用于预防反刍动物捻转血矛线虫病的DNA疫苗

实施例

基础材料：真核表达载体pcDNA4/His Max，pPICZαB(美国Invitrogen公司产品)；pMD18-T(大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司)；pET-28a，b，c(+)(美国Novagen公司产品)。

实施例1.H11基因的制备：

1.引物的设计和合成

根据GenBank中公开的捻转血矛线虫H11基因的核苷酸序列，应用Primer Premier5软件设计3对引物，如下所示：

P1  5’-ATACCGCGGATGACGTCGCAGGGG AG-3，

P1’5’-CGCTCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3’；

P2  5’-ATACCGCGG CCAGAGGCAAAGAAG A-3’，

P2’5’-TTCTCTAGACCGTTCACCACAAAGGG A-3’；

P3  5’-ATACCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3’，

P3’5’-GGCTCTAGA AAGGTGGCTTTCTTGA-3’。

设计策略如图2所示，3对引物覆盖H11的开放阅读框。这三对引物中均为在上游引物5’端引入酶切位点SacII，下游引物的5’端引入酶切位点XbaI(如下划线部分所示)，用于构建表达载体。

2.捻转血矛线虫虫体总RNA的提取

挑取40条捻转血矛线虫成虫放入经DEPC处理过的匀浆器中，加Trizol试剂1ml，匀浆3分钟。将匀浆液转移至Eppendorf管中，室温放置5分钟，加200μl氯仿，涡悬振荡15秒。4℃，12000r/min离心15分钟，吸取上层水相转至新的Eppendorf管中，加入500μl异丙醇后于25℃沉淀30分钟。12000r/min离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗涤2次，晾干RNA沉淀，用50μl无RNA酶的水溶解沉淀。紫外分光光度计测定RNA的含量及纯度，-20℃保存备用。

3.RT-PCR扩增

以上述提取的捻转血矛线虫总RNA为模板，用oligo(dT)₁₅引物进行反转录，合成cDNA第一链，采用20μl反应体系：总RNA约1.0μg，oligo(dT)₁₅0.50μg，70℃变性10分钟后立即置冰水中冷却2分钟，然后加入5×RT反应缓冲液4.0μl，MgCl₂(25mmol/L)2.0μl，dNTP(10mmol/L)1.5μl，M-MLV反转录酶(200U/μl)1.0μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，无RNase水补至20μl。将上述所有成分轻弹混匀，短暂离心后，42℃反应60分钟，然后95℃5分钟灭活反转录酶。反转录产物立即进行PCR或-20℃保存备用。

以反转录产物为模板，采用50μl体系进行PCR扩增，各反应成分如下：cDNA模板2.0μl，10×PCR反应缓冲液5.0μl，MgCl₂(25mmol/L)3.0μl，成对的上、下游引物(50pmol/μl)各2.0μl(即相应地分别加入P1和P1’、P2和P2’或者P3和P3’各2.0μl)，dNTP(2.5mmol/L)4.0μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，补加灭菌ddH₂O至50μl。将上述成分离心混合均匀后，于PCR仪上进行扩增，反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；然后72℃延伸15分钟。

使用引物对P1和P1’、P2和P2’或者P3和P3’扩增得到的基因分别命名为H11-1、H11-2和H11-3。经测序表明，扩增得到的H11-1、H11-2和H11-3基因分别具有如SEQ ID NO：1中第484-1409位、SEQ ID NO：2中第484-1457位和SEQ ID NO：3中第484-1607位所示的核苷酸序列。

实施例2.DNA疫苗的制备

1.重组质粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3的构建(见图3)

取实施例1中获得的PCR产物50μl，1％琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与经SacII和XbaI酶切线性化的pMD18-T载体连接，反应体系如下：

PCR回收产物                    4.0μl

pMD18-T载体                    1.0μl

Ligation solution I            5.0μl

总体积                         10.0μl

将上述成分在薄壁eppendorf管中混合均匀后4℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用SacII和XbaI双酶切及测序等鉴定，确定为pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3。

