释成约1.5mg/ml，等分并冷冻(-80℃)以备后续使用；当冷冻时，所用方案如下：分析当天，将冷冻的膜蛋白于室温解冻，然后涡旋且随后用Polytron以约12×1,000rpm匀浆(约5至10秒)；应注意，对于多个制备物，在对不同制备物进行匀浆的间隔之间应将匀浆器彻底清洗干净)。

a.材料

可根据厂商说明书(Biorad，目录号500-0006)使用结合缓冲液(按照上文)、Bradford染剂、Bradford蛋白质标准物。

b.程序

可制备2管，一管包含膜而另一管作为“空白”对照。每管包含800μl结合缓冲液。此后，将10μl Bradford蛋白质标准物(1mg/ml)添加至各管中，且随后只在一管中加入膜蛋白(不是空白)。此后，向各管中加入200μl Bradford染剂，然后将各管涡旋。五(5)分钟后，重新涡旋各管并将其中的材料转移到比色杯中。然后使用CECIL 3041分光光度计在波长595处对比色杯进行读数。

直接鉴定分析

a.材料

GDP缓冲液由37.5ml结合缓冲液和2mg GDP(Sigma，目录号G-7127)组成，然后于结合缓冲液中进行系列稀释以获得0.2μM GDP(各孔中GDP终浓度是0.1μMGDP)；包含一候选化合物的各孔的终体积是200μl，包含100μl GDP缓冲液(终浓度，0.1μM GDP)、50μl存于结合缓冲液中的膜蛋白和50μl存于结合缓冲液中的[³⁵S]GTPγS(0.6nM)(每10ml结合缓冲液有2.5μl[35S]GTPγS)。

b.程序

较佳地使用96-孔板(此等可于-80℃冷冻)来筛选候选化合物。悬浮前将膜蛋白(或包含不具有靶标GPCR的表达载体的膜，用作对照)短暂匀浆。然后使用如上所示的Bradford蛋白质分析测定蛋白质浓度。然后将膜蛋白(和对照)于结合缓冲液中稀释成0.25mg/ml(分析终浓度12.5μg/孔)。此后，将100μl GDP缓冲液添加至WallacScintistrip^TM(Wallac)的各孔中。然后用5μl针形工具将5μl候选化合物转移至所述孔中(即，200μl分析总体积有5μl，比率为1∶40，使得所述候选化合物的筛选终浓度为10μM)。再者，为避免污染，在每个转移步骤之后应在3个容器(包含水(1×)、乙醇(1×)和水(2×))中漂洗针形工具——每次漂洗后应将工具中多余的液体甩净并于纸和Kimwipes纸巾上干燥。此后，向各孔中加入50μl膜蛋白(也使用包含不具有靶标GPCR的膜的对照孔)，并于室温预先培育5至10分钟。此后，向各孔中加入50μl存于结合缓冲液中的[³⁵S]GTPγS(0.6nM)，然后在振荡器上于室温培育60分钟(再者，于本实例中各板用箔覆盖)。然后在22℃下将各板以4000RPM离心15分钟中止分析。然后用8通道多支管抽吸出各板的液体并用板盖密封。然后在Wallac1450上使用设置“Prot.#37”(按照厂商说明书)对各板进行读数。

实例6

环化AMP分析

另一用于将候选化合物直接鉴定为(例如)反向激动剂、激动剂或拮抗剂的分析方法可通过采用一基于环化酶的分析来达成。除直接鉴定外，本分析方法也可用作一独立方法对来自[³⁵S]GTPγS方法(如上述实例5中所示)的结果提供确认。

较佳地，可根据下列方案使用一改进的Flash Plate^TM腺苷酰环化酶试剂盒(NewEngland Nuclear；目录号SMP004A)将候选化合物直接鉴定为内源或非内源组成型活化的GPCR的反向激动剂和激动剂。

大约在转染后3天收集转染细胞。可通过对悬浮于含有20mM HEPES，pH 7.4和10mM MgCl₂的缓冲液中的细胞进行匀浆来制备膜。使用Brinkman Polytron^TM在冰上进行匀浆，大约匀浆10秒。将得到的匀浆液在4℃下以49,000×g离心15分钟。然后将所得沉淀重悬于含有20mM HEPES，pH 7.4和0.1mM EDTA的缓冲液中，匀浆10秒，然后在4℃下以49,000×g离心15分钟。然后，在使用前将所得沉淀保存于-80℃。在直接鉴定筛选当天，将膜沉淀于室温缓慢解冻，重悬于含有20mM HEPES，pH7.4和10mM MgCl₂的缓冲液中以得到0.60mg/ml的蛋白质终浓度(使用前将重悬的膜置于冰上)。

根据厂商说明书制备和保存cAMP标准和检测缓冲液[11ml检测缓冲液包含2μCi示踪剂([¹²⁵I]cAMP(100μl)]。用于筛选的分析缓冲液需新鲜制备并包含20mMHEPES，pH 7.4、10mM MgCl₂，20mM磷酸肌酸(Sigma)、0.1单位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μM GTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；然后在使用前将分析缓冲液保存于冰上。

较佳地，将候选化合物(3μl/孔；12μM的分析终浓度)连同40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl分析缓冲液一起添加至96-孔板各孔中。然后将这个混合物于室温培育30分钟，同时轻轻摇动。

培育之后，向各孔中添加100μl检测缓冲液，然后培育2至24小时。然后在WallacMicroBeta^TM板读数器中使用“Prot.#31”对各板进行读数(按照厂商说明书)。

举例说明而不限于，得到的代表性筛选分析板(96孔板)结果示于图1中。每一条形代表各孔中不同化合物的结果，所述“靶标GPCR”是一具组成型活性的内源Gs偶联GPCR的Gsα融合蛋白质构筑体。示于图1中的代表性结果也提供基于各板平均结果(“m”)的标准偏差，且该平均值以及两个用于通过初级筛选选择可作为前导物(“leads”)的反向激动剂的任意偏好涉及选择可将反应百分比降低至少平均板反应率的候选化合物减去两个标准偏差。相反，用于通过初级筛选选择可作为前导物(“leads”)的激动剂的任意偏好涉及选择可将反应百分比至少增加平均板反应率的候选化合物加上两个标准偏差。基于这些选择过程，将下列孔中的所述候选化合物分别直接鉴定为推定的针对孔A2和G9中所述内源GPCR的反向激动剂(化合物A)和激动剂(化合物B)。参见图1。为清晰起见应注意：这些化合物是在对所述GPCR内源配体没有任何了解的情况下直接鉴定出的。通过集中在基于受体功能而非化合物结合亲和力的分析技术，我们能够确定能够降低所述受体功能活性(化合物A)以及增加所述受体功能活性(化合物B)的化合物。

实例7

用于测量胞内钙浓度的荧光成像板读数器(Fluorometric Imaging Plate Reader：FLIPR)分析(与Gq相关的受体)

将来自各自克隆系的经靶标GPCR(实验物)和pCMV(阴性对照)稳定转染的细胞以5.5×10⁴个细胞/孔接种至用多聚-D-赖氨酸预处理的96-孔板(Becton-Dickinson，#356640)中以用于第二天的分析，各孔中含有完全培养基(附有10％FBS、2mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸钠的DMEM)。为制备Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培育缓冲液原液，将1mg Fluo4-AM溶解在467μl DMSO和467μl普流罗尼酸(Pluoronic acid)(Molecular Probe，#P3000)中以得到1mM的原液，所述原液可在-20℃下保存1个月。Fluo4-AM是一钙的荧光指示剂染料。

在洗涤缓冲液(1×HBSS/2.5mM丙磺舒(Probenicid)/20mM HEPES，pH 7.4)中制备候选化合物。

进行分析时，自各孔中去除培养基并向细胞中添加100μl的4μM Fluo4-AM/2.5mM丙磺舒(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培养基，pH 7.4。并将其在37℃/5％CO₂下培育，持续60分钟。

1小时培育过后，去除Fluo4-AM培育缓冲液并用100μl洗涤缓冲液将细胞洗涤2次。在各孔中留有100μl洗涤缓冲液。将板重新在37℃/5％CO2下培育60分钟。

按FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader；Molecular Device)程序在第30秒加入50μl候选化合物，并在又一150秒内记录由所述候选化合物引起的胞内钙浓度([Ca2+])的瞬时变化。通过FLIPR软件用总荧光变化数来确定激动剂活性。所述仪器软件将荧光读数归一化以给出零位时的等效起始读数。

在一些实施例中，包含靶标GPCR的细胞进一步包括不加选择的Gα15/16或嵌合的Gq/Giα亚基。

尽管前述提供一使用经稳定转染的细胞测定激动剂活性的FLIPR分析，但所属技术领域的技术人员能够易于对所述分析加以改进以鉴定拮抗剂活性。所述所属技术领域的技术人员也会易于了解可选择使用暂时转染细胞。

实例8

载黑色素细胞技术

载黑色素细胞是在低等脊椎动物中发现的皮肤细胞。其包含称作黑素体的着色细胞器。当G-蛋白偶联受体(GPCR)活化时，载黑色素细胞能够沿着微管网络系统重新分散这些黑素体。这种色素运动会导致细胞明显变亮或变暗。在载黑色素细胞中，由Gi偶联受体活化导致的胞内cAMP含量降低会引起黑素体向细胞中央的迁移，进而导致颜色显著变亮。如果Gs偶联受体活化后cAMP含量随之增加，那么，黑素体就会重新分散且细胞再次变暗。由Gq偶联受体活化导致的二酰甘油含量增加也可诱发这种重新分散。此外，本技术也适合研究某些受体酪氨酸激酶。受体活化数分钟内，载黑色素细胞就可产生反应并引起一简单而显著的颜色变化。所述反应易于检测，可使用一常规吸收微量板读数器或一普通视频成像系统进行检测。与其它皮肤细胞不同，载黑色素细胞来源自神经嵴，并似乎可表达信号蛋白的全部补体。具体而言，所述细胞可表达极广范围内的G-蛋白，并因此能够在功能上表达几乎所有GPCR。

可使用载黑色素细胞来鉴定针对GPCR的化合物，包括天然配体。本方法可通过引入属于色素细胞系的测试细胞来实施，所述细胞系能够根据特异性刺激分配或聚集其色素并表达一编码GPCR的外源克隆。一刺激物(例如，褪黑激素)可设定色素分配的起始状态，其中如果GPCR活化可诱发色素分散那么色素将聚集于测试细胞内。然而，用刺激物刺激细胞可设定色素分配的起始状态，其中如果GPCR活化可诱发色素聚集那么色素就会分散。然后使测试细胞与化学化合物接触，并测定所述细胞内色素分配相比于色素分配的起始状态是否发生变化。由于所述候选化合物(包括但不限于一配体)与GPCR偶联使色素分散时，在培养皿上细胞会发暗；而当色素聚集时，细胞会发亮。

