日本血吸虫疫苗抗原基因的克隆、表达和应用

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

日本血吸虫抗原SjE16和抗原SjP50基因的获得。

1.引物的设计和合成

根据Sj50基因与Sj16基因序列，经Primerexpress软件分析设计引物，由上海申友生物生物工程公司合成二对引物。

Sj50-F为5’CCGGAATTCATGTCGGAGACGCCAAAGC3’(SEQ ID NO：5)，引入EcoR I酶切位点GAATTC；

Sj50-R为5’CCGCTCGAGCAGAATTAAGCTCTCACAGGGCA3’(SEQ ID NO：6)；引入Xho I酶切位点CTCGAG；

引物Sj16-F为5’CCGGAATTCCTTCATCTCAGAATAATGTCGGA3’(SEQ ID NO：7)，引入EcoR I酶切位点GAATTC；

Sj16-R为5’CCGCTCGAGCATACGTTTGACGTACATAAGCT3’(SEQ ID NO：8)，引入Xho I酶切位点CTCGAG。

引物贮存浓度50mM、工作浓度为10mM。

2.Sj50基因、Sj16基因的PCR扩增

以用常规方法制备的日本血吸虫成虫及虫卵cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系共计50μl，其中模板1.5μl、5’引物2μl、3’引物2μl、dNTP2.5μl、10×Pfu缓冲液5μl、Pfu DNA多聚酶0.5μl、去离子水36.5μl。反应条件为预变性95℃ 5min；变性94℃ 1min；退火56℃ 1min；复性72℃ 2min；循环30次，最后一个循环复性再延长8min后，样后存于4℃。PCR产物用QIAquick PCRPurification kit回收纯化。

结果：1％琼脂糖凝胶电泳显示Sj50基因PCR扩增产物有一条带大小约1.1Kb与预计相同。Sj16基因PCR扩增产物有一条清晰的条带大小约440bp与理论扩增大小相符。

对PCR产物进行测序，结果表明，Sj16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码一个全长为145aa的蛋白(SEQ ID NO：2)。Sj50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3，其ORF位于12-1286位，编码一个全长为425aa的蛋白(SEQ ID NO：4)。

实施例2

日本血吸虫抗原SjE16和抗原SjP50基因的克隆表达。

1.表达载体的构建

回收纯化的Sj50基因、Sj16基因和质粒pGEX4T-1分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行酶切。10μl模板加EcoR I 1μl、Xho I 1μl、EcoR I buffer 1.5μl、BSA 0.5μl和去离子水1μl，共计15μl于1.5ml Eppendorf管中37℃水浴过夜。

酶切后的Sj50基因、Sj16基因和质粒pGEX4T-1，用QIAquick PCR Purificationkit回收纯化。纯化的目的基因片段和载体酶切片段，测定OD值，计算片段和载体片段浓度，目的片段和载体片段按3∶1摩尔比进行连接。连接体系中含T4 DNA连接酶1μl、10×连接缓冲液1μl、去离子水、pGEX4T-1(80ng)、Sj50基因(60ng)或Sj16基因(20ng)，共计10μl于1.5ml Eppendorf管中12℃-14℃连接过夜，构建成Sj50基因、Sj16基因表核表达重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16。

结果：经限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后的Sj50基因、Sj16基因分别和质粒pGEX4T-1连接，构建成重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16，转化入大肠杆菌DH5α内扩增。以扩增细菌为模板，GST-5’、GST-3’为引物进行PCR扩增所获条带与目标条带大小一致。

2.表达载体的鉴定

通过电转将重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。1μl连接产物转化50μl感受态细胞，电压2KV，电容25μF，电阻300Ω，转化时间5.43mS。转化后的菌体加入1ml LB培养液，37℃，250rpm振荡培养1hr后，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37℃培养过夜。

随机挑取上述平板上的菌落进行PCR鉴定。反应体系共计10μl，内含模板3μl、GST-5’引物0.25μl、GST-3’引物0.25μl、dNTP 0.4μl、10×Pfu buffer 1μl、Tag DNA聚合酶0.1μl、去离子水5μl。反应条件为预变性94℃ 3min；变性94℃ 1min；退火56℃ 1min；复性72℃ 1.5min；循环30次，最后一个循环复性再延长8min后，样后存于4℃。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测。