2.重组质粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的构建(见图4)

分别用BamHI和HindIII双酶切克隆质粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2、pMD18-T-H11-3和原核表达载体pET28b(+)，分别回收纯化H11-1、H11-2、H11-3和pET28b(+)酶切片段，T4连接酶连接，反应体系如下：

                       H11-1H       H11-2H      H11-3

双酶切回收的目的片段   7μl         l8μl       10μl

pET28b(+)载体回收片段  10μl        9μl        7μl

10×连接缓冲液         2μl         2μl        2μl

T₄DNA连接酶           1μl         1μl        1μl

                       20μl        20μl       20μl

先将目的片段与载体片段加入后，混合均匀，45℃作用5分钟，然后在冰上加入其他成分，短暂离心混匀，置16℃连接12h。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用BamHI和HindIII双酶切鉴定，确定为pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3重组载体。

3.重组质粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的诱导表达

将转化有pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3质粒的阳性克隆28℃振荡培养过夜，菌液再以1∶50稀释至含Kna⁺的LB培养液中，37℃继续培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，然后将终浓度1mMol/L IPTG进行诱导表达，分别收集0hr、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的菌液，菌体蛋白进行SDS-PAGE鉴定(见图5)。

4.重组质粒pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3的构建(见图6)

将pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2或pMD18-T-H11-3与表达载体pPICZαB分别用SacII和XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收目的片段和载体片段，以合适的比例进行粘端连接(构建策略如图4-1)，反应体系如下：

                        H11-1H       H11-2H      H11-3

双酶切回收的目的片段    7μl         8μl        10μl

回收的pPICZαB载体片段  10μl        9μl        7μl

10×连接缓冲液          2μl         2μl        2μl

T₄DNA连接酶            1μl         1μl        1μl

                        20μl        20μl       20μl

16℃连接12小时。将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h，提取质粒，用SacII和XbaI双酶切等鉴定，确定为pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3。

5.重组质粒pcDNA-H11-1、pcDNA-H11-2和pcDNA-H11-3的构建(见图7)

将pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2或pPICZαB-H11-3质粒与pcDNA4/HisMax质粒分别用XhoI和XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收目的片段和载体片段，以合适的比例进行粘端连接，反应体系如下：

                             H11-1H     H11-2H     H11-3

双酶切回收的目的片段         7μl       8μl       10μl

pcDNA4/HisMax C片段          10μl      9μl       7μl

10×连接缓冲液               2μl       2μl       2μl

T₄DNA连接酶                 1μl       1μl       1μl

                             20μl      20μl      20μl

连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用Xho I和XbaI双酶切确定获得即为pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3DNA疫苗。

6.含三种重组真核质粒混合物的DNA疫苗的制备将上述操作得到的pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3按1∶1∶1的比例混合，得到含这三种重组真核质粒混合物的DNA疫苗。

实施例3.DNA疫苗的动物保护性试验

1.试验动物接种

选择体重相当、无捻转血矛线虫感染、5’-7月龄健康山羊15只，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射PBS。第2组肌肉注射3种重组真核质粒载体的混合物(pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3)。首次免疫后2周加强免疫一次。每次每只山羊注射1ml pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3(其中H11-1、2和3各100μg/ml)。在第2次免疫后14天，每只山羊感染10,000只捻转血矛线虫第三期幼虫。第3组山羊不免疫，也不攻击三期幼虫。

2.RT-PCR检测核酸疫苗的表达情况

第1次免疫后7天，局部麻醉山羊，取疫苗注射肌肉细胞提取RNA，最后用20μl经DEPC处理过的水溶解RNA沉淀。为防止质粒DNA污染，反转录前用无RNase的DNase处理肌肉RNA，进行RT-PCR。具体方法同实施例1所述。结果表明DNA疫苗在山羊肌肉细胞内获得了转录(见图8)。

