尿激酶催化结构域突变体的表达、纯化以及结晶

技术领域：

本发明涉及医药、生物技术、结构生物学领域。

背景技术：

尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶，在一系列生理和病理过程中担负着重要调节功能，如：纤溶酶原的激活、炎症细胞的迁移、创伤的治疗和重塑、滋养层细胞的生长等。近几年，有关尿激酶生理活性的研究主要集中在与癌症转移方面。研究表明：大多与上皮有关的癌细胞能产生尿激酶并把它运输到细胞表面，从而引发一系列的蛋白水解反应，造成癌细胞的侵染和扩散，使用尿激酶抑制剂抑制尿激酶活性已被公认为是一种抑制肿瘤细胞侵袭和转移，进而达到控制和治疗肿瘤之目的的有效方法，因此寻找尿激酶抑制剂，将有重大的临床意义。在生理条件下尿激酶活性调控主要由四类抑制剂来完成，它们分别是来源于内皮细胞的PAI-1，来源于胎盘细胞或巨噬细胞的PAI-2，来源于尿液的PAI-3，另外还有一种是来自蛋白酶-连接蛋白家族的PAI-4。有的一些人工合成的抑制剂如氨基吡咯嘧啶、4-苯噻吩-2-羧基脒类等能抑制尿激酶的活性。尽管对尿激酶抑制剂的研究已经取得了一些成就，但是关于尿激酶与抑制剂之间的相互作用的机制仍然不甚清楚。此外，作为抗肿瘤转移药物的理想尿激酶抑制剂在抑制尿激酶时应该不影响t-PA和纤溶酶的活性，而天然的尿激酶抑制剂如PAI-1和PAI-2等在抑制尿激酶的同时也强烈抑制了t-PA的活性，故不适于作为抗肿瘤转移药物。可见，利用尿激酶结构研究对尿激酶抑制剂的设计、开发是有待进一步深入研究的项目。

发明内容：

本申请提供了一套完善的尿激酶在巴斯德毕氏酵母体系中表达、纯化、活性测定以及体外蛋白结晶的技术方法。表达的重组蛋白具有有活性，成本低，稳定性高，表达量高等特点。

本项发明的内容之一是无需激活的尿激酶催化结构域的设计和表达。人尿激酶催化结构域为158-411氨基酸肽段，突变点为C279A、N302Q。编码此肽段的基因是通过以全长尿激酶为模板重叠延伸定点突变的PCR方法获得。扩增出来的突变基因克隆到巴斯德毕氏酵母表达载体，经抗生素高拷贝筛选，获得高效稳定表达尿激酶催化结构域突变体的酵母菌株；利用甲醇诱导可获得目的蛋白。

本项发明的内容之二是突变体蛋白的纯化及活性测定。用阳离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用凝胶层析柱分离纯化，可获得纯度达99％以上蛋白。活性测定可以采用如下两种方法：方法一，将蛋白点至含有纤维蛋白和纤溶酶原的平板，能够溶解纤维蛋白，形成溶圈现象。方法二，蛋白在一定缓冲溶液条件下可以水解尿激酶的多肽底物S-2444，产生黄色产物，使溶液由无色变为黄色。这些实验说明，本项申请设计的尿激酶突变体无须任何激活，即具有活性，可用于尿激酶抑制剂的高通量筛选。

本项发明的内容之三是尿激酶催化结构域突变体蛋白的结晶，为研发和改进尿激酶抑制剂提供一个崭新的研究平台。用水蒸气扩散法结晶蛋白，用X-ray射线单晶衍射仪温度100K衍射晶体，收集分辨率为1.45数据，确定为R3空间群，单胞参数为：a＝b＝120.48，c＝42.45，α＝β＝90.0°，γ＝120.0°。

附图说明：

图1  重叠延伸定点突变PCR全过程示意图：其中图中数字表示为①起始引物(正向)：5’-CCGCTCGAGAAAAGAATTATTGGGGGAGAATTCAC-3’；②末端引物(反向)：5’-CCGCTCGAGTTATTCCTTGGTGTGACTGC-3’；③突变点(C279A)引物(正向)：5’-GACCATCGCCCTGCCCTC-3’；④突变点(N302Q)引物(反向)：5’-GTCGGTAGATTGCTCTTTTCCAA-3’；

图2  重组蛋白经凝胶层析柱Superdex 75的洗脱以及收集峰处蛋白跑SDS-PAGE电泳检验结果图；

图3  琼脂-纤维平板法测定蛋白活性的实验图，图中所示的1为水和1ul纤溶酶原混合物，2表示2ul表达蛋白和1ul纤溶酶原混合物，3、4表示11表达蛋白和1ul纤溶酶原混合物点于板上。