随机挑取Sj50和Sj16阳性克隆分别加入含100μg/ml氨苄青霉素的2XYT液体培养基5ml，37℃ 300rpm扩增培养过夜。用Mini-MTM Plasmid DNA ExtractionSystem抽提并纯化质粒。对所抽质粒进行EcoR I和Xho I酶切鉴定。

结果：用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System从大肠杆菌中抽提并纯化质粒。对所抽质粒进行EcoR I和Xho I酶切鉴定。结果显示各有二条明显的条带(质粒与目的基因)。

3.Sj16和Sj50重组基因在大肠杆菌中的表达

通过钙转法将以上抽提的pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16重组质粒转化入大肠杆菌BL21。内含50μl BL21钙转感受肽细胞的1.5ml Eppendorf管中加入重组质粒2μl，冰浴30min后，37℃热休克5min，立即冰浴2min。每管加入预温至37℃的LB培液，37℃ 300rpm培养1hr后，取100μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37℃培养过夜。

随机挑取Sj16和Sj50阳性克隆接种于3ml含100μg/ml苄青霉素的2XYT液体培养基，37℃摇至OD600＝0.6。取2ml加入IPTG至终浓度1mM，1ml不加诱导物作为对照，28℃ 250rpm，培养4hour。4℃ 4000g离心10min沉淀菌体。诱导管每管加入100μl PBS，对照管每管加入50μl PBS。每管取出15μl菌体加入3μl 6×SDS-PAGE样品缓冲液2μl作SDS-PAGE电泳，浓缩胶4％，分离胶12％。电泳条件：浓缩胶80V，分离胶100V。电泳结束胶于考氏亮蓝R250染液中固定、染色，在乙醇-冰醋酸液中脱色。

结果：pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16转化的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后，较诱导前各出现一分子量约为80kDa和40kDa的条带，即为Sj50基因产物与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合体、Sj16基因产物与GST的融合体(图1)。

应用抗GST抗体，通过亲和层析，纯化GST-SjP50和GST-SjE16蛋白。用凝血酶(thrombin)酶切GST连接的蛋白。12％SDS-PAGE胶分析。结果如图2所示：1、GST-SjP50融合蛋白；2、酶切不完全GST-SjP50融合蛋白；3、酶切后的GST-SjP50融合蛋白；4、GST-SjE16融合蛋白；5、酶切不完全GST-SjE16融合蛋白；6、酶切后的GST-SjE16融合蛋白。

然后，分别用抗SjP50和SjE16抗体通过亲和层析，纯化SjP50和SjE16蛋白以取得纯化蛋白抗原。

实施例3

RT-PCR鉴定SjE16、SjP50在日本血吸虫发育各阶段的转录表达情况。

1.样品准备

准备日本血吸虫的卵、尾蚴、雄虫、雌虫，以抽提其RNA。

2.总RNA抽提试剂盒

抽提RNA试剂采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，该试剂基于酸性酚一步抽提法生产。用于抽提RNA所用器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶环境。

3.RNA抽提步骤

将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后液体转入无RNA酶离管中，加入氯仿后，4℃离分层；将上层水相转入一无RNA酶离管中，加入氯仿后，4℃离分层；将上层水相转入一无RNA酶离管中，加异丙醇，4℃离沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶去离子水溶解沉淀。抽提RNA质量鉴定：紫外分光光度计测定260/20比值(比值均在1.7~2.0)；并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。

4.cDNA合成

取总RNA2μg，OligodT16 1μL，70℃保温3min，立即冰上变性5min。加入5×buffer，DTT和50mg/LdNTP各2μL及1μL逆转录酶，充分混匀后，42℃2h。模板使用终浓度通常为1μg/100μL。

以β-actin作内对照，PCR反应混合物中各成分为：β-actin、Sj50-F、Sj50-R、Sj16-F、Sj16-R、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分别为0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后补充ddH2O使反应体系为10μL。PCR反应条件94℃变性5min；然后每个循环94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。