材料和方法遵循美国专利第5,462,856号和美国专利第6,051,386号的揭示内容。这些专利揭示内容的全文以引用方式并入本文中。

将细胞铺于96-孔板中(一种受体对应一个板)。转染后48小时，用10nM褪黑激素处理每板细胞的一半。褪黑激素可活化载黑色素细胞中内源Gi偶联受体并使其将其色素聚集。将剩余的一半细胞转移至无血清培养基0.7XL-15(Gibco)中。1小时后，无血清培养基中的细胞保持在色素分散状态，而经褪黑激素处理的细胞处于色素聚集状态。此时，用反应剂量的测试化合物处理细胞。如果经铺板的GPCR与测试化合物结合，那么，预计载黑色素细胞会对所述化合物产生反应从而经历一颜色变化。如果受体是一Gs或Gq偶联受体，那么，褪黑激素聚集载黑色素细胞会经历色素分散。相反，如果受体是一Gi偶联受体，那么，预计产生色素分散的细胞会经历具剂量依赖性的色素聚集。

实例9

MAP激酶分析

可通过监测MAP激酶(促细胞分裂原活化激酶)来评估受体活化。MAP激酶可通过数种方法检测。一种方法是基于对磷酸化状态(非磷酸化(失活)或磷酸化(活性)状态)的评估。磷酸化蛋白质在SDS-PAGE中的迁移率较慢，因此可使用西方印迹将其与未受刺激的蛋白质加以比较。或者，可使用对磷酸化蛋白质具有特异性的抗体(New England Biolabs)，可用所述抗体检测磷酸化激酶的增加。在任一方法中，都要用测试化合物刺激细胞且随后用Laemmli缓冲液提取。将可溶部分加样至SDS-PAGE凝胶上并经电泳将蛋白质转移至硝酸纤维素或Immobilin中。通过标准Western印迹技术检测免疫反应带。将可见或化学发光信号记录在膜上并可通过光密度测定法来定量。

另一方法基于经由磷酸化分析对MAP激酶活性的评估。用测试化合物刺激细胞并制备可溶提取物。在30℃下将提取物与下列各物培育10分钟：γ-³²P-ATP、ATP再生系统和一MAP激酶的特异性底物(诸如由胰岛素调节的经磷酸化的热及酸稳定性蛋白质或PHAS-I)。所述反应可通过添加H₃PO₄来终止，并将样品转移至冰上。将一等分试样点在Whatman P81层析纸上，其上可保留磷酸化蛋白质。洗涤层析纸并用液体闪烁计数器对³²P进行计数。或者，将细胞提取物与γ-³²P-ATP、ATP再生系统和通过抗生蛋白链菌素结合至滤纸支撑上的髓磷脂碱性蛋白一起培育。髓磷脂碱性蛋白是一活化的MAP激酶的底物。磷酸化反应在30℃下实施10分钟。然后可通过滤膜抽吸出提取物，所述滤膜可保留磷酸化的髓磷脂碱性蛋白。洗涤滤膜并用液体闪烁计数器对³²P进行计数。

实例10

MAPK/ERK激酶激酶-1(MEKK1)分析

按照Minamino等人所述来测量活体外MEKK1激酶活性[Proc Natl Acad Sci USA(2002)99：3866-3871；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。简言之，用MEKK1的一级抗体(2μg)(目录号sc-252，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)对细胞裂解物(400μg)进行4小时的免疫沉淀，然后在4℃下与蛋白质G-琼脂糖凝胶(50％wt/vol，Amersham Pharmacia)一起培育2小时。使用GST-SEK1(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)作为底物。通过SDS/PAGE解析样品，然后用PhosphorImager(Molecular Probes)检测和定量磷酸化底物。

实例11

人类RUP40的组织分布

A.AFFYMETRIX GENECHIP^_技术

将核苷酸序列提供给Affymetrix进行设计并制造包含寡核苷酸的微阵列以便可使用其GeneChip_技术监测G蛋白偶联受体(GPCR)表达水平。在所述微阵列上也可存在用于鉴别来自Harvard Brain Bank或可从市售资源购得的人类脑组织的探针。根据厂商说明书扩增、标记RNA样品、使其与微阵列杂交并对数据加以分析。

可使用GeneChip来探测人类RUP40的表达谱。见图2。图2是一表示人类RUP40在各种组织中表达水平的曲线图。很明显，人类RUP40可在心脏、肺、主动脉和脂肪中高水平表达。人类RUP40在脾中表达水平较低。在心脏内，RUP40可由左心室高水平表达。也可在小鼠的心脏、肺和脂肪中见到RUP40的选择性表达(未显示)。

实例12

大鼠心脏中RUP40的免疫染色

使用肽NTGGWDSSGCTVEDDGRDNRDR(对应SEQ ID NO：4的氨基酸964至985)(SynPep，Dublin，CA)来制备针对大鼠RUP40的亲和纯化的多克隆兔抗体。将从一经麻醉的成年雌性Sprague-Dawley大鼠分离的心脏组织包埋在石蜡中以备切片。通过左心室制备一系列的6微米横切片并使用标准技术实施基于过氧化物酶的免疫组织化学检测。将来自未经免疫兔子的免疫球蛋白(目录号N1699，DakoCytomation，Carpinteria，CA)用作阴性对照。心肌细胞在整个胞质溶胶中显示出弥散染色，而在浆细胞膜上显示出较强的染色(图3)。

实例13

新生大鼠心室肌细胞(NRVM)RUP40的表达

原代细胞培养

如先前所述分离和培养新生大鼠心室肌细胞(NRVM)[Adams，JW等人，J BiolChem(1996)271：1179-86]。简言之，从1-至2-天龄的Sprague-Dawley大鼠幼仔中分离心脏并用胶原酶消化，然后通过Percoll梯度来纯化肌细胞。将细胞铺于预涂有1％明胶的组织培养板上并于4∶1的DMEM/培养基-199(附加有10％马血清、5％胎牛血清和抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养过夜。在铺板培养基中培养18小时后，用维持培养基(DMEM/培养基199，附加抗生素)洗涤肌细胞以去除死细胞和碎片并用维持培养基新鲜以用于后续实验。

RT-PCR

将如上所述从NRVM和成纤维细胞中分离的总RNA用作模板以根据厂商说明书使用RT PCR试剂盒(Becton Dickinson，Franklin，NJ)生成反转录DNA(RT-DNA)。通过PCR在RT-DNA样品中检测RUP40的表达。PCR条件是：96℃，2分钟；30个循环的96℃，30秒、55℃，30秒、72℃，2分钟；72℃，10分钟。

所用大鼠RUP40正向引物具有下列序列：

5′-GCCTGTCTAGTTGTGGAAGC-3′(SEQ ID NO：11)。

所用大鼠RUP40反向引物具有下列序列：

5′-GGTGTCCTCCCAGTTGAGCCAACA-3′(SEQ ID NO：12)。

经扩增的大鼠RUP40DNA产物大小为403个碱基对。将G3PDH扩增物(BectonDickinson，Franklin，NJ)加至各PCR反应物中以作为一内部对照。

结果

发现RUP40可在心肌细胞中表达。结果示于图4中。RT-PCR显示，新生心室肌细胞(NRVM)中的RUP40转录物表达在无血清(SFM)条件下保持24小时不变。添加佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)后24小时肌细胞RUP40转录物含量急剧下降，但在向培养基中添加去氧肾上腺素(PE)或前列腺素F2α(PG)后保持升高。应注意，原代心室成纤维细胞(Fibro)中RUP40表达水平几乎检测不到。G3PDH PCR产物显示用于PCR反应的模板水平相等且凝胶上样量一致。扩增具有模板依赖性，如由凝胶的“-”泳道(对应不存在模板的扩增)所指示。大鼠心室肌细胞的RUP40表达与在实例11中测定并示于图2中的人类和小鼠(未显示)RUP40表达谱相一致。

实例14

心肌细胞中RUP40的过表达可导致IP3积累增加

原代细胞培养

如先前所述分离和培养新生大鼠心室肌细胞(NRVM)[Adams，JW等人，J BiolChem(1996)271：1179-86；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中1。简言之，从1-至2-天龄的Sprague-Dawley大鼠幼仔中分离心脏并用胶原酶消化，然后通过Percoll梯度传代来纯化肌细胞。将细胞以0.2×10⁶个细胞/孔铺于涂有明胶的24孔板上并于4∶1的DMEM/培养基-199(附加有10％马血清、5％胎牛血清和抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养过夜。在铺板培养基中培养18小时后，用维持培养基(DMEM/培养基199，附加抗生素)洗涤肌细胞以去除死细胞和碎片并用维持培养基更新以用于后续实验。

RUP40腺病毒载体构建

对于腺病毒实验s，首先将编码SEQ ID NO：2的人类RUP40多肽的SEQ ID NO：1多核苷酸亚克隆至pShuttleCMV(Qbiogene，Carlsbad，CA)中，然后在HEK293细胞中通过同源重组产生重组腺病毒RUP40(AdRUP40)。

腺病毒感染

铺板培养期过后，将肌细胞换至如上所述的维持培养基中，并立即用重组腺病毒感染或进行模拟感染。用腺病毒载体感染NRVM的实施先前已有阐述[Adams，JW等人，Circ Res(2000)87：1180-7]。在0.1至500PFU/细胞的剂量范围内最优感染倍率(MOI)经测定为每个细胞20至50个噬斑形成单位(PFU)。20PFU/细胞的MOI会产生高于95％的感染效率[如在用此对照病毒感染的NRVM中由绿色荧光蛋白(GFP)表达所测定]，同时用编码GPF的对照腺病毒(AdGFP)感染后的前48小时内无任何细胞毒性。

IP3分析

将腺病毒感染的肌细胞在含2μCi/ml[³H]肌醇的维持培养基中培育18至24小时，然后在经20mM HEPES缓冲的培养基中添加含10mM LiCl的分析培养基。置于分析缓冲液中30分钟后，用冷酸(0.1M甲酸)固定细胞，并将裂解物转移至含Dowex100-200目(甲酸盐型)树脂珠粒的柱子上。用1M甲酸铵和0.1M甲酸洗脱肌醇并通过液体闪烁计数来定量。

结果

如由Anova/Bonferroni ad hoc统计学分析确定，心肌细胞内RUP40的过表达刺激IP3积累增加。因此，在所述分析条件下过表达的RUP40表现出组成型Gq偶联活性水平。结果示于图5中。