图4蛋白晶体图

具体实施方式：

实施例一  表达目的基因的扩增

1、申请人设计并由引物合成公司合成如下PCR引物：

①起始引物(正向)：

5’-CCGCTCGAGAAAAGAATTATTGGGGGAGAATTCAC-3’；

②末端引物(反向)：5’-CCGCTCGAGTTATTCCTTGGTGTGACTGC-3’；

③突变点(C279A)引物(正向)：5’-GACCATCGCCCTGCCCTC-3’；

④突变点(N302Q)引物(反向)：5’-GTCGGTAGATTGCTCTTTTCCAA-3’；

注明：其中①②引物中的下划线表示限制性内切酶Xho I酶切位点；③④引物中下划线表示突变氨基酸的位点。

2、重叠延伸PCR方法扩增和定点突变尿激酶催化结构域(C279A/N302Q)(图

1)：以尿激酶的全长基因作为模板，以③④为引物，进行第一轮PCR，PCR条件为：94℃，2分钟；94℃，50秒，50℃，45秒。72℃，20秒，5个循环后；94℃，50秒，59℃，45秒，72℃，20秒，20个循环后；72℃，10分钟，胶回收PCR产物，作为大引物。以尿激酶的全长基因作为模板，以大引物、①为引物，进行第二轮PCR，PCR条件为：94℃，2分钟；94℃，45秒，47℃，45秒。72℃，40秒，5个循环后；94℃，45秒，59℃，45秒，72℃，40秒，20个循环后，72℃，10分钟；同时大引物、②为引物的PCR也以同样条件进行。两个PCR产物经1.0％琼脂糖胶电泳回收，混合作为第三轮PCR的模板、以①、②为引物，PCR扩增，PCR条件为：94℃，2分钟；94℃，45秒，70℃，2分钟，25个循环后，72℃，10分钟。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳，回收约750bp片段。琼脂糖回收的具体步骤如下：50μl PCR反应物与6μl加样缓冲液、6μl染色液混合，室温放置1分钟，用电压72V，电泳约45分钟，将与理论长度相同的条带，切割，放入无菌管中，加750μl QG缓冲液，50℃熔胶，溶液倒入Qiaquickspin柱，16000g离心30秒，弃上清，再离心一次，加30μl无菌水于柱中心，静置1分钟，16000g离心1分钟，收集清液，-20℃保存。

实施例二  目的基因的克隆

尿激酶催化结构域突变体的克隆：PCR回收产物，用限制性内切酶Xho I酶切过夜，乙醇沉淀回收；同样限制性内切酶Xho I酶切线性化毕赤酵母表达载体pPICZαA，去磷酸化，胶回收试剂盒回收线性化产物。PCR回收产物和去磷酸化的质粒pPICZαA混合，用T4 DNA连接酶，16℃过夜，65℃灭活5分钟；取1.5μl连接物与预冷的感受态细胞TOP10F’混合，2.5kV放电，电击，加入1毫升SOC溶液，37℃温育1小时，取200μl涂LB平板(25μg/ml Zeocin)，37℃，培养14小时，挑选菌落，培养，小量抽提重组质粒，酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆由DNA测序公司测序。

实施例三 突变体蛋白的表达、纯化

重组质粒在巴斯德毕氏酵母X-33中的表达、纯化：线性化重组质粒电转化酵母X-33菌株，涂100μg/ml Zeocin YPDS平板，挑菌落，抽提基因组，PCR鉴定。正确的重组子发酵表达，每天加入终浓度0.5％甲醇诱导，发酵4天的培养液，离心取上清，12％SDS-PAGE电泳检验分子量。表达量高的菌株扩大培养，甲醇诱导4天，上清稀释1倍体积过20mM pH6.5磷酸钾缓冲溶液预平衡的阳离子快速交换柱SPFF，20mM pH6.5磷酸钾缓冲溶液(含0.5M氯化钠)洗脱，收集峰处蛋白；SPFF纯化的蛋白用凝胶层析柱Superdex 75进一步分离，20mM pH6.5磷酸钾缓冲溶液(含0.15M氯化钠)洗脱，13.53mV处出现一个峰，收集峰蛋白，12％SDS-PAGE电泳检验，纯度达99％以上(图2)。

实施例四  突变体蛋白活性实验

琼脂-纤维平板检测活性：用10mM磷酸缓冲液配制含20mg/ml纤维蛋白的琼脂纤维平板，将10μ纯化的蛋白与10μl纤溶酶原混合，点琼脂-纤维平板，平板放置37℃，12小时后观察透明圈，粗略检测其活性(图3)。

S-2444发色底物检测活性：混合5μl蛋白、1μl发色底物(S-2444)，放置37℃，10min，以终浓度1M NaAc中止反应，酶标仪波长402mm测定吸收；实验过程中，用具有活性的尿激酶作为阳性对照，用无活性的尿激酶作为阴性对照，实验重复5次。

实施例五 突变体蛋白结晶实验

纯化后的突变体蛋白，经透析脱盐，浓缩至蛋白浓度约为12mg/ml，用坐滴汽相扩散法结晶蛋白，结晶使用的缓冲溶液为pH4.6 50mM柠檬酸钠-柠檬酸，沉淀剂是1.8M硫酸铵，添加剂为5％PEG400。长出的晶体(图4)用X-ray射线单晶衍射仪温度100K衍射，收集数据，分辨率达1.45，R3空间群，单胞参数为：a＝b＝120.48，c＝42.45，α＝β＝90.0°，γ＝120.0°。