实验结果显示，SjE16仅在日本血吸虫的虫卵中表达，而SjP50在雄虫、雌虫中表达(图3)。

实施例4

抗日本血吸虫感染保护性实验。

该实施例的动物实验方法步骤如下：

1.抗原免疫动物

动物：C57小鼠，6-8星期。

免疫次数和部位：3次免疫(2周/次间隔)，背部皮下多点。

免疫剂量：福氏佐剂(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只

SjE16/福氏佐剂(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只

SjP50/福氏佐剂(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只

SjE16+SjP50/福氏佐剂(Freund’s Complete Adjuvant)100ul/只。

2.血吸虫感染小鼠

攻击感染时间：第三次免疫7天进行日本血吸虫尾蚴攻击感染，另外一组动物体外细胞免疫实验。

腹部皮肤感染：40±2尾蚴/小鼠。

血吸虫鉴定：42天解剖小鼠，收集肝门静脉和肠系膜静脉处成虫并计数。

血吸虫虫卵鉴定：肝脏称重后剪碎，5％KOH消化过夜，并计数。

体外细胞免疫实验：取小鼠脾脏，分离脾脏单个核细胞，备用。

3.细胞免疫实验

细胞培养：小鼠(n＝4)脾脏细胞。5×105细胞/ml/RPMI 1640/10％FCS

血吸虫抗原：抗原SjE16 100ng/ml，抗原SjP50 100ng/ml，

细菌抗原：金黄色葡萄球菌enterotoxin B(SFB)100，30，10，3ng/ml，

凝血素：ConA 0.1ug/ml，

细胞培养条件：37CO，5％CO2，72小时。

细胞增殖反应测定：(3H)Thymidine DNA参入，培养6小时。Beta-液闪计数。

日本血吸虫抗原SjE16、抗原SjP50免疫小鼠，激发宿主抗日本血吸虫感染免疫反应，实验结果表明(见表1)：

1.SjE16抗原免疫小鼠，可以一定程度激发宿主抗血吸虫免疫反应，但是，仅仅小鼠体内的成虫数有所下降，而肝脏内虫卵数下降不多。

2.SjP50抗原免疫小鼠，可以激发一定程度的宿主抗血吸虫免疫反应，小鼠体内的成虫数有所下降，肝脏内虫卵数也有下降。

3.SjE16、SjP50抗原联合免疫小鼠，两个抗原有协同作用，小鼠体内的成虫数大幅下降，肝脏内虫卵数下降。

4.SjE16、SjP50单独和联合免疫小鼠，粪便虫卵数有显著下降。

表1.SjE16和SjP50抗原激发宿主抗日本血吸虫免疫反应

实施例5

该实施例的动物实验方法同实施例4所述的步骤，将抗原SjE16、抗原SjP50联合免疫，可以诱导宿主对非血吸虫抗原刺激无反应(Anergy)，而两个抗原分别免疫，不能诱导这一反应。抗原SjE16和抗原SjP50联合免疫，可诱导血吸虫特异抗原细胞免疫反应(见图4)，同时，抗原SjE16和抗原SjP50联合免疫，可以诱导宿主对金黄色葡萄球菌抗原(SEB)刺激无反应(图5)，且日本血吸虫感染或抗原SjE16和抗原SjP50联合免疫能引起宿主对凝集素(ConA)的刺激无反应(图6)。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>日本血吸虫抗原基因的克隆、表达和疫苗

<130>NP-10013

<160>4

<210>1

<211>438

<212>DNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<220>

<221>CDS

<223>(1)..(435)

<400>1

atg tcg gat gaa aac cga tgg att gca gtt ttt aat tca cta gat aaa       48

Met Ser Asp Glu Asn Arg Trp Ile Ala Val Phe Asn Ser Leu Asp Lys

1               5                   10                  15

gat gga aat aag tta tta aca cgt gat gaa att gag caa tgc ttg aaa       96

Asp Gly Asn Lys Leu Leu Thr Arg Asp Glu Ile Glu Gln Cys Leu Lys

            20                  25                  30

agt ctt ggc gtt tct gaa agt ttt gcc gaa aag ata atc aag gaa act      144

Ser Leu Gly Val Ser Glu Ser Phe Ala Glu Lys Ile Ile Lys Glu Thr

        35                  40                  45

gac ttg aat aaa gat gga aaa atc tct ttg gat gaa tac ctg aaa gca      192

Asp Leu Asn Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Asp Glu Tyr Leu Lys Ala

    50                  55                  60

cta aga aaa atc cct cca cgt gac aaa tgt tca agt gtt gaa cgt tgg      240

Leu Arg Lys Ile Pro Pro Arg Asp Lys Cys Ser Ser Val Glu Arg Trp

65                  70                     75                  80

aaa gaa gta ttt caa tcc ata gat aaa gat aat tca ggc aaa gtt tct      288

Lys Glu Val Phe Gln Ser Ile Asp Lys Asp Asn Ser Gly Lys Val Ser

                85                  90                  95

gct aaa gaa ctg gac gaa ttt ttg aaa tca act ggt aat gat ata aac      336

Ala Lys Glu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Ser Thr Gly Asn Asp Ile Asn