实例15

RUP40过表达可刺激心肌细胞肥大和心房利尿钠因子(ANF)表达

原代细胞培养

如先前所述[Adams，JW等人，J Biol Chem(1996)271：1179-86]和实例14中所述来制备新生大鼠心室肌细胞(NRVM)。

RUP40腺病毒载体构建

腺病毒感染

如实例11中所述来实施RUP40腺病毒载体构建和腺病毒感染。

结果：肥大

RUP40过表达刺激了心肌细胞肥大。结果示于图6A中。由AdRUP40感染(以每细胞20个噬斑形成单位(PFU)感染48小时)的NRMV相比于由AdGFP对照病毒感染的对照细胞显示出细胞大小增加。

结果：心房利尿钠因子(ANF)表达

RUP40过表达刺激了心肌细胞心房利尿钠因子(ANF)表达。结果示于图6B中，其显示内源ANF转录物表达平和重组人类RUP40转录物表达水平。用编码人类RUP40的重组腺病毒或对照腺病毒(AdGFP)以20PFU/细胞的感染复数处理NRVM。腺病毒感染后24小时，分离总RNA并实施北方印迹分析以测定经病毒表达的RUP40含量。将由核苷酸2,858至3,606构成的大鼠RUP40cDNA片段作为探针。用探针探测相同膜的心房利尿钠因子(ANF)——心肌细胞肥大的遗传标记物——的表达[Rockman等人，Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：8277-81]。用[³²P]通过随机引物法标记探针。此外，用亚甲蓝对膜进行染色以确认RNA的等量上样和转移。

实例16

横向主动脉结扎(TAC)引起的压力超负荷条件下RUP40的心肌表达

横向主动脉结扎(TAC)

如先前所述[Rockman，HA等人，Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：8277-81]在小鼠中实施横向主动脉的手术结扎。简言之，用一氯胺酮(ketamine)和赛拉嗪(xylazine)的混合物麻醉8周龄小鼠(C57/BL6)。在一解剖显微镜下，通过显微外科技术实施中线颈部切开术以暴露气管和颈动脉。成功进行气管内插管后，将插管与容积循环式啮齿类动物呼吸机(Harvard Apparatus)相连，以0.2ml换气量和110/分钟的呼吸速率补充氧气。通过一小切口从位于左上胸骨缘的第二肋间隙进入胸腔，并用一系于27号针上的7-0尼龙缝线结扎线实施主动脉结扎，当将针去除时可使直径缩小0.4mm并形成一可再生的65至70％的横向主动脉结扎(TAC)。主动脉绑扎后抽空气胸并拔除动物的插管然后使其苏醒。对照模拟手术的小鼠接受手术但不对其实施横向主动脉结扎(TAC)。术后7天，对存活的动物实施安乐死并通过逆向灌注福尔马林来固定心脏。

将固定的心脏组织包埋于OCT：Aqua Mount(VWR，#41799-008，West Chester，PA)为50∶50的混合物中并于干冰/乙醇中冷冻。将组织包埋块保存在-80℃直至进行冷冻切片。进行冷冻切片后，将组织切片于-20℃下保存在密封的载玻片盒中。

原位杂交

将SEQ ID NO：5的小鼠RUP40多核苷酸亚克隆至PCRII-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中介于SP6和T7启动子之间的一位点处。基本上按照厂商说明书使用SP6RNA聚合酶(来自Promega RiboProbe转录试剂盒(#P1460；Madison，WT))来制备互补于SEQ ID NO：5多核苷酸的经[³⁵S]-放射标记的反义小鼠RUP40mRNA探针。使用T7RNA聚合酶以类似方法制备放射标记的对照有义探针。

将固定的组织切片解冻并立即于室温下对其实施一系列的后固定培育：PBS，3分钟；10％福尔马林，10分钟；PBS，10分钟；和PBS，10分钟。

然后对组织切片实施透化作用和乙酰化作用。为此，使组织切片与蛋白酶K(0.001％蛋白酶K，存于0.5M Tris，0.25M EDTA，pH 8.0中)一起在37℃下培育10分钟，随后于室温下用水洗涤5分钟。然后使组织切片与三乙醇胺缓冲液(0.1MTEA，pH 8.0)一起于室温下培育5分钟，接着与存于0.1M TEA(pH 8.0)的2.5％乙酸酐一起于室温下培育5分钟。然后将组织切片与下列各物在室温下各培育2分钟：2×SSC；50％乙醇；95％乙醇和100％乙醇。然后将组织切片在空气中干燥并于干燥条件下保存直至第二天杂交。

在60℃下于0.47M NaCl、54％甲酰胺中(每个切片所用体积为80至100μl)实施组织切片杂交，时间为20小时。放射标记探针的使用浓度为1×10⁷cpm/ml。然后用4×SSC将组织切片于室温洗涤4次，每次10分钟。在37℃下与RNase A(20μg/ml，存于0.5M NaCl、10mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0中)一起培育30分钟以消化未杂交的探针。然后用2×SSC将组织切片于室温洗涤2次，每次5分钟，接着用1×SSC于室温洗涤1次，时间10分钟，之后用0.5×SSC于室温洗涤1次，时间10分钟。然后在65℃下用0.1×SSC将组织切片洗涤30分钟，之后用0.1×SSC于室温洗涤5分钟，然后于酒精中脱水。

然后使已接受杂交的组织切片在X-射线胶片上曝光并通过放射自显影显现RUP40杂交信号。为此，使组织切片在Biomax MR胶片上曝光1天、4天且随后1周。放射自显影后，将组织切片浸入感光乳剂中，使用NTB-2液体感光乳剂(VWR，#B1654433，West Chester，PA)。将浸入感光乳剂中的组织切片在感光乳剂中曝光1周且随后显色。显色后，用双苯酰亚胺(0.001％，存于PBS中)复染组织切片并盖上盖玻片。用暗视野聚光器(银颗粒呈现白色)和DAPI荧光滤镜(filter cube)(以观察发荧光的双苯酰亚胺复染剂)对组织切片进行拍照。

结果

在由横向主动脉结扎(TAC)引起的压力超负荷条件下，RUP40mRNA的增大含量保持不变或稍有增加。结果示于图7中。原位杂交显示，成年小鼠心脏中存在广泛的心肌表达。反义RUP40放射标记的Riboprobe在心脏各腔中都检测到RUP40表达。将有义对照Riboprobe用在另一些来自接受模拟手术对照小鼠的切片上，作为指示心脏切片探针标记信噪比的阴性对照。

实例17

肥大性心肌病的活体内动物模型

使用Rockman等人的活体内动物模型可显示本发明化合物具有预防或治疗肥大性心肌病的功效[Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：8277-81；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]，仅为阐明而非意欲限制，其中使小鼠经历由横向主动脉结扎(TAC)引起的压力超负荷条件。在一些实施例中，所述化合物是一反向激动剂或拮抗剂。所述化合物可经腹膜腔内注射施用。较佳剂量是0.1至100mg/kg。其它较佳剂量选自由0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg组成的群组。安慰剂组仅单独施用媒剂。

如先前所述[Rockman，HA等人，Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：8277-81]在小鼠中实施横向主动脉的手术结扎。简言之，用一氯胺酮和赛拉嗪的混合物麻醉8周龄小鼠(C57/BL6)。在一解剖显微镜下，通过显微外科技术实施中线颈部切开术以暴露气管和颈动脉。成功进行气管内插管后，将插管与容积循环式啮齿类动物呼吸机(Harvard Apparatus)相连，以0.2ml换气量和110/分钟的呼吸速率补充氧气。通过一小切口从位于左上胸骨缘的第二肋间隙进入胸腔，并用一系于27号针上的7-0尼龙缝线结扎线实施主动脉结扎，当将针去除时可使直径缩小0.4mm并形成一可再生的65至70％的横向主动脉结扎(TAC)。主动脉绑扎后抽空气胸并拔除动物的插管然后使其苏醒。对照模拟手术的小鼠接受手术但不对其实施横向主动脉结扎(TAC)。每天经腹膜腔内注射施用一定剂量的测试化合物或单独施用媒剂。术后7天，对存活动物实施安乐死并评定数个肥大性心肌病参数[Rockman，HA等人，Proc Natl Acad SciUSA(1991)88：8277-81]。

评定心脏湿重和干重。评定心脏湿重和干重/体重的比值。评定肌细胞横截面积(细胞核处的平均细胞面积)。评定心房利尿钠因子(ANF)基因在mRNA含量上的诱导。当施用所述化合物时心脏湿重或干重降低、心脏湿重或干重/体重的比值降低、肌细胞横截面积降低或ANF基因的诱导水平降低表示所述化合物具有预防或治疗肥大性心肌病的用途。

实例18

口服生物利用度

用于直接评定口服生物利用度的物理化学分析方法为所属技术领域的技术人员所熟知并可采用[参见，举例说明但不限于：Wong PC等人，Cardiovasc Drug Rev(2002)20：137-52；和Buchan P等人，Headache(2002)Suppl 2：S54-62；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。仅为进一步阐明而非限制，所述替代分析方法可包括液相色谱-串联质谱[Chavez-Eng CM等人，J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767：117-29；Jetter A等人，Clin Pharmacol Ther(2002)71：21-9；ZimmermanJJ等人，J Clin Pharmacol(1999)39：1155-61；和Barrish A等人，Rapid Commun MassSpectrom(1996)10：1033-7；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

正电子发射断层显像(PET)已成功用于达成对哺乳动物口服药物后体内药物分布(包括口服生物利用度)的直接测量[Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)29：1031-8；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

或者，本发明调节剂的口服生物利用度可根据(例如，仅为阐明而非限制)通过实例17小鼠模型而形成的活体内数据来确定。所述调节剂以自0.1mg kg^-1至100mgkg^-1范围内的剂量通过口服管饲法施用。显示所述调节剂的口服施用具有预防或治疗肥大性心肌病的用途。显示所述调节剂的效应具有剂量依赖性并可与腹膜腔内施用后的效应相当。对通过口服施用达到心脏湿重或干重、心脏湿重或干重/体重的比值、肌细胞横截面积或ANF基因诱导水平的最大降低量的一半时所需的调节剂剂量与通过腹膜腔内施用达到心脏湿重或干重、心脏湿重或干重/体重的比值、肌细胞横截面积或ANF基因诱导水平的最大降低量的一半时所需的调节剂剂量进行比较。仅为阐明目的，如果所述口服剂量是所述腹膜腔内剂量的两倍，那么所述调节剂的口服生物利用度将为50％。一般而言，如果所述口服剂量是θmg kg^-1且所述腹膜腔内剂量是ρmgkg^-1，那么所述调节剂的口服生物利用度以百分比表示将达到[(ρ/θ)×100]。在一些实施例中，所述调节剂是一反向激动剂或拮抗剂。

任一所属技术领域的技术人员将易于了解，本发明调节剂口服生物利用度的测定可使用一不同于本文所呈现者(仅为阐明但不限于)的活体内动物模型实施。易于预想，所述的参照施用途径可以是一不同于腹膜腔内施用的途径。在一些实施例中，所述参照施用途径可以是静脉内施用。