3.Western印迹检测核酸疫苗的表达情况

于第2次免疫后7天，采取血清和疫苗注射部肌肉(局部麻醉)，制样、SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维膜。PBS洗膜2次，0.2％丽春红染色，铅笔标记蛋白质标准分子量所在位置；PBS洗膜数次，至丽春红全部褪去，3％BSA(PBS)4℃过夜或37℃1小时；PBS洗膜数次，加大鼠抗H11抗体(3％BSA稀释)，37℃作用1小时；生理盐水洗膜数次，加羊抗大鼠IgG-HRP(3％BSA稀释)，37℃作用1小时；生理盐水洗膜，加底物显色，生理盐水漂洗，PBS终止反应，干燥NC膜，照相。

pET28-H11-1、pET28-H11-2或pET28-H11-3(实施例3第3步中构建)原核表达重组蛋白制样、SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维膜后，以核酸疫苗第二次免疫2周后血清为一抗、兔抗山羊IgG-HRP为标记二抗进行Western印迹检测。结果发现DNA疫苗在肌肉细胞内获得了很好的表达，并刺激山羊产生抗H11抗体(见图9)。

4.ELISA检测抗体水平

于免疫前、首次免疫后14天、第二次免疫后10、16、24、29、38、47天采取血清。用矩阵法确定包被抗原和抗体(血清)稀释度。

用包被液稀释H11抗原至合适浓度，加入酶标板，每孔50μl，37℃1小时后4℃过夜。弃包被液，PBS-Tween20洗涤3-5次，加100μl封闭液，4℃过夜或37℃1小时。弃封闭液，PBS-Tween20洗涤3-5次，加待检血清(1∶1000稀释)50μl，37℃保温1小时。弃血清，PBS-Tween20洗涤3-5次，加酶标二抗50μl，37℃保温1小时。弃二抗，PBS-Tween20洗涤3-5次，加显色液100μl，避光反应5’-15分钟，每孔加100μl2M硫酸终止反应，酶标仪测量OD₄₉₀。

结果发现第二次免疫后10天抗体滴度达到较高水平，然而在二次免疫后16-29天时发现抗体滴度急剧下降到较低水平，之后又开始回升，并维持在一个较高水平(见图10)。t检验表明pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组抗体水平极显著高于PBS对照组(P＜0.01)。

5.虫卵计数

捻转血矛线虫第三期幼虫感染后，分别于感染后第21、23、25、27、29、31和33天山羊直肠采集粪便，用于虫卵计数。

采用麦克马斯特氏法。称2克粪便于乳钵中，加水10ml，搅匀，再加饱和盐水50ml。混匀后，吸取粪液，注入记数室，置显微镜台上，静置1-2分钟。在镜下计数，刻度中的虫卵总数乘以200即为每克粪便中的虫卵数。虫卵减少率＝(1-实验组平均每克粪便数/对照组平均每克粪便数)×100％。

虫卵计数结果如表1。攻虫后21天，粪便中开始能检测到少量的捻转血矛线虫虫卵，随着时间推移，对照组和核酸疫苗免疫组每克粪便虫卵数(EPG)逐渐增加，而不免疫不感染组均未检测到捻转血矛线虫虫卵。

                                    表1  每克粪便虫卵数(×200)

图11是虫卵排出规律曲线。pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组山羊虫卵排出数量明显(t检验差异极显著P＜0.01)少于PBS对照组，虫卵减少率达58.75％。单独用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫组的山羊虫卵减少率虽然低于pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组，但是虫卵排出数量也明显(t检验差异极显著P＜0.01)少于PBS对照组。