            100                 105                 110

aaa agc tgt ttg gaa aat tgg atg gct aca aat gac aaa aac aag gat      384

Lys Ser Cys Leu Glu Asn Trp Met Ala Thr Asn Asp Lys Asn Lys Asp

        115                 120                 125

ggt gaa cta gat tat gcc gaa ttt tta gct tat gta cgt caa acg tat      432

Gly Glu Leu Asp Tyr Ala Glu Phe Leu Ala Tyr Val Arg Gln Thr Tyr

    130                 135                 140

gaa taa                                                              438

Glu

145

<210>2

<211>145

<212>PRT

<213>日本血吸虫 (Schistosoma japonicum)

<400>2

MSDENRWIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQC LKSLGVSESF AEKIIKETDL     50

NKDGKISLDE YLKALRKIPP RDKCSSVERW KEVFQSIDKD NSGKVSAKEL     100

DEFLKSTGND INKSCLENWM ATNDKNKDGE LDYAEFLAYV RQTYE          145

<210>3

<211>1413

<212>DNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<220>

<221>CDS

<223>(12)..(1286)

<400>3

acgcagttga c atg tcg gag acg cca aag cag tct gaa gag gaa tat cta      50

             Met Ser Glu Thr Pro Lys Gln Ser Glu Glu Glu Tyr Leu

              1               5                   10

aaa gat ttc ata gac tta agc cca tct ggt gat cgt ggt att ctc aag       98

Lys Asp Phe Ile Asp Leu Ser Pro Ser Gly Asp Arg Gly Ile Leu Lys

     15                  20                  25

aaa gta gta cga gaa ggc tac tcg gac atc aaa cca tgc gat ggt gac      146

Lys Val Val Arg Glu Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Cys Asp Gly Asp

 30                  35                  40                  45

acg gtc ata gta cat tat gtc ggt act aac ttc ggt ggt gaa aag cat      194

Thr Val Ile Val His Tyr Val Gly Thr Asn Phe Gly Gly Glu Lys His

                50                  55                  60

ggt gaa gta ttc gac tca agc aga gcc cga aat gaa aag ttt gaa ttt      242

Gly Glu Val Phe Asp Ser Ser Arg Ala Arg Asn Glu Lys Phe Glu Phe

            65                  70                  75

aca att ggg aaa ggt agt gta att aaa gct tgg gat atc ggt gtt gca      290

Thr Ile Gly Lys Gly Ser Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala

        80                  85                  90

act atg agg ttg gga gaa gtt tgt gaa ttg atc gcg tcg cct gaa tat      338

Thr Met Arg Leu Gly Glu Val Cys Glu Leu Ile Ala Ser Pro Glu Tyr

    95                  100                 105

gcg tac atg gat ggg aaa tct ctt aag ttt gag gtg gag ctt ttt gaa      386

Ala Tyr Met Asp Gly Lys Ser Leu Lys Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu

110                 115                 120                 125

act atg ggc tct gat gtc agc aga aac aaa gat ggg agt att cgc aag      434

Thr Met Gly Ser Asp Val Ser Arg Asn Lys Asp Gly Ser Ile Arg Lys

                130                 135                 140

tca att att aaa aag gga aga gat atc cac aat cct gta gct ggg gct      482

Ser Ile Ile Lys Lys Gly Arg Asp Ile His Asn Pro Val Ala Gly Ala

            145                 150                 155

gaa gcc act att gtt ttc cgc aat ctt ttg aac ttg acg gag gaa aca      530

Glu Ala Thr Ile Val Phe Arg Asn Leu Leu Asn Leu Thr Glu Glu Thr

        160                 165                 170

gaa gtc aca tat tgt gtt ggc gac cct cca tca aac gta ccg gat gag      578

Glu Val Thr Tyr Cys Val Gly Asp Pro Pro Ser Asn Val Pro Asp Glu

    175                 180                 185

ttg gac caa tct gtt cgt cac atg aat aca ggt gaa gtc agc cgt att      626

Leu Asp Gln Ser Val Arg His Met Asn Thr Gly Glu Val Ser Arg Ile

190                 195                 200                 205

gtg gtt tac aaa gac ggt cat tca tta act tct gga gat tcg gat aaa      674

Val Val Tyr Lys Asp Gly His Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Lys