实例19

包含人类RUP40 GPCR表达的转基因小鼠/大鼠/猪

本发明也提供与包含人类RUP40 GPCR表达的转基因非人类哺乳动物有关的方法和组合物，所述受体包含一自下列组成的群组选出的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1至1,346；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1至990；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸991至1,346；和

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸954至997；

或所述SEQ ID NO：2氨基酸序列的一生物活性片段；或所述SEQ ID NO：2氨基酸序列或其所述生物活性片段的一组成型活化突变体。在一些实施例中，所述非人类哺乳动物是一小鼠、大鼠或猪。

用于产生转基因动物(诸如小鼠、大鼠和猪)的方法为所属技术领域的技术人员所熟知，且任何此种方法皆可用于本发明中。简言之，可通过(例如)用编码一人类RUP40 GPCR的多核苷酸(“转基因”)转染一多能干细胞(诸如ES细胞)来产生转基因哺乳动物。然后可将成功转化的ES细胞导入一早期胚胎中，随后将所述早期胚胎植入一相同种类哺乳动物的子宫中。在某些情形中，所述转化(“转基因”)细胞将构成所得动物种系的一部分，且包含该种系中的转基因细胞的成年动物可与其它动物交配，从而最终产生一在其每一细胞中均具有转基因并能够将转基因稳定传给其各个后代的转基因动物群体。可使用导入多核苷酸的其它方法，例如，可通过显微注射将编码一人类RUP40 GPCR的多核苷酸导入一受精卵或早期胚胎中。或者，可通过用一含有所述转基因的逆转录病毒感染合子将转基因导入动物中[Jaenisch，R，ProcNatl Acad Sci USA(1976)73：1260-4]。用于产生转基因哺乳动物的方法阐述于下列文献和专利中：例如，Wall等人，J Cell Biochem(1992)49：113-20；Hogan等人，Manipulatingthe Mouse Embryo.A Laboratory Manual.(1986)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Costa等人，FASEB J(1999)13：1762-73；WO 91/08216；美国专利第4,736,866号；和美国专利第6,504,080号；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中。

在一些实施例中，所述人类RUP40 GPCR的表达具有心肌细胞选择性。在一些实施例中，所述人类RUP40 GPCR的所述心肌细胞选择性表达由α肌球蛋白重链启动子赋予[Subramaniam A等人，J Biol Chem(1991)266：24613-20；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

实例20

肥大性心肌病的活体内转基因动物模型

使用实例19中所述的活体内转基因动物模型可显示，一本发明化合物具有预防或治疗心血管疾病的功效，其中所述转基因动物与野生型对照动物相比展现出易患或出现肥大性心肌病。所述心血管疾病包括心脏病，尤其是肥大性心肌病和充血性心力衰竭。如果所述动物在任何年龄与年龄相配的野生型对照动物相比皆显示出心脏湿重或干重增加、心脏湿重或干重/体重的比值增加、肌细胞横截面积增加或ANF基因诱导水平增加，则认为所述转基因动物展现出所述易患或出现肥大性心肌病。在一些实施例中，所述动物是小鼠。

可通过在肥大性心肌病表型发作之前向所述转基因动物施用所述化合物和测定所述施用是否能够预防由仅单独施用给媒剂的所述转基因动物展现的所述肥大性心肌病表型来评定所述化合物预防所述心血管疾病的功效。如果施用所述化合物可预防由仅单独施用给媒剂的所述转基因动物展现的心脏湿重或干重增加、心脏湿重或干重/体重的比值增加、肌细胞横截面积增加或ANF基因诱导水平增加，那么可表明所述化合物具有预防所述心血管疾病的功效。

可通过在肥大性心肌病表型发作之后向所述转基因动物施用所述化合物和测定所述施用是否能够抑制或改善肥大性心肌病来评定所述化合物治疗所述心血管疾病的功效。如果施用所述化合物可抑制或改善由仅单独施用给媒剂的所述转基因动物展现的心脏湿重或干重增加、心脏湿重或干重/体重的比值增加、肌细胞横截面积增加或ANF基因诱导水平增加，那么可表明所述化合物具有抑制或改善所述心血管疾病的功效。

在一些实施例中，所述化合物是一反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述化合物通过腹膜腔内注射施用。较佳剂量是0.1至100mg/kg。其它较佳剂量选自由0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg组成的群组。安慰剂组仅单独施用媒剂。在一些实施例中，所述剂量每日施用。在一些实施例中，所述剂量的施用持续一段时间(选自1周、2周、3周和4周)。应注意，所述施用途径、所述剂量范围、所述剂量施用频次和所述剂量施用持续时间仅为阐明并非意欲限制本发明。

实例21

包含一RUP40基因内破坏的转基因小鼠/大鼠/猪

小鼠

一较佳DNA构筑体从5′-末端到3′-末端将包括：(a)第一核苷酸序列，其包含在小鼠RUP40基因组序列中；(b)包含一正选择标记基因(诸如新霉素抗性标记基因(neo)的核苷酸序列；和(c)第二核苷酸序列，其包含在小鼠RUP40基因组序列中并位于第一个小鼠RUP40基因组核苷酸序列(a)的下游。可使用所属技术领域的技术人员熟知的方法分离小鼠RUP40基因组序列(Maniatis T等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，其揭示内容的全文以引用方式并入本文中)。用于所述小鼠RUP40基因组序列分离的探针可来自编码一小鼠RUP40多肽的cDNA，其中所述cDNA可以来自小鼠心脏、肺或脂肪组织的mRNA为模板获得。

在较佳实施例中，所述DNA构筑体也包括一位于核苷酸序列(a)上游或核苷酸序列(c)下游的负选择标记基因。较佳地，所述负选择标记基因包括胸苷激酶(tk)基因[Thomas等人，Cell(1986)44：419-28]、潮霉素β基因[Te Riele等人，Nature(1990)348：649-51]、hprt基因[Van der Lugt等人，Gene(1991)105：263-7；Reid等人，Proc NatlAcad Sci USA(1990)87：4299-4303]或白喉毒素A片段(Dt-A)基因[Nada等人，Cell(1993)73：1125-35；Yagi等人，Proc Natl Acad Sci USA(1990)87：9918-9922]，所述文献揭示内容的全文以引用方式并入本文中。较佳地，正选择标记基因位于一小鼠RUP40外显子序列内部以使编码一小鼠RUP40多肽的序列中断。这些置换载体阐述于下列文献中，例如，Thomas等人，Cell(1986)44：419-28；Thomas等人，Cell(1987)51：503-12；Mansour等人，Nature(1988)336：348-52；Koller等人，Annu Rev Immunol(1992)10：705-30；和美国专利第5,631,153号；所述文献和专利揭示内容的全文以引用方式并入本文中。

第一和第二核苷酸序列(a)和(c)可独立定位于下列序列内：一小鼠RUP40调节序列、一内含子序列、一外显子序列或一包含调节及/或内含子及/或外显子序列的序列。核苷酸序列(a)和(c)的大小在1至50kb范围内，较佳地，在1至10kb，更佳地，在2至6kb范围内，且最佳地，在2至4kb范围内。

用于产生一转基因小鼠(包含一所选基因内的破坏)的方法为所属技术领域的技术人员所熟知并已成功利用其使许多基因失活。

大鼠

可使用类似或替代方法[参见例如，Zan等人，Nature Biotechnology(2003)21：645-51；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]产生一包含一RUP40基因内破坏的转基因大鼠。

猪

可使用类似或替代方法产生一包含一RUP40基因内破坏的转基因猪[参见例如，Lai等人，Science(2002)295：1089-1092；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

Cre-LoxP系统：

在一RUP40基因内包含心肌细胞选择性破坏的转基因小鼠/大鼠/猪

这些新DNA构筑体可采用P1噬菌体的位点特异性重组系统。P1噬菌体具有一称作Cre的重组酶，其可与一34个碱基对的loxP位点相互作用。loxP位点由2个13bp回文序列和一将二者隔开的8bp保守序列构成[Hoess RH等人，Nucleic Acids Res(1986)14：2287-300；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。由Cre酶介导的2个同向loxP位点之间的重组会引起DNA片段的删除。

Cre-loxP系统与同源重组技术的联合使用已首先由Gu等人阐述[Gu H等人，Cell(1993)73：1155-64；Gu H等人，Science(1994)265：103-6；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。简言之，将一感兴趣的拟插入至基因组目标位置的核苷酸序列置于至少2个同向loxP位点之间，并且所述loxP位点需分别位于一拟自重组基因组中切除的核苷酸序列的两个末端处。切除事件的发生需要在重组细胞宿主细胞核中存在重组酶(Cre)。可分别通过下列方式在所需时间引入重组酶：(a)将重组细胞宿主于含有这种酶的培养基中培育、将Cre酶直接注射进所需细胞中，诸如通过脂质转染法将酶注入细胞，如由Baubonis等人所述[Baubonis W和Sauer B，Nucleic Acids Res(1993)21：2025-9；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]；(b)用一包含Cre编码序列(以可操作性方式连到在所述重组细胞宿主可行使功能的启动子上)的载体转染细胞宿主，其中启动子视情况可受到诱导，所述载体可被导入重组细胞宿主中，例如由Gu等人所述[Gu H等人，Cell(1993)73：1155-64；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]和Sauer等人[Sauer B和Henderson N，Proc Natl Acad Sci USA(1988)85：5166-70；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]；(c)将一包含Cre编码序列(以可操作性方式连到在所述重组细胞宿主可行使功能的启动子上)的多核苷酸导入细胞宿主基因组，其中启动子视情况可受到诱导，且可通过随机插入事件或同源重组事件将所述多核苷酸插入至细胞宿主基因组中，例如由Gu等人所述[Gu H等人，Science(1994)265：103-6；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

使用Cre-loxP系统的载体和方法阐述于下列文献中：例如，Zou等人(1994)；Minamisawa S等人，J Biol Chem(1999)274：10066-70；Chen等人，J Biol Chem(1998)273：1252-6；Chen等人，Development(1998)125：1943-9；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中。

在本发明较佳实施例中，通过上述策略(c)将Cre导入至细胞宿主基因组中，其中所述启动子具有心肌细胞选择性并可导致(以loxP为侧翼序列的；“在序列两侧加上loxP位点的”)小鼠RUP40基因组序列的心肌细胞选择性破坏。在一些实施例中，所述心肌细胞选择性启动子是肌球细胞轻链2(mlc-2v)心室特异性同型异构体的启动子[Minamisawa S等人，J Biol Chem(1999)274：10066-70；Chen等人，J Biol Chem(1998)273：1252-6；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。已对包含Cre重组酶编码序列在内源mlc-2v基因座处插入的转基因小鼠(“敲入mlc-2v cre的小鼠”)加以阐述[Chen等人，Development(1998)125：1943-9；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。用于在一所选基因两侧加上loxP位点的方法为所属技术领域的技术人员所熟知[参见例如，Chen等人，Development(1998)125：1943-9]。