6.虫卵孵化率

于感染后第27、29、31天，直肠采集粪便，虫卵计数后，称重，捻磨后26℃培养4-6天，采用贝尔曼氏法^[5]分离三期幼虫，计数，计算虫卵孵化率。虫卵孵化率＝三期幼虫数/虫卵数×100％

pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组虫卵平均孵化率为3.90％，PBS组平均孵化率为14.22％。核酸疫苗免疫后虫卵孵化率降低72.57％，t检验差异极显著(P＜0.01)。单独用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫组的山羊虫卵排出数量虽然高于pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组，但是也明显(t检验差异极显著P＜0.01)少于PBS对照组。

7.成虫计数

感染三期幼虫后第35天，颈静脉放血致死山羊，收集第四胃，分离捻转血矛线虫，分别计数雌雄虫数目。成虫减少率＝(1-实验组平均成虫数/对照组平均成虫数)×100％。

结果发现PBS对照组平均每只山羊的雌虫、雄虫、成虫荷虫数分别为266、170.5、436.5，而核酸疫苗免疫组分别为82.8、55.8、138.6(表2)。t检验分析表明免疫组和对照组间差异极显著(P＜0.01)

                     表2  山羊第四胃内捻转血矛线虫成虫计数

捻转血矛线虫H11基因疫苗免疫山羊后，攻击第三期幼虫，结果发现与对照组相比，免疫组山羊排出虫卵减少58.75％、虫卵孵化率降低72.57％、成虫减少68.25％。PBS对照组攻虫后被毛粗乱、消瘦、精神萎靡不振(12图B)，眼结膜苍白，表现为贫血症状(12图C右)；而免疫组相对健康，如图12A和图12C左。

                        序列表

<110>南京农业大学

<120>用于预防反刍动物捻转血矛线虫病的DNA疫苗

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>926

<212>DNA

<213>捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<220>

<221>免疫保护性隐蔽抗原基因H11的部分编码区1(H11-1)

<222>(1)..(926)

<223>

<400>1

atgacgtcgc aggggagaac gcggacattg ctgaatctaa ctccaatccg tcttattgtc 60

gcattatttc tagtagctgc tgcagtcggc ctctctattg gtctcaccta ttactttact 120

cgcaaagcgt tcgatacctc agaaaagcca gggaaggatg atactggtgg caaggacaaa 180

gacaattctc cctctgcggc ggaactactc cttccaagta atataaaacc attgtcttac 240

gacttgacga tcaaaacata tctacctggt tatgtggact tcccaccgga gcaaaacctc 300

acattcgatg ggcgtgtgga aatatcaatg gttgtaattg agccaacaaa gagtatcgta 360

ctcaattcaa agaagatctc tgtaataccc caagaatgtg aactggtatc gggcgataaa 420

aaactcgaaa ttgaaagtgt aaaggagcac ccaagactgg aaaaggttga gtttcttatc 480

aaaagccaac tggaaaaaga tcaacaaatc ttgctcaagg tcggctacat cggtctcatc 540

agcaacagcc ttggtggaat ctaccagacc acttatacca ccccggatgg cacccctaag 600

atcgctgcag tttcacaaaa tgagcccata gatgctcgtc gaatggtacc atgcatggat 660

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aagttcttga ctactccacg gatgtcatcc tacttgttgg cagttatggt ttcagaattt 840

gaatacatcg aaggtgaaac aaagacgggt gttcggttcc gtatatggtc acgcccagag 900

gcaaagaaga tgacacaata tgctct                                      926

<210>2

<211>974

<212>DNA

<213>捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<220>

<221>免疫保护性隐蔽抗原基因H11的部分编码区2(H11-2)

<222>(1)..(974)

<223>

<400>2

ccgcggccag aggcaaagaa gatgacacaa tatgctctga aatccggcat caaatgcata 60

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<210>3

<211>1124

<212>DNA

<213>捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<220>

<221>免疫保护性隐蔽抗原基因H11的部分编码区3(H11-3)

<222>(1)..(1124)

<223>

<400>3

acatggttga gaagagatga accgctttac ttgcatgtta gtgatgctgg cgctcccttt 60

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