                210                 215                 220

gat aga ata gtt tac gaa cta aca ctg aag tct ttt gaa aag acc aaa      722

Asp Arg Ile Val Tyr Glu Leu Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Thr Lys

            225                 230                 235

cac ctc tct ggt att acg tct ttt cca gag cga ata gcc tat gca aat      770

His Leu Ser Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu Arg Ile Ala Tyr Ala Asn

        240                 245                 250

aca ctt aaa gag aag gcc aac aat ttc tta aag gat tct aaa ttt gat      818

Thr Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asn Phe Leu Lys Asp Ser Lys Phe Asp

    255                 260                 265

tca gct atc gaa tta tat aaa cgt ttg gac gat gag ctg cag tac gta       866

Ser Ala Ile Glu Leu Tyr Lys Arg Leu Asp Asp Glu Leu Gln Tyr Val

270                 275                 280                 285

gtg gct aat ggg cct acc aga caa agg aat tgt ctg ggg ttc act gta       914

Val Ala Asn Gly Pro Thr Arg Gln Arg Asn Cys Leu Gly Phe Thr Val

                290                 295                 300

gct gtc caa ctc aat tta gct ctg gtc tat ctg aag ctt tgt aaa ccc       962

Ala Val Gln Leu Asn Leu Ala Leu Val Tyr Leu Lys Leu Cys Lys Pro

            305                 310                 315

aga caa tgt att gag ttt tgc aag aaa gtg ctc gat aat ttt agc gac       1010

Arg Gln Cys Ile Glu Phe Cys Lys Lys Val Leu Asp Asn Phe Ser Asp

        320                 325                 330

aac gaa aag gcg cta ttt aga att ggt cag gca cat tta cta cgt aag       1058

Asn Glu Lys Ala Leu Phe Arg Ile Gly Gln Ala His Leu Leu Arg Lys

    335                 340                 345

gac cat gaa gaa gca gtt gtt tac ttc aaa gga ttg tat cca aaa atc       1106

Asp His Glu Glu Ala Val Val Tyr Phe Lys Gly Leu Tyr Pro Lys Ile

350                 355                 360                 365

cta aca atg cat ctg ctg tat aac agg ttc aaa tct gtg agg aag aga       1154

Leu Thr Met His Leu Leu Tyr Asn Arg Phe Lys Ser Val Arg Lys Arg

                370                 375                 380

tta gaa gag cca aaa gat ata gaa cga aag aag ttt cgt cat att ttc       1202

Leu Glu Glu Pro Lys Asp Ile Glu Arg Lys Lys Phe Arg His Ile Phe

            385                 390                 395

gaa cgt tgt aaa gac acc ggg att aaa ctc gat gct caa aat cat gag       1250

Glu Arg Cys Lys Asp Thr Gly Ile Lys Leu Asp Ala Gln Asn His Glu

        400                 405                 410

gat ggg gtt gta gtg aat gat gaa aag tct gcc ctg tgagagctta            1296

Asp Gly Val Val Val Asn Asp Glu Lys Ser Ala Leu

    415                    420                 425

attctgtgtg tggcatgaag ttagcacccc cgtgattttg taaatgtttc ttataattac  1356

tggtttaatt tcaagttgct gaatacattt taaagcaacc aaaaaaaaaa aaaaaaa     1413

<210>4

<211>425

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>4

MSETPKQSEE EYLKDFIDLS PSGDRGILKK VVREGYSDIK PCDGDTVIVH     50

YVGTNFGGEK HGEVFDSSRA RNEKFEFTIG KGSVIKAWDI GVATMRLGEV     100

CELIASPEYA YMDGKSLKFE VELFETMGSD VSRNKDGSIR KSIIKKGRDI     150

HNPVAGAEAT IVFRNLLNLT EETEVTYCVG DPPSNVPDEL DQSVRHMNTG     200

EVSRIVVYKD GHSLTSGDSD KDRIVYELTL KSFEKTKHLS GITSFPERIA     250

YANTLKEKAN NFLKDSKFDS AIELYKRLDD ELQYVVANGP TRQRNCLGFT     300

VAVQLNLALV YLKLCKPRQC IEFCKKVLDN FSDNEKALFR IGQAHLLRKD     350

HEEAVVYFKG LYPKILTMHL LYNRFKSVRK RLEEPKDIER KKFRHIFERC     400

KDTGIKLDAQ NHEDGVVVND EKSAL                                425