在一些实施例中，本发明特征是一产生一转基因小鼠(包含一RUP40基因的心肌细胞选择性破坏)的方法，其包括使mlc-2cre等位基因(如上所述)与一在两侧加上loxP位点的RUP40基因相杂交。

用于产生一转基因小鼠(包含一RUP40基因内的心肌细胞选择性破坏)的其它方法为所属技术领域的技术人员所熟知；参见例如，Kuhn R和Torres RM，Methods MolBiol(2002)180：175-204；Sauer B，Methods(1998)14：381-92；Gutstein DE等人Circulation Research(2001)88：333；Minamino T等人，Circulation Research(2001)88：587；和Bex A等人，J Urol(2002)168：2641-2644；各自揭示内容的全文以引用方式并入本文中。

大鼠

可使用类似或替代方法[参见例如，Zan等人，Nature Biotechnology(2003)21：645-51；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]产生一包含一RUP40基因内心肌细胞选择性破坏的转基因大鼠。

猪

可使用类似或替代方法产生一包含一RUP40基因内心肌细胞选择性破坏的转基因猪[参见例如，Lai等人，Science(2002)295：1089-1092；其揭示内容的全文以引用方式并入本文中]。

                         序列表

序列表

<110>艾尼纳制药公司

<120>用于治疗心血管疾病的人类G蛋白偶联受体及其调节剂

<130>60.WO1

<150>60/480,046

<151>2003-06-20

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>4041

<212>DNA

<213>人类

<400>1

atgaaatccc caaggagaac cactttgtgc ctcatgttta ttgtgattta ttcttccaaa     60

gctgcactga actggaatta cgagtctact attcatcctt tgagtcttca tgaacatgaa    120

ccagctggtg aagaggcact gaggcaaaaa cgagccgttg ccacaaaaag tcctacggct    180

gaagaataca ctgttaatat tgagatcagt tttgaaaatg catccttcct ggatcctatc    240

aaagcctact tgaacagcct cagttttcca attcatggga ataacactga ccaaattact    300

gacattttga gcataaatgt gacaacagtc tgcagacctg ctggaaatga aatctggtgc    360

tcctgcgaga caggttatgg gtggcctcgg gaaaggtgtc ttcacaatct catttgtcaa    420

gagcgtgacg tcttcctccc agggcaccat tgcagttgcc ttaaagaact gcctcccaat    480

ggaccttttt gcctgcttca ggaagatgtt accctgaaca tgagagtcag actaaatgta    540

ggctttcaag aagacctcat gaacacttcc tccgccctct ataggtccta caagaccgac    600

ttggaaacag cgttccggaa gggttacgga attttaccag gcttcaaggg cgtgactgtg    660

acagggttca agtctggaag tgtggttgtg acatatgaag tcaagactac accaccatca    720

cttgagttaa tacataaagc caatgaacaa gttgtacaga gcctcaatca gacctacaaa    780

atggactaca actcctttca agcagttact atcaatgaaa gcaatttctt tgtcacacca    840

gaaatcatct ttgaagggga cacagtcagt ctggtgtgtg aaaaggaagt tttgtcctcc    900

aatgtgtctt ggcgctatga agaacagcag ttggaaatcc agaacagcag cagattctcg    960

atttacaccg cacttttcaa caacatgact tcggtgtcca agctcaccat ccacaacatc   1020

actccaggtg atgcaggtga atatgtttgc aaactgatat tagacatttt tgaatatgag   1080

tgcaagaaga aaatagatgt tatgcccatc caaattttgg caaatgaaga aatgaaggtg   1140

atgtgcgaca acaatcctgt atctttgaac tgctgcagtc agggtaatgt taattggagc   1200

aaagtagaat ggaagcagga aggaaaaata aatattccag gaacccctga gacagacata   1260

gattctagct gcagcagata caccctcaag gctgatggaa cccagtgccc aagcgggtcg   1320

tctggaacaa cagtcatcta cacttgtgag ttcatcagtg cctatggagc cagaggcagt   1380

gcaaacataa aagtgacatt catctctgtg gccaatctaa caataacccc ggacccaatt   1440

tctgtttctg agggacaaaa cttttctata aaatgcatca gtgatgtgag taactatgat   1500

gaggtttatt ggaacacttc tgctggaatt aaaatatacc aaagatttta taccacgagg   1560

aggtatcttg atggagcaga atcagtactg acagtcaaga cctcgaccag ggagtggaat   1620

ggaacctatc actgcatatt tagatataag aattcataca gtattgcaac caaagacgtc   1680

attgttcacc cgctgcctct aaagctgaac atcatggttg atcctttgga agctactgtt   1740

tcatgcagtg gttcccatca catcaagtgc tgcatagagg aggatggaga ctacaaagtt   1800

actttccata tgggttcctc atcccttcct gctgcaaaag aagttaacaa aaaacaagtg   1860

tgctacaaac acaatttcaa tgcaagctca gtttcctggt gttcaaaaac tgttgatgtg   1920

tgttgtcact ttaccaatgc tgctaataat tcagtttgga gcccatctat gaagctgaat   1980

ctggttcctg gggaaaacat cacatgccag gatcccgtaa taggtgtcgg agagccgggg   2040

aaagtcatcc agaagctatg ccggttctca aacgttccca gcagccctga gagtcccatt   2100

ggcgggacca tcacttacaa atgtgtaggc tcccagtggg aggagaagag aaatgactgc   2160

atctctgccc caataaacag tctgctccag atggctaagg ctttgatcaa gagcccctct   2220

caggatgaga tgctccctac atacctgaag gatctttcta ttagcataga caaagcggaa   2280

catgaaatca gctcttctcc tgggagtctg ggagccatta ttaacatcct tgatctgctc   2340

tcaacagttc caacccaagt aaattcagaa atgatgacgc acgtgctctc tacggttaat   2400

gtcatccttg gcaagcccgt cttgaacacc tggaaggttt tacaacagca atggaccaat   2460

cagagttcac agctactaca ttcagtggaa agattttccc aagcattaca gtcaggagat   2520

agccctcctt tgtccttctc ccaaactaat gtgcagatga gcagcacggt aatcaagtcc   2580

agccacccag aaacctatca acagaggttt gttttcccat actttgacct ctggggcaat   2640

gtggtcattg acaagagcta tctagaaaac ttgcagtcgg attcgtctat tgtcaccatg   2700

gctttcccaa ctctccaagc catccttgct caggatatcc aggaaaataa ctttgcagag   2760

agcttagtga tgacaaccac tgtcagccac aatacgacta tgccattcag gatttcaatg   2820

acttttaaga acaatagccc ttcaggcggc gaaacgaagt gtgtcttctg gaacttcagg   2880

cttgccaaca acacaggggg gtgggacagc agtgggtgct atgttgaaga aggtgatggg   2940

gacaatgtca cctgtatctg tgaccaccta acatcattct ccatcctcat gtcccctgac    3000

tccccagatc ctagttctct cctgggaata ctcctggata ttatttctta tgttggggtg    3060

ggcttttcca tcttgagctt ggcagcctgt ctagttgtgg aagctgtggt gtggaaatcg    3120

gtgaccaaga atcggacttc ttatatgcgc cacacctgca tagtgaatat cgctgcctcc    3180

cttctggtcg ccaacacctg gttcattgtg gtcgctgcca tccaggacaa tcgctacata    3240

ctctgcaaga cagcctgtgt ggctgccacc ttcttcatcc acttcttcta cctcagcgtc    3300

ttcttctgga tgctgacact gggcctcatg ctgttctatc gcctggtttt cattctgcat    3360

gaaacaagca ggtccactca gaaagccatt gccttctgtc ttggctatgg ctgcccactt    3420

gccatctcgg tcatcacgct gggagccacc cagccccggg aagtctatac gaggaagaat    3480

gtctgttggc tcaactggga ggacaccaag gccctgctgg ctttcgccat cccagcactg    3540

atcattgtgg tggtgaacat aaccatcact attgtggtca tcaccaagat cctgaggcct    3600

tccattggag acaagccatg caagcaggag aagagcagcc tgtttcagat cagcaagagc    3660

attggggtcc tcacaccact cttgggcctc acttggggtt ttggtctcac cactgtgttc    3720

ccagggacca accttgtgtt ccatatcata tttgccatcc tcaatgtctt ccagggatta    3780

ttcattttac tctttggatg cctctgggat ctgaaggtac aggaagcttt gctgaataag    3840

ttttcattgt cgagatggtc ttcacagcac tcaaagtcaa catccctggg ttcatccaca    3900

cctgtgtttt ctatgagttc tccaatatca aggagattta acaatttgtt tggtaaaaca    3960

ggaacgtata atgtttccac cccagaagca accagctcat ccctggaaaa ctcatccagt    4020

gcttcttcgt tgctcaacta a                                              4041

<210>2

<211>1346

<212>PRT

<213>人类

<221>变体

<222>604

<223>多形氨基酸Met或Thr

<221>变体

<222>801

<223>多形氨基酸Val或Ile

<221>变体

<222>856

<223>多形氨基酸Thr或Met

<400>2

Met Lys Ser Pro Arg Arg Thr Thr Leu Cys Leu Met Phe Ile Val Ile

1               5                   10                  15

Tyr Ser Ser Lys Ala Ala Leu Asn Trp Asn Tyr Glu Ser Thr Ile His

            20                  25                  30

Pro Leu Ser Leu His Glu His Glu Pro Ala Gly Glu Glu Ala Leu Arg

        35                  40                  45

Gln Lys Arg Ala Val Ala Thr Lys Ser Pro Thr Ala Glu Glu Tyr Thr

    50                  55                  60

Val Asn Ile Glu Ile Ser Phe Glu Asn Ala Ser Phe Leu Asp Pro Ile

65                  70                  75                  80

Lys Ala Tyr Leu Asn Ser Leu Ser Phe Pro Ile His Gly Asn Asn Thr

                85                  90                  95

Asp Gln Ile Thr Asp Ile Leu Ser Ile Asn Val Thr Thr Val Cys Arg

            100                 105                 110

Pro Ala Gly Asn Glu Ile Trp Cys Ser Cys Glu Thr Gly Tyr Gly Trp

        115                 120                 125

Pro Arg Glu Arg Cys Leu His Asn Leu Ile Cys Gln Glu Arg Asp Val

    130                 135                 140

Phe Leu Pro Gly His His Cys Ser Cys Leu Lys Glu Leu Pro Pro Asn

145                 150                 155                 160

Gly Pro Phe Cys Leu Leu Gln Glu Asp Val Thr Leu Asn Met Arg Val

                165                 170                 175

Arg Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Asp Leu Met Asn Thr Ser Ser Ala

            180                 185                 190

Leu Tyr Arg Ser Tyr Lys Thr Asp Leu Glu Thr Ala Phe Arg Lys Gly

        195                 200                 205

Tyr Gly Ile Leu Pro Gly Phe Lys Gly Val Thr Val Thr Gly Phe Lys

    210                 215                 220

Ser Gly Ser Val Val Val Thr Tyr Glu Val Lys Thr Thr Pro Pro Ser

225                 230                 235                 240

Leu Glu Leu Ile His Lys Ala Asn Glu Gln Val Val Gln Ser Leu Asn

                245                 250                 255

Gln Tnr Tyr Lys Met Asp Tyr Asn Ser Phe Gln Ala Val Thr Ile Asn

            260                 265                 270

Glu Ser Asn Phe Phe Val Thr Pro Glu Ile Ile Phe Glu Gly Asp Thr

        275                 280                 285

Val Ser Leu Val Cys Glu Lys Glu Val Leu Ser Ser Asn Val Ser Trp

    290                 295                 300

Arg Tyr Glu Glu Gln Gln Leu Glu Ile Gln Asn Ser Ser Arg Phe Ser

305                 310                 315                 320

Ile Tyr Thr Ala Leu Phe Asn Asn Met Thr Ser Val Ser Lys Leu Thr

                325                 330                 335

Ile His Asn Ile Thr Pro Gly Asp Ala Gly Glu Tyr Val Cys Lys Leu

            340                 345                 350

Ile Leu Asp Ile Phe Glu Tyr Glu Cys Lys Lys Lys Ile Asp Val Met

        355                 360                 365

Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asn Glu Glu Met Lys Val Met Cys Asp Asn

    370                 375                 380

Asn Pro Val Ser Leu Asn Cys Cys Ser Gln Gly Asn Val Asn Trp Ser

385                 390                 395                 400

Lys Val Glu Trp Lys Gln Glu Gly Lys Ile Asn Ile Pro Gly Thr Pro

                405                 410                 415

Glu Thr Asp Ile Asp Ser Ser Cys Ser Arg Tyr Thr Leu Lys Ala Asp

            420                 425                 430

Gly Thr Gln Cys Pro Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Val Ile Tyr Thr

        435                 440                 445

Cys Glu Phe Ile Ser Ala Tyr Gly Ala Arg Gly Ser Ala Asn Ile Lys

    450                 455                 460

Val Thr Phe Ile Ser Val Ala Asn Leu Thr Ile Thr Pro Asp Pro Ile

465                 470                 475                 480

Ser Val Ser Glu Gly Gln Asn Phe Ser Ile Lys Cys Ile Ser Asp Val

                485                 490                 495

Ser Asn Tyr Asp Glu Val Tyr Trp Asn Thr Ser Ala Gly Ile Lys Ile

            500                 505                 510

Tyr Gln Arg Phe Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Leu Asp Gly Ala Glu Ser

        515                 520                 525

Val Leu Thr Val Lys Thr Ser Thr Arg Glu Trp Asn Gly Thr Tyr His

    530                 535                 540

Cys Ile Phe Arg Tyr Lys Asn Ser Tyr Ser Ile Ala Thr Lys Asp Val

545                 550                 555                 560

Ile Val His Pro Leu Pro Leu Lys Leu Asn Ile Met Val Asp Pro Leu

                565                 570                 575

Glu Ala Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser His His Ile Lys Cys Cys Ile

            580                 585                 590

Glu Glu Asp Gly Asp Tyr Lys Val Thr Phe His Met Gly Ser Ser Ser

        595                 600                 605

Leu Pro Ala Ala Lys Glu Val Asn Lys Lys Gln Val Cys Tyr Lys His

    610                 615                 620

Asn Phe Asn Ala Ser Ser Val Ser Trp Cys Ser Lys Thr Val Asp Val

625                 630                 635                 640

Cys Cys His Phe Thr Asn Ala Ala Asn Asn Ser Val Trp Ser Pro Ser

                645                 650                 655

Met Lys Leu Asn Leu Val Pro Gly Glu Asn Ile Thr Cys Gln Asp Pro

            660                 665                 670

Val Ile Gly Val Gly Glu Pro Gly Lys Val Ile Gln Lys Leu Cys Arg

        675                 680                 685

Phe Ser Asn Val Pro Ser Ser Pro Glu Ser Pro Ile Gly Gly Thr Ile

    690                 695                 700

Thr Tyr Lys Cys Val Gly Ser Gln Trp Glu Glu Lys Arg Asn Asp Cys

705                 710                 715                 720

Ile Ser Ala Pro Ile Asn Ser Leu Leu Gln Met Ala Lys Ala Leu Ile

                725                 730                 735

Lys Ser Pro Ser Gln Asp Glu Met Leu Pro Thr Tyr Leu Lys Asp Leu

            740                 745                 750

Ser Ile Ser Ile Asp Lys Ala Glu His Glu Ile Ser Ser Ser Pro Gly

        755                 760                 765

Ser Leu Gly Ala Ile Ile Asn Ile Leu Asp Leu Leu Ser Thr Val Pro

    770                 775                 780

Thr Gln Val Asn Ser Glu Met Met Thr His Val Leu Ser Thr Val Asn

785                 790                 795                 800

Val Ile Leu Gly Lys Pro Val Leu Asn Thr Trp Lys Val Leu Gln Gln

                805                 810                 815

Gln Trp Thr Asr Gln Ser Ser Gln Leu Leu His Ser Val Glu Arg Phe

            820                 825                 830

Ser Gln Ala Leu Gln Ser Gly Asp Ser Pro Pro Leu Ser Phe Ser Gln

        835                 840                 845

Thr Asn Val Gln Met Ser Ser Thr Val Ile Lys Ser Ser His Pro Glu

    850                 855                 860

Thr Tyr Gln Gln Arg Phe Val Phe Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Asn

865                 870                 875                 880

Val Val Ile Asp Lys Ser Tyr Leu Glu Asn Leu Gln Ser Asp Ser Ser

                885                 890                 895

Ile Val Thr Met Ala Phe Pro Thr Leu Gln Ala Ile Leu Ala Gln Asp

            900                 905                 910

Ile Gln Glu Asn Asn Phe Ala Glu Ser Leu Val Met Thr Thr Thr Val

        915                 920                 925

Ser His Asn Thr Thr Met Pro Phe Arg Ile Ser Met Thr Phe Lys Asn

    930                 935                 940

Asn Ser Pro Ser Gly Gly Glu Thr Lys Cys Val Phe Trp Asn Phe Arg

945                 950                 955                 960

Leu Ala Asn Asn Thr Gly Gly Trp Asp Ser Ser Gly Cys Tyr Val Glu

                965                 970                 975

Glu Gly Asp Gly Asp Ash Val Thr Cys Ile Cys Asp His Leu Thr Ser

            980                 985                 990

Phe Ser Ile Leu Met Ser Pro Asp  Ser Pro Asp Pro Ser  Ser Leu Leu

        995                 1000                 1005

Gly Ile  Leu Leu Asp Ile Ile  Ser Tyr Val Gly Val  Gly Phe Ser

    1010                 1015                 1020

Ile Leu  Ser Leu Ala Ala Cys  Leu Val Val Glu Ala  Val Val Trp

    1025                 1030                 1035

Lys Ser  Val Thr Lvs Asn Arg  Thr Ser Tyr Met Arq  His Thr Cys

    1040                 1045                 1050

Ile Val  Asn Ile Ala Ala Ser  Leu Leu Val Ala Asn  Thr Trp Phe

    1055                 1060                 1065

Ile Val  Val Ala Ala Ile Gln  Asp Asn Arg Tyr Ile  Leu Cys Lys

    1070                 1075                 1080

Thr Ala  Cys Val Ala Ala Thr  Phe Phe Ile His Phe  Phe Tyr Leu

    1085                 1090                 1095

Ser Val  Phe Phe Trp Met Leu  Thr Leu Gly Leu Met  Leu Phe Tyr

    1100                 1105                 1110

Arg Leu  Val Phe Ile Leu His  Glu Thr Ser Arg Ser  Thr Gln Lys

    1115                 1120                 1125

Ala Ile  Ala Phe Cys Leu Gly  Tyr Gly Cys Pro Leu  Ala Ile Ser

    1130                 1135                 1140

Val Ile  Thr Leu Gly Ala Thr  Gln Pro Arg Glu Val  Tyr Thr Arg

    1145                 1150                 1155

Lys Asn  Val Cys Trp Leu Asn  Trp Glu Asp Thr Lys  Ala Leu Leu

    1160                 1165                 1170

Ala Phe  Ala Ile Pro Ala Leu  Ile Ile Val Val Val  Asn Ile Thr

    1175                 1180                 1185

Ile Thr  Ile Val Val Ile Thr  Lys Ile Leu Arg Pro  Ser Ile Gly

    1190                 1195                 1200

Asp Lys  Pro Cys Lys Gln Glu  Lys Ser Ser Leu Phe  Gln Ile Ser

    1205                 1210                 1215

Lys Ser  Ile Gly Val Leu Thr  Pro Leu Leu Gly Leu  Thr Trp Gly

    1220                 1225                 1230

Phe Gly  Leu Thr Thr Val Phe  Pro Gly Thr Asn Leu  Val Phe His

    1235                 1240                 1245

Ile Ile  Phe Ala Ile Leu Asn  Val Phe Gln Gly Leu  Phe Ile Leu

    1250                 1255                 1260

Leu Phe  Gly Cys Leu Trp Asp  Leu Lys Val Gln Glu  Ala Leu Leu

    1265                 1270                 1275

Asn Lys  Phe Ser Leu Ser Arg  Trp Ser Ser Gln His  Ser Lys Ser

    1280                 1285                 1290

Thr Ser  Leu Gly Ser Ser Thr  Pro Val  Phe Ser Met  Ser Ser Pro

    1295                 1300                 1305

Ile Ser  Arg Ara Phe Asr Asn  Leu Phe Gly Lys Thr  Gly Thr Tyr

    1310                 1315                 1320

Asn Val  Ser Thr Pro Glu Ala  Thr Ser Ser Ser Leu  Glu Asn Ser

    1325                 1330                 1335

Ser Ser  Ala Ser Ser Leu Leu  Asn

    1340                 1345

<210>3

<211>4050

<212>DNA

<213>大鼠

<400>3

atgaaatcgt caaggactgt cacgctctac tttgtgctta ttgtgatttg ttcctcagaa     60

gctacatgga gcaggccagc agagcccatt gtccatcctt tgattctcca agaacatgaa    120

ctagcagggg aagagctact gaggccaaaa agagcagttg cagtgggtgg tcctgtggca    180

gaagaataca ccgtggatgt tgagatcagt tttgaaaatg tctccttcct ggagtccatc    240

agagctcact taaacagcct ccgttttcca gttcagggga acggcactga cattttgagt    300

atggcaatga ctacagtctg cactcctact gggaatgacc tcttgtgctt ctgcgagaaa    360

ggctaccagt ggcctgagga aaggtgtctc tcctctctca cttgtcaaga gcatgacagc    420

gccctgccag gccgatactg caattgtctg aaaggacttc ctccccaagg acctttctgc    480

cagctcccag aaacatacat taccttaaaa atcaaagtca gactgaacat aggatttcaa    540

gaagacctag agaacacatc ctctgccctc tatag9tcct acaagactga tctggaaaga    600

gcgttccgag cgggttacag aactttacca ggattcagat cggtgactgt gacacagttc    660

accaagggca gcgtggttgt ggactacata gtcgaggttg catcggcacc actgcctgga    720

tcaattcata aagccaatga gcaagtcata cagaacctca accagactta caaaatggac    780

tacaactcct tccaaggaac accaagcaat gaaacaaagt tcactgtgac accagagttc    840

atctttgaag gagacaatgt aactctggaa tgcgaaagtg aattcgtgtc ctccaacaca    900

tcttggttct atggagaaaa acggtctgac atccagaaca gtgacaaatt ctccattcac    960

acctcaatca tcaacaatat aagcctggtc acccgcctca ctattttcaa cttcacacag   1020

catgatgcag gcttatatgg ttgcaatgtg acactggata tttttgaata tgggacagtc   1080

agaaaattag atgtcactcc catccggatt ttggccaagg aagagagaaa ggtggtgtgt   1140

gacaataacc ctatatcgtt gaactgctgc agcgagaata tcgcgaactg gagcagaatc   1200

gagtggaaac aggaggggaa aataaacatt gaagggaccc cagaaacaga cctagagtct   1260

agctgcagca cttatacact caaggcagat ggaacccagt gtcccagtgg ttcttctgga   1320

acaacagtca tctacacgtg tgagttcgtc agcgtctacg gagccaaagg cagtaagaac   1380

atagccgtga ccttcacctc tgtagccaac ctaacaataa ccccggaccc aatttctgtt   1440

tctgagggac aaagcttttc tataacttgc ctcagcgatg tgagtagctt tgatgaggtg   1500

tactggaaca cttccgctgg tattaaaatc catccaaggt tttataccat gaggaggtat   1560

cgggatggag cagagtcggt gctgacggtg aagacctcca ccagagagtg gaacggaacc   1620

taccactgca tatttagata taagaattca tacagcatag ccaccaaaga tgtcactgtt   1680

caccctctgc ctctggagtc agacatcatg atggatcctt tggaagccag tggtctgtgc   1740

accagttccc atcagttcaa gtgctgcata gaagagaacg atggggaaga gtacattgtg   1800

actttccacg tggattcctc atcctttcct gctgaaagag aagttattgg caagcaggca   1860

tgctacacat acagtctccc aggaaagtta ccatcacggt gtcccaaaga cattgacgtg   1920

ttctgccact ttaccaatgc agccaacagc tcagtccgga gcccatctat gaagcttacc   1980

cttgttccag ggaagaatat cacatgccag gatcccatca taggtattgg ggaacctggg   2040

aaagtcatcc agaagctgtg ccagtttgca ggtgtttcta gaagccctgg acagaccatt   2100

ggtggaaccg tcacttataa atgtgtaggc tcccagtgga aggaggagac aagggcctgc   2160

atatcagccc caatcaatgg tttgctccag ttggccaagg ctttgatcaa gagcccctcc   2220

caggatcaga agctccctaa atacctgcgg gacctttctg ttagcactgg gaaggaagaa   2280

caggatatac gctcatcgcc cgggagcctg ggagccatca tcagcatcct tgatttgctt   2340

tcaacagttc ccactcaagt gaattcagaa atgatgaggg atatacttgc taccattaat   2400

gtcatcttag acaagtccac cttgaactcc tgggagaagt tactacagca acagagcaac    2460

cagagctctc agttcctgca gtcagtggag aggttttcca aagcgctcga gctgggagac    2520

agcacccctc ccttcctctt ccaccctaat gttcagatga agagcatggt gataaaacgt    2580

ggccacgccc aaatgtacca acagaaattt gtcttcacag actctgacct atggggtgat    2640

gtagccattg atgagtgtca gctgggaagc ttgcagcctg attcatcgat cgttactgtg    2700

gctttcccaa ctctcaaagc catcctggcc caggatggac agagaaagac accctccaac    2760

agcctagtaa tgaccaccac tgtcagccat aatatcgtca agccttttag gatttctatg    2820

acattcaaga acaaccatcg ttcgggtggc aagccacagt gtgtcttctg gaacttcagc    2880

cttgccaata atacaggggg ctgggatagc agtgggtgca ctgtggaaga tgatggtagg    2940

gacaataggg acagagtctt ctgcaagtgt aaccacctga cgtcattctc cattctcatg    3000

tccccagact ccccagaccc aggatctctt ttaaaaatac ttctggatat catttcttac    3060

atcgggttgg gcttttccat agtcagctta gctgcctgtc tagttgtgga agccatggtg    3120

tggaaatcag tgaccaagaa ccgaacttcc tatatgcgcc acatctgcat cgtcaacatt    3180

gccctttgcc ttctgattgc tgacatctgg ttcattgtgg ctggtgctat ccacgatggg    3240

cattacccac tcaacgaaac agcctgtgtg gccgccacat tcttcattca cttcttctac    3300

ctcagtgtct tcttctggat gctaactctg ggcctcatgc tcttctaccg gctgattttc    3360

attctacatg acgcgagcaa gtccacgcag aaagccattg ccttttctct aggctatggc    3420

tgtccactca ttatctcatc catcacagtg ggggttacac agccacagga agtttacatg    3480

aggaagaatg catgttggct caactgggag gacaccagag cactgctggc ttttgctatc    3540

ccagcgttga ttattgtggt ggtgaacgtg agcatcacag ttgtggtcat caccaagatc    3600

ctaaggccct ccgtcggaga caagccaggc aagcaggaaa agagcagcct attccagatc    3660

agcaagagca ttggagtcct cacgccactc ttggggctca cttggggttt tggtctggcc    3720

acagtgatcc aggggagcaa tgctgtgttc cacatcatat ttactctcct caatgccttt    3780

caggggctct tcattttgct ctttggctgc ctctgggatc agaaggtaca ggaagctttg    3840

ctgcataagt tttcattgtc aaggtggtct tctcaacact caaagtcaac atccttaggt    3900

tcatcaacac ctgtgttttc gatgagttct ccgatatccc gaagatttaa taatcttttt    3960

ggtaaaacag gaacatataa cgtttccacc ccagagacaa ccagctcatc cgtggaaaat    4020

tcctctagtg cttactcatt gctcaactag                                     4050

<210>4

<211>1349

<212>PRT

<213>大鼠

<400>4

Met Lys Ser Ser Arg Thr Val Thr Leu Tyr Phe Val Leu Ile Val Ile

1               5                   10                  15

Cys Ser Ser Glu Ala Thr Trp Ser Arg Pro Ala Glu Pro Ile Val His

            20                  25                  30

Pro Leu Ile Leu Gln Glu His Glu Leu Ala Gly Glu Glu Leu Leu Arg

        35                  40                  45

Pro Lys Arg Ala Val Ala Val Gly Gly Pro Val Ala Glu Glu Tyr Thr

    50                  55                  60

Val Asp Val Glu Ile Ser Phe Glu Asn Val Ser Phe Leu Glu Ser Ile

65                  70                  75                  80

Arg Ala His Leu Asn Ser Leu Arg Phe Pro Val Gln Gly Asn Gly Thr

                85                  90                  95

Asp Ile Leu Ser Met Ala Met Thr Thr Val Cys Thr Pro Thr Gly Asn

            100                 105                 110

Asp Leu Leu Cys Phe Cys Glu Lys Gly Tyr Gln Trp Pro Glu Glu Arg

        115                 120                 125

Cys Leu Ser Ser Leu Thr Cys Gln Glu His Asp Ser Ala Leu Pro Gly

    130                 135                 140

Are Tyr Cys Asn Cys Leu Lys Gly Leu Pro Pro Gln Gly Pro Phe Cys

145                 150                 155                 160

Gln Leu Pro Glu Thr Tyr Ile Thr Leu Lys Ile Lys Val Arg Leu Asn

                165                 170                 175

Ile Gly Phe Gln Glu Asp Leu Glu Asn Thr Ser Ser Ala Leu Tyr Arg

            180                 185                 190

Ser Tyr Lys Thr Asp Leu Glu Arg Ala Phe Arg Ala Gly Tyr Arg Thr

        195                 200                 205

Leu Pro Gly Phe Arg Ser Val Thr Val Thr Gln Phe Thr Lys Gly Ser

    210                 215                 220

Val Val Val Asp Tyr Ile Val Glu Val Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly

225                 230                 235                 240

Ser Ile His Lys Ala Asn Glu Gln Val Ile Gln Asn Leu Asn Gln Thr

                245                 250                 255

Tyr Lys Met Asp Tyr Asn Ser Phe Gln Gly Thr Pro Ser Asn Glu Thr

            260                 265                 270

Lys Phe Thr Val Thr Pro Glu Phe Ile Phe Glu Gly Asp Asn Vel Thr

        275                 280                 285

Leu Glu Cys Glu Ser Glu Phe Val Ser Ser Asn Thr Ser Trp Phe Tyr

    290                 295                 300

Gly Glu Lys Arg Ser Asp Ile Gln Asn Ser Asp Lys Phe Ser Ile His

305                 310                 315                 320

Thr Ser Ile Ile Asn Asn Ile Ser Leu Val Thr Arg Leu Thr Ile Phe

                325                 330                 335

Asn Phe Thr Gln His Asp Ala Gly Leu Tyr Gly Cys Asn Val Thr Leu

            340                 345                 350

Asp Ile Phe Glu Tyr Gly Thr Val Arg Lys Leu Asp Val Thr Pro Ile

        355                 360                 365

Arg Ile Leu Ala Lys Glu Glu ArgLys Val Val Cys Asp Asn Asn Pro

    370                 375                 380

Ile Ser Leu Asn Cys Cys Ser Glu Asn Ile Ala Asn Trp Ser Arg Ile

385                 390                 395                 400

Glu Trp Lys Gln Glu Gly Lys Ile Asn Ile Glu Gly Thr Pro Glu Thr

                405                 410                 415

Asn Leu Glu Ser Ser Cys Ser Thr Tyr Thr Leu Lys Ala Asp Gly Thr

            420                 425                 430

Gln Cys Pro Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Val Ile Tyr Thr Cys Glu

        435                 440                 445

Phe Val Ser Val Tyr Gly Ala Lys Gly Ser Lys Asn Ile Ala Val Thr

    450                 455                 460

Phe Thr Ser Val Ala Asn Leu Thr Ile Thr Pro Asp Pro Ile Ser Val

465                 470                 475                 480

Ser Glu Gly Gln Ser Phe Ser Ile Thr Cys Leu Ser Asp Val Ser Ser

                485                 490                 495

Phe Asp Glu Val Tyr Trp Asn Thr Ser Ala Gly Ile Lys Ile His Pro

            500                 505                 510

Arg Phe Tyr Thr Met Arg Arg Tyr Arg Asp Gly Ala Glu Ser Val Leu

        515                 520                 525

Thr Val Lys Thr Ser Thr Arg Glu Trp Asn Gly Thr Tyr His Cys Ile

    530                 535                 540

Phe Arg Tyr Lys Asn Ser Tyr Ser Ile Ala Thr Lys Asp Val Thr Val

545                 550                 555                 560

His Pro Leu Pro Leu Glu Ser Asp Ile Met Met Asp Pro Leu Glu Ala

                565                 570                 575

Ser Gly Leu Cys Thr Ser Ser His Gln Phe Lys Cys Cys Ile Glu Glu

            580                 585                 590

Asn Asp Gly Glu Glu Tyr Ile Val Thr Phe His Val Asp Ser Ser Ser

        595                 600                 605

Phe Pro Ala Glu Arg Glu Val Ile Gly Lys Gln Ala Cys Tyr Thr Tyr

    610                 615                 620

Ser Leu Pro Gly Lys Leu Pro Ser Arg Cys Pro Lys Asp Ile Asp Val

625                 630                 635                 640

Phe Cys His Phe Thr Asn Ala Ala Asn Ser Ser Val Arg Ser Pro Ser

                645                 650                 655

Met Lys Leu Thr Leu Val Pro Gly Lys Asn Ile Thr Cys Gln Asp Pro

            660                 665                 670

Ile Ile Gly Ile Gly Glu Pro Gly Lys Val Ile Gln Lys Leu Cys Gln

        675                 680                 685

Phe Ala Gly Val Ser Arg Ser Pro Gly Gln Thr Ile Gly Gly Thr Val

    690                 695                 700

Thr Tyr Lys Cys Val Gly Ser Gln Trp Lys Glu Glu Thr Arg Ala Cys

705                 710                 715                 720

Ile Ser Ala Pro Ile Asn Gly Leu Leu Gln Leu Ala Lys Ala Leu Ile

                725                 730                 735

Lys Ser Pro Ser Gln Asp Gln Lys Leu Pro Lys Tyr Leu Arg Asp Leu

            740                 745                 750

Ser Val Ser Thr Gly Lys Glu Glu Gln Asp Ile Arg Ser Ser Pro Gly

        755                 760                 765

Ser Leu Gly Ala Ile Ile Ser Ile Leu Asp Leu Leu Ser Thr Val Pro

    770                 775                 780

Thr Gln Val Asn Ser Glu Met Met Arg Asp Ile Leu Ala Thr Ile Asn

785                 790                 795                 800

Val Ile Leu Asp Lys Ser Thr Leu Asn Ser Trp Glu Lys Leu Leu Gln

                805                 810                 815

Gln Gln Ser Asn Gln Ser Ser Gln Phe Leu Gln Ser Val Glu Arg Phe

            820                 825                 830

Ser Lys Ala Leu Glu Leu Gly Asp Ser Thr Pro Pro Phe Leu Phe His

        835                 840                 845

Pro Asn Val Gln Met Lys Ser Met Val Tle Lys Arg Gly His Ala Gln

    850                 855                 860

Met Tyr Gln Gln Lys Phe Val Phe Thr Asp Ser Asp Leu Trp Gly Asp

865                 870                 875                 880

Val Ala Ile Asp Glu Cys Gln Leu Gly Ser Leu Gln Pro Asp Ser Ser

                885                 890                 895

Ile Val Thr Val Ala Phe Pro Thr Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Asp

            900                 905                 910

Gly Gln Arg Lys Thr Pro Ser Asn Ser Leu Val Met Thr Thr Thr Val

        915                 920                 925

Ser His Asn Ile Val Lys Pro Phe Arg Ile Ser Met Thr Phe Lys Asn

    930                 935                 940

Asn His Arg Ser Gly Gly Lys Pro Gln Cys Val Phe Trp Asn Phe Ser

945                 950                 955                 960

Leu Ala Asn Asn Thr Gly Gly Trp Asp Ser Ser Gly Cys Thr Val Glu

                965                 970                 975

Asp Asp Gly Arg Asp Asn Arg Asp Arg Val Phe Cys Lys Cys Asn His

            980                 985                 990

Leu Thr Ser Phe Ser Ile Leu Met  Ser Pro Asp Ser Pro  Asp Pro Gly

        995                 1000                 1005

Ser Leu  Leu Lys Ile Leu Leu  Asp Ile Ile Ser Tyr  Ile Gly Leu

    1010                 1015                 1020

Gly Phe  Ser Ile Val Ser Leu  Ala Ala Cys Leu Val  Val Glu Ala

    1025                 1030                 1035

Met Val  Trp Lys Ser Val Thr  Lys Asn Arg Thr Ser  Tyr Met Arg

    1040                 1045                 1050

His Ile  Cys Ile Val Asn Ile  Ala Leu Cys Leu Leu  Ile Ala Asp

    1055                 1060                 1065

Ile Trp  Phe Ile Val Ala Gly  Ala Ile His Asp Gly  His Tyr Pro

    1070                 1075                 1080

Leu Asn  Glu Thr Ala Cys Val  Ala Ala Thr Phe Phe  Ile His Phe

    1085                 1090                 1095

Phe Tyr  Leu Ser Val Phe Phe  Trp Met Leu Thr Leu  Gly Leu Met

    1100                 1105                 1110

Leu Phe  Tyr Arg Leu Ile Phe  Ile Leu His Asp Ala  Ser Lys Ser

    1115                 1120                 1125

Thr Gln  Lys Ala Ile Ala Phe  Ser Leu Gly Tyr Gly  Cys Pro Leu

    1130                 1135                 1140

Ile Ile  Ser Ser Ile Thr Val  Gly Val Thr Gln Pro  Gln Glu Val

    1145                 1150                 1155

Tyr Met  Arg Lys Asn Ala Cys  Trp Leu Asn Trp Glu  Asp Thr Arg

    1160                 1165                 1170

Ala Leu  Leu Ala Phe Ala Ile  Pro Ala Leu Ile Ile  Val Val Val

    1175                 1180                 1185

Asn Val  Ser Ile Thr Val Val  Val Ile Thr Lys Ile  Leu Arg Pro

    1190                 1195                 1200

Ser Val  Gly Asp Lys Pro Gly  Lys Gln Glu Lys Ser  Ser Leu Phe

    1205                 1210                 1215

Gln Ile  Ser Lys Ser Ile Gly  Val Leu Thr Pro Leu  Leu Gly Leu

    1220                 1225                 1230

Thr Trp  Gly Phe Gly Leu Ala  Thr Val Ile Gln Gly  Ser Asn Ala

    1235                 1240                 1245

Val Phe  His Ile Ile Phe Thr  Leu Leu Asn Ala Phe  Gln Gly Leu

    1250                 1255                 1260

Phe Ile  Leu Leu Phe Gly Cys  Leu Trp Asp Gln Lys  Val Gln Glu

    1265                 1270                 1275

Ala Leu  Leu His Lys Phe Ser  Leu Ser Arg Trp Ser  Ser Gln His

    1280                 1285                 1290

Ser Lys  Ser Thr Ser Leu Gly  Ser Ser Thr Pro Val  Phe Ser Met

    1295                 1300                 1305

Ser Ser  Pro Tle Ser Arg Arg  Phe Asn Asn Leu Phe  Gly Lys Thr

    1310                 1315                 1320

Gly Thr  Tyr Asn Val Ser Thr  Pro Glu Thr Thr Ser  Ser Ser Val

    1325                 1330                 1335

Glu Asn  Ser Ser Ser Ala Tyr  Ser Leu Leu Asn

    1340                 1345

<210>5

<211>423

<212>DNA

<213>小鼠

<400>5

gcctgtctag ttgtggaagc catggtgtgg aaatctgtga ccaagaaccg aacttcctat     60

atgcgccaca tctgcatagt caacattgcc ttttgccttc tgattgctga catctggttc    120

attgtggctg gtgctatcca cgacggtcgc tacccactca acgaaacagc ctgtgtggcc    180

gccacattct tcattcactt cttctacctc agtgtcttct tctggatgct aactctaggc    240

ctcatgctct tctaccggct gattttcatt ctacacgatg caagcaagtc cactcagaaa    300

gccatcgcat tttctctagg ctatggctgt cccctcatta tctcctctat cacagtgggg    360

gttacgcagc cacaggaagt ctacatgagg aagaacgcgt gttggctcaa ctgggaggac    420

acc                                                          423

<210>6

<211>141

<212>PRT

<213>小鼠

<400>6

Ala Cys Leu Val Val Glu Ala Met Val Trp Lys Ser Val Thr Lys Asn

1               5                   10                  15

Arg Thr Ser Tyr Met Arg His Ile Cys Ile Val Asn Ile Ala Phe Cys

            20                  25                  30

Leu Leu Ile Ala Asp Ile Trp Phe Ile Val Ala Gly Ala Ile His Asp

        35                  40                  45

Gly Arg Tyr Pro Leu Asn Glu Thr Ala Cys Val Ala Ala Thr Phe Phe

    50                  55                  60

Ile His Phe Phe Tyr Leu Ser Val Phe Phe Trp Met Leu Thr Leu Gly

65                  70                  75                  80

Leu Met Leu Phe Tyr Arg Leu Ile Phe Ile Leu His Asp Ala Ser Lys

                85                  90                  95

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Ala Phe Ser Leu Gly Tyr Gly Cys Pro Leu

            100                 105                 110

Ile Ile Ser Ser Ile Thr Val Gly Val Thr Gln Pro Gln Glu Val Tyr

        115                 120                 125

Met Arg Lys Asn Ala Cys Trp Leu Asn Trp Glu Asp Thr

    130                 135                 140

<210>7

<211>41

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>新颖序列

<400>7

atatggtacc atgaaatccc caaggagaac cactttgtgc c                     41

<210>8

<211>43

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>新颖序列

<400>8

atatgcggcc gcttagttga gcaacgaaga agcactggat  gag            43

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>新颖序列

<400>9

gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag                      36

<210>10

<211>53

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>新颖序列

<400>10

gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg    53

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>新颖序列

<400>11

gcctgtctag ttgtggaagc                                         20

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>新颖序列

<400>12

ggtgtcctcc cagttgagcc aaca                